手性流動(dòng)相添加劑-超高效液相色譜法拆分頭孢噻吩對(duì)映體

孫 鵬, 高玉玲, 王金梅, 劉秀娟

(1. 黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué) 測(cè)試中心, 大慶 163319; 2. 農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)加工品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心, 大慶 163319; 3. 大慶石化公司質(zhì)量檢驗(yàn)中心, 大慶 163711)

手性流動(dòng)相添加劑-超高效液相色譜法拆分頭孢噻吩對(duì)映體

孫 鵬1,2, 高玉玲1,2, 王金梅3, 劉秀娟3

(1. 黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué) 測(cè)試中心, 大慶 163319; 2. 農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)加工品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心, 大慶 163319; 3. 大慶石化公司質(zhì)量檢驗(yàn)中心, 大慶 163711)

在流動(dòng)相中加入手性選擇劑羥丙基-β-環(huán)糊精(HP-β-CD)實(shí)現(xiàn)了用超高效液相色譜法拆分頭孢噻吩對(duì)映體。所用色譜柱為Agilent Poroshell 120 SB-C18色譜柱(2.1 mm×100 mm,2.7 μm);流動(dòng)相為乙腈與pH 7.2的12.0 mmol·L-1羥丙基-β-環(huán)糊精溶液以體積比80∶20組成的混合液;流量為0.25 mL·min-1。在所選條件下頭孢噻吩的對(duì)映體獲得基線分離,連續(xù)測(cè)定6次的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差不大于2.3%。

超高效液相色譜法; 頭孢噻吩; 對(duì)映體; 手性流動(dòng)相添加劑

頭孢類(lèi)抗生素被稱(chēng)為先鋒菌素類(lèi),其化學(xué)結(jié)構(gòu)為在頭孢菌素的母核上通過(guò)化學(xué)方法連接不同的側(cè)鏈基團(tuán)而制得的半合成β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素[1]。頭孢類(lèi)抗菌藥物以其抗菌譜廣、殺菌活力強(qiáng)、耐酸、耐酶、療效高、毒副作用相對(duì)較小等優(yōu)點(diǎn)而廣泛應(yīng)用于臨床[2-4],為人類(lèi)戰(zhàn)勝各種細(xì)菌感染作出了極大貢獻(xiàn)。

頭孢噻吩為第二代頭孢菌素,可用于治療敏感菌所致的尿路感染、呼吸道感染、腹膜炎、敗血癥、心內(nèi)膜炎、皮膚和軟組織感染等[5]。有關(guān)頭孢菌素類(lèi)手性藥物對(duì)映體的分離方法有高效液相色譜法[6-7]、高效毛細(xì)管電泳法[8],但已報(bào)道的分離方法分離時(shí)間長(zhǎng),對(duì)分離條件要求苛刻。因此,研究一種快速分離頭孢類(lèi)對(duì)映體的方法,為此類(lèi)手性藥物臨床安全提供參考非常必要。本工作采用手性流動(dòng)相添加劑-超高效液相色譜法拆分頭孢噻吩對(duì)映體,方法簡(jiǎn)便、快速,而且對(duì)了解它們的藥理作用、藥效以及在臨床研究上都具有重要的理論和實(shí)際意義。

1 試驗(yàn)部分

1．1 儀器與試劑

Agilent 1290型超高效液相色譜儀,配G4226A型自動(dòng)進(jìn)樣器、G4212A型二極管陣列檢測(cè)器(DAD)、G4220A型二元泵、1290保護(hù)柱、C.01.05版本Open LAB CDS軟件;SK 8200H型超聲波清洗機(jī);VORTEX-2型渦旋儀;ML 204型電子分析天平;PE-20型pH計(jì);0.22 μm微孔濾膜。

頭孢噻吩溶液:2 g·L-1,稱(chēng)取頭孢噻吩(純度為95%以上) 0.2 g,用流動(dòng)相定容至100 mL。

羥丙基-β-環(huán)糊精溶液(水相):12.0 mmol·L-1,稱(chēng)取羥丙基-β-環(huán)糊精(HP-β-CD) 2.83 g,用水定容至100 mL,用0.01 mol·L-1氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH為7.2,過(guò)0.22 μm水相微孔濾膜。

