水產(chǎn)種苗中氯霉素殘留量的測(cè)定前處理方法的改進(jìn)

胡浩光　彭家杰　劉少彬　李緒鵬

摘要：本文對(duì)氣相色譜法測(cè)定水產(chǎn)種苗中氯霉素的各種影響因素進(jìn)行探討，分析了樣品提取和脫脂凈化過程對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響，并對(duì)上述環(huán)節(jié)進(jìn)行改進(jìn)。結(jié)果表明：改進(jìn)后的前處理，實(shí)驗(yàn)成本低，加快實(shí)驗(yàn)速度，提高了回收率，適用于批量樣品同時(shí)檢測(cè)工作的需要。

關(guān)鍵詞：氯霉素；水產(chǎn)品；氣相色譜；前處理

中圖分類號(hào)：0657.7 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI：10.11974/nyyjs.20161232003

氯霉素（chloramphenicol）是由委內(nèi)瑞拉鏈絲菌產(chǎn)生的抗生素。屬抑菌性廣譜抗生素，被廣泛用于治療各種敏感菌感染，故此在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中被得到廣泛應(yīng)用。但由于氯霉素能抑制骨髓造血功能，造成過敏反應(yīng)，引起再生障礙性貧血（包括白細(xì)胞減少、紅細(xì)胞減少、血小板減少等），此外還可引起腸道菌群失調(diào)及抑制抗體形成）等危害，嚴(yán)重威脅人體健康，已成為人類的隱形殺手。因此對(duì)于水產(chǎn)養(yǎng)殖藥物殘留的檢測(cè)尤見重要。目前對(duì)于氯霉素藥物殘留的檢測(cè)方法，主要有GC法、酶聯(lián)免疫法（ELISA）、負(fù)化學(xué)源GC-MS測(cè)定法、LC法、超高效液相法、LC-MS-MS法、微生物法、放射免疫法等。目前檢測(cè)機(jī)構(gòu)主要采用氣相色譜法，但由于其樣品前處理過程繁瑣復(fù)雜，耗時(shí)長(zhǎng)，易出現(xiàn)回收率偏低的情況，對(duì)于批量樣品的檢測(cè)，尤見不合適。為此本文根據(jù)實(shí)際檢測(cè)工作，在行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)DB44/T 543 2008的基礎(chǔ)上，探討并改進(jìn)了提取、萃取等影響檢測(cè)的環(huán)節(jié)，對(duì)前處理進(jìn)行簡(jiǎn)化，進(jìn)一步提高方法的回收率和簡(jiǎn)化前處理步驟，節(jié)省測(cè)定時(shí)間和成本，進(jìn)一步優(yōu)化各個(gè)要素，提高了回收率和工作效率。

1材料與方法

1.1標(biāo)準(zhǔn)品與試劑

氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品，純度≥98.5%（德國(guó)Dr.EhrenstorferGmbH公司）；甲醇、乙酸乙酯，正己烷均為色譜純（美國(guó)Fisher scientific飛世爾實(shí)驗(yàn)器材（上海）有限公司）；試驗(yàn)用水為超純水（東莞市怡豐貿(mào)易有限公司），18.2MΩ.cm；無(wú)水硫酸鈉為分析純（在馬弗爐中650℃灼燒4h，冷卻后置干燥器內(nèi)中備用）；氯化鈉為優(yōu)級(jí)純（汕基金項(xiàng)目：東莞市科技計(jì)劃資助項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)：K10017K）頭市西隴化工有限公司）；衍生化試劑：BSTFA/TMCS體積比為99：1（美國(guó)Supelco公司），Milli-Q超純水系統(tǒng)（美國(guó)Millipore公司）。

1.2儀器與設(shè)備

氣相色譜7890（美國(guó)安捷倫公司）；離心機(jī)（德國(guó)SIGMA公司）；電子天平：感量0.0001；MS1渦旋振蕩器（德國(guó)IKA公司）；KQ-300VDE型超聲波提取儀（昆山市超聲儀器有限公司），氮吹儀（美國(guó)），超純水儀（美國(guó)Millipore公司）。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1樣品提取

準(zhǔn)確稱取均質(zhì)水產(chǎn)種苗樣品1.00g于15mL聚四氟乙烯離心管中，加入5mL乙酸乙酯，旋渦混合器混合30s，超聲10min，4000ffmin離心3min。將乙酸乙酯層轉(zhuǎn)移到50mL聚四氟乙烯離心管中，再重復(fù)提取1次，合并乙酸乙酯提取液于50mL聚四氟乙烯離心管中，于50～55℃水浴中吹氮蒸發(fā)至近干。

