豬瘟病毒和豬繁殖與呼吸綜合征病毒混合感染的PCR診斷

李淑玉

[摘 要] 2016年10月，某豬場發(fā)生以耳朵發(fā)紺、皮膚潮紅且有出血斑、呼吸困難、全身淋巴結(jié)腫大且有出血點(diǎn)、脾梗死等為主要特征的疫病，通過實(shí)驗(yàn)室PCR診斷確診為豬瘟病毒和豬繁殖與呼吸綜合征病毒混合感染。

[關(guān)鍵詞] 豬瘟病毒 豬繁殖與呼吸綜合征病毒 混合感染 PCR診斷

[中圖分類號] S858.28 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1003-1650（2017）03-0246-01

豬瘟（classical swine fever，CSFV）和豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome，PRRS）分別是由豬瘟病毒（classical swine fever virus，CSFV）和豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome virus，PRRSV）引起豬的二種病毒性傳染病，均是目前危害我國養(yǎng)豬業(yè)的重要傳染病，也是我國重點(diǎn)防疫的主要疫病[1]。2016年10月，某豬場發(fā)生了一起以發(fā)熱、食欲減退、精神萎靡、耳朵發(fā)紺、皮膚潮紅且有出血斑、呼吸困難、全身淋巴結(jié)腫大且有出血點(diǎn)、脾梗死等為主要特征的疫病。通過臨床特征初步判斷為疑似CSFV與PRRSV混合感染，為進(jìn)一步確定致病原，進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)室PCR診斷，現(xiàn)將PCR診斷過程介紹如下。

1 材料和方法

1.1 主要試劑 One Step RT-PCR Kit購自寶生物（大連）工程有限公司；病毒基因組RNA提取試劑盒購自北京百泰克生物技術(shù)有限公司。

1.2 病料樣品的采集與處理 采集病死豬的脾臟、腎臟、淋巴結(jié)等組織，將其與滅菌生理鹽水以1：5（質(zhì)量體積比）比例混合后，組織搗碎機(jī)搗碎、勻漿，離心取上清液即為處理后的病料樣品。

1.3 基因組RNA的提取 利用病毒基因組RNA提取試劑盒提取病料樣品的基因組RNA。

1.4 引物設(shè)計(jì)與合成

參照參考文獻(xiàn)[2]合成1對CSFV強(qiáng)毒株檢測引物（上游引物：5-ATCAGTCTCTGGAATTGTTGGCA-3；下游引物：5-CAAGCACGGATGAGGAATGCCG -3），該對引物可對CSFV強(qiáng)毒株擴(kuò)增出187 bp特異性條帶，對CSFV弱毒疫苗株無擴(kuò)增產(chǎn)物。參照參考文獻(xiàn)[3]合成1對PRRSV鑒別檢測引物（上游引物：5-CCCTCCACCAAGAGTTCAACC-3；下游引物：5-TTCAGTATATCCGAGATTCCA-3），該對引物可對高致病性PRRSV擴(kuò)增出459 bp特異性條帶，對PRRSV經(jīng)典毒株增出549 bp特異性條帶。

1.5 RT-PCR擴(kuò)增 分別利用CSFV、PRRSV檢測引物對病料樣品基因組RNA進(jìn)行一步法RT-PCR檢測。CSFV、PRRSV一步法RT-PCR擴(kuò)增體系均為：2×One Step Buffer 12.5?L、One Sep enzyme Mix 0.5μL，上、下游引物各0.5?L，RNA 5μL，H2O 6μL。CSFV一步法RT-PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?0℃ 30min，94℃ 5min，94℃ 30s、53℃ 30s、72℃ 30s、30個(gè)循環(huán)，72℃ 10min。PRRSV一步法RT-PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?0℃ 50min，94 ℃ 5min，94℃ 45s、56℃ 45s、72℃ 45s、30個(gè)循環(huán)，72℃ 10min。

1.6 RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果的檢測 取RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.5 %瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)有無特異性條帶以及條帶大小判定檢測結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

如圖1所示，CSFV強(qiáng)毒株檢測引物擴(kuò)增出1條約189 bp特異性條帶，與預(yù)期CSFV強(qiáng)毒株擴(kuò)增片段大小相符；PRRSV鑒別檢測引物擴(kuò)增出1條約459 bp特異性條帶，與預(yù)期高致病性PRRSV擴(kuò)增片段大小相符。表明此次疫病主要由CSFV強(qiáng)毒株和高致病性PRRSV混合感染所致。

3 討論

PRRS是豬的一種重要免疫抑制病，可導(dǎo)致豬群免疫力和抗病力下降，進(jìn)而混合感染其它致病原，導(dǎo)致病情加重，且增加臨床診斷難度。PCR檢測作為一種核苷酸體外快速擴(kuò)增技術(shù)，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡單等特點(diǎn)，是目前動(dòng)物疫病廣泛使用的診斷方法。本病例在常規(guī)PCR技術(shù)的基礎(chǔ)上，采用了近幾年才商品化的One Step RT-PCR Kit，使反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)與PCR擴(kuò)增反應(yīng)一步完成，雖然使用商品化試劑盒提高了檢測成本，但也大大節(jié)省了檢測時(shí)間和操作步驟，降低了污染概率，也使檢測結(jié)果更加準(zhǔn)確、可靠。本病例通過一步法RT-PCR擴(kuò)增方法確診致病原為CSFV和PRRSV混合感染，為養(yǎng)殖場采取治療措施贏得了時(shí)間，養(yǎng)殖場雖然通過采取隔離飼養(yǎng)、消毒、疫苗免疫接種等系列措施迅速控制了疫情，將經(jīng)濟(jì)損失降至了最低，但筆者仍建議養(yǎng)殖單位平時(shí)要做好CSF、PRRS等常見疫病的疫苗免疫和抗體監(jiān)測工作，確保疫苗免疫效果，保持豬群有整體的、較高的免疫抗體水平，避免免疫失敗，做到從源頭上預(yù)防和控制CSF、PRRS等主要疫病。

參考文獻(xiàn)

[1]楊凡，呂文婷，許思遙，等. 2014-2016年四川省豬瘟、豬繁殖與呼吸綜合征病毒的血清學(xué)調(diào)查[J].豬業(yè)科學(xué)，2017，34（1）：106-109.

[2]郭抗抗，鄧力，井勇，等. 豬瘟病毒強(qiáng)毒株和兔化弱毒疫苗株RT-PCR快速鑒別檢測方法的建立[J]. 西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2010，38（6）：13-18.

[3]王維忠. 豬繁殖與呼吸綜合征病毒經(jīng)典株與變異株RT- PCR鑒別診斷方法的建立及應(yīng)用[J]. 中國畜牧獸醫(yī)，2012，39（8）：76-79.