有機(jī)相:乙腈過(guò)0.22 μm有機(jī)相微孔濾膜,備用。

甲醇、乙腈均為色譜純,氫氧化鈉為優(yōu)級(jí)純,試驗(yàn)用水為蒸餾水。

1．2 色譜條件

Agilent Poroshell 120 SB-C18色譜柱(2.1 mm×100 mm,2.7 μm),柱溫為室溫;流動(dòng)相為乙腈與pH 7.2的12.0 mmol·L-1HP-β-CD溶液以體積比80∶20組成的混合液,流量0.25 mL·min-1;進(jìn)量樣10 μL;紫外檢測(cè)波長(zhǎng)230 nm。

1．3 試驗(yàn)方法

按色譜條件對(duì)頭孢噻吩溶液進(jìn)行分離。

2 結(jié)果與討論

2．1 色譜行為

頭孢噻吩對(duì)映體分離色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 頭孢噻吩對(duì)映體分離色譜圖Fig. 1 Separation chromatogram of cephalothin enantiomers

2．2 色譜柱的選擇

試驗(yàn)考察了Agilent Poroshell 120 SB-C18色譜柱(2.1 mm×100 mm,2.7 μm)和Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18色譜柱(2.1 mm×150 mm,1.8 μm)對(duì)分離的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn):XDB-C18色譜柱對(duì)頭孢噻吩對(duì)映體無(wú)法達(dá)到基線分離,SB-C18色譜柱為未封端柱,XDB-C18色譜柱為封端柱,這是因?yàn)镾B-C18色譜柱中裸露的硅羥基增加了對(duì)頭孢噻吩對(duì)映體的手性識(shí)別作用,實(shí)現(xiàn)了更好的分離。試驗(yàn)選用Agilent Poroshell 120 SB-C18色譜柱(2.1 mm×100 mm,2.7 μm)。

2．3 手性選擇劑種類(lèi)及濃度的選擇

試驗(yàn)分別考察了β-環(huán)糊精(β-CD)及HP-β-CD對(duì)分離效果的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn):β-CD對(duì)頭孢噻吩對(duì)映體有手性識(shí)別,但不能達(dá)到基線分離,HP-β-CD能使頭孢噻吩對(duì)映體得到很好的分離。這是因?yàn)镠P-β-CD與頭孢噻吩對(duì)映體形成新的氫鍵,增強(qiáng)了HP-β-CD與頭孢噻吩對(duì)映體之間的作用,進(jìn)而增加了HP-β-CD與頭孢噻吩對(duì)映體的手形識(shí)別能力。試驗(yàn)選擇HP-β-CD為手性選擇劑。

試驗(yàn)考察了HP-β-CD的濃度為6～18 mmol·L-1時(shí)對(duì)分離的影響,結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 HP-β-CD濃度對(duì)分離度的影響Fig. 2 Effect of HP-β-CD concentration on resolution

由圖2可知:隨HP-β-CD濃度的增大,頭孢噻吩對(duì)映體的分離度逐漸增加,當(dāng)HP-β-CD的濃度為12.0 mmol·L-1時(shí),頭孢噻吩對(duì)映體的分離度最大。試驗(yàn)選擇HP-β-CD的濃度為12.0 mmol·L-1。

2．4 流動(dòng)相組成的選擇

流動(dòng)相比例是影響對(duì)映體分離的又一重要因素。試驗(yàn)考察了頭孢噻吩對(duì)映體分別在甲醇-HP-β-CD溶液體系和乙腈-HP-β-CD溶液體系對(duì)分離的影響。結(jié)果表明:在甲醇-HP-β-CD溶液體系中,改變流動(dòng)相的比例,均不能得到很好的分離,故試驗(yàn)選擇乙腈-HP-β-CD溶液體系為流動(dòng)相。試驗(yàn)還考察了乙腈和12.0 mmol·L-1HP-β-CD溶液的體積比不同時(shí)對(duì)分離的影響。結(jié)果表明:當(dāng)乙腈和12.0 mmol·L-1HP-β-CD溶液的體積比為80∶20時(shí),頭孢噻吩對(duì)映體獲得基線分離。試驗(yàn)選擇乙腈和12.0 mmol·L-1HP-β-CD溶液的體積比為80∶20。

2．5 流量的選擇

試驗(yàn)考察了流量對(duì)頭孢噻吩對(duì)映體分離的影響。結(jié)果表明:流量減慢延長(zhǎng)了頭孢噻吩對(duì)映體與固定相相互作用的時(shí)間,可提高分子選擇能力,會(huì)適當(dāng)?shù)卦龃蠓蛛x度,但流量減慢也會(huì)使峰展寬、保留時(shí)間延長(zhǎng)。兼顧色譜峰形及分離度,試驗(yàn)選擇流動(dòng)相流量為0.25 mL·min-1。

2．6 水相酸度的選擇

水相酸度是影響對(duì)映體分離的又一重要因素。試驗(yàn)分別考察了水相pH為3.0,7.0,10.0時(shí)色譜峰形及保留時(shí)間,兼顧色譜峰形及保留時(shí)間,試驗(yàn)初步確定pH在7.0附近。試驗(yàn)考察了水相pH在6.4～8.0內(nèi)對(duì)分離的影響。結(jié)果表明:頭孢噻吩對(duì)映體在pH 7.2時(shí),色譜峰形及保留時(shí)間均滿(mǎn)意。試驗(yàn)選擇水相pH為7.2。

2．7 方法的重現(xiàn)性

按色譜條件分離頭孢噻吩對(duì)映體,連續(xù)進(jìn)樣6次,頭孢噻吩對(duì)映體的保留時(shí)間和峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)依次為2.0%,2.3%,說(shuō)明該方法的重現(xiàn)性良好。

本工作采用HP-β-CD為手性流動(dòng)相添加劑結(jié)合超高效液相色譜法拆分頭孢噻吩對(duì)映體,操作簡(jiǎn)單、靈敏度高,1 min內(nèi)完成對(duì)映體的分離,且比手性固定相分離經(jīng)濟(jì)、快捷、安全,為頭孢類(lèi)對(duì)映體的分離提供了有效的參考。

[1] 姚曄,鄧寧,余沐洋.膠束電動(dòng)毛細(xì)管電泳法分離檢測(cè)5種β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素[J].食品科學(xué), 2011,32(16):253-256．

[2] 侯力慧.痰熱清注射液聯(lián)合頭孢菌素治療慢性支氣管炎的臨床療效觀察[J].中國(guó)醫(yī)藥科學(xué), 2015,5(7):93-95．

[3] 項(xiàng)婕,朱長(zhǎng)遠(yuǎn).硫酸依替米星與頭孢菌素聯(lián)合治療老年社區(qū)獲得性肺炎的療效評(píng)價(jià)[J].藥物與臨床, 2015,53(2):73-75．

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[8] 王榮,賈正平,徐麗婷,等.頭孢噻吩手性對(duì)映體高效毛細(xì)管電泳分離[J].分析化學(xué), 2003,31(6):766-766．

UHPLC Separation of Cephalothin Enantiomers with Chiral Mobile Phase Additives

SUN Peng1,2, GAO Yu-ling1,2, WANG Jin-mei3, LIU Xiu-juan3

(1.TestingCentre,HeilongjiangBayiAgriculturalUniversity,Daqing163319,China;2.TestCenterofQualitySupervisionandInspectionofProcessedAgriculmralProductsinDepartmentofAgriculture,Daqing163319,China;
3.InspectionCenterofDaqingPetrochemicalCompany,Daqing163711,China)

Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (HP-β-CD) was chosen as a chiral selector to be added to the mobile phase to achieve separation of enantiomers of cephalothin by UHPLC. Agilent Poroshell 120 SB-C18(2.1 mm×100 mm, 2.7 μm) chromatographic column was used as stationary phase. A mixture of acetonitrile and 12.0 mmol·L-1HP-β-CD solution (pH 7.2), mixed in the ratio of 80 to 20, was used as mobile phase with a flow rate of 0.25 mL·min-1. Under the chosen conditions, good baseline separation of the enantiomers of cephalothin was attained, and giving values of RSD′s obtained from 6 successive determinations no more than 2.3%.

UHPLC; Cephalothin; Enantiomer; Chiral mobile phase additives

10.11973/lhjy-hx201702010

2016-02-01

大慶市科技計(jì)劃指導(dǎo)項(xiàng)目(szdfy-2015-50);黑龍江 八一農(nóng)墾大學(xué)校內(nèi)培育課題(XZR2014-17)

孫 鵬(1982-),男,黑龍江海林人,助理研究員,碩 士,主要從事手性藥物分析、農(nóng)產(chǎn)品農(nóng)藥殘留、獸藥殘留檢測(cè)技術(shù) 研究工作。E-mail:byndsunpeng@163.com

O652.63

A

1001-4020(2017)02-0169-03