1.3.2脫脂凈化

向離心管中加0.5 mL甲醇旋渦混合溶解殘留物，加10 mL正已烷和10mL 4%氯化鈉溶液，旋渦混合1.5min，充分混合提取脂肪，4000r/min離心3min，棄去正已烷相。水相中加入7mL乙酸乙酯，旋渦混合器混合1.5min，4000r/min離心3min，吸取乙酸乙酯層，經(jīng)過無(wú)水硫酸鈉柱脫水過濾于15mL具塞玻璃離心管中，再重復(fù)提取1次，用洗耳球擠壓無(wú)水硫酸鈉柱，在50-55℃水浴中吹氮蒸發(fā)至干。

1.3.3衍生化

向干的殘留物中加100μL衍生物試劑，蓋塞并旋渦混合10s，在70℃烘箱中反應(yīng)30min。再在50～55℃水浴中，用氮?dú)獯底叨嘤嗟脑噭翗悠饭軇偤么蹈蔀橹梗ㄗ⒁猓捍瞬竭^長(zhǎng)的吹干時(shí)間可導(dǎo)致丟失分析物）。加入1mL正已烷，旋渦混合10s，供氣相色譜分析用。

1.4氣相色譜測(cè)定

1.4.1氣相色譜測(cè)定條件

色譜柱：HP-5石英毛細(xì)管柱（30m×0320mm×025gm），進(jìn)樣量1μL。脈沖不分流進(jìn)樣，脈沖壓力為30psi，脈沖時(shí)間為0.75min。升溫程序?yàn)椋撼鯗?00℃，保持1min；20℃/min至250℃，保持10min，然后設(shè)定15℃/min升至280℃，保持2min。進(jìn)樣口溫度26012，檢測(cè)器溫度為300～C。載氣為氮?dú)?，流?.2mL/min。外標(biāo)法定量。

1.4.2標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

精確稱取氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品0.0250g，用甲醇溶解后定容到50mL容量瓶中，配制成500ug/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，于冰箱冷藏儲(chǔ)存。使用前根據(jù)需要稀釋成不同濃度。

2結(jié)果與討論

2.1條件優(yōu)化

2.1.1樣品轉(zhuǎn)移的優(yōu)化

DB44/T 543-2008的樣品處理流程為“稱樣到離心管-轉(zhuǎn)移到雞心瓶-轉(zhuǎn)移到離心管-轉(zhuǎn)移到雞心瓶-轉(zhuǎn)移到具塞圓底離心管-吹干-定容”，如此反復(fù)的轉(zhuǎn)移定會(huì)引起樣品的損失，且耗時(shí)。本實(shí)驗(yàn)采用“稱樣到加塞10mL離心管-轉(zhuǎn)移到50 mL離心管-15 mL離心管吹干-定容”。這樣既減少了轉(zhuǎn)移的次數(shù)和實(shí)驗(yàn)步驟，同時(shí)縮短了檢測(cè)時(shí)間，減少了試劑用量，保證了回收率。

2.1.2濃縮和凈化的優(yōu)化

DB44/T 543-2008方法每次只能將一個(gè)樣品用雞心瓶在40℃水浴條件下減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干；而本實(shí)驗(yàn)中采用50mL的聚四氟乙烯離心管代替雞心瓶，每次可同時(shí)處理24個(gè)樣品，在氮吹儀上，于40℃水浴條件下，氮吹蒸發(fā)至干，操作簡(jiǎn)便快捷，濃縮效果明顯提高。

在DB44/T 543-2008方法中，樣品采用1次脫脂，2次反萃取，1次提取和2次蒸餾過程進(jìn)行凈化，縱然能達(dá)到較好的除雜效果，可耗時(shí)、繁瑣、樣品溶液轉(zhuǎn)換次數(shù)較多，大大影響了實(shí)驗(yàn)回收率。而本實(shí)驗(yàn)對(duì)此進(jìn)行改進(jìn)，用離心管代替雞心瓶，脫脂和反萃取的時(shí)候，進(jìn)行離心，溶液分層清析，縮短了實(shí)驗(yàn)步驟。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該方法不僅提高凈化效果，操作方便，降低檢驗(yàn)成本，而且效果好，回收率滿足日常檢測(cè)要求。

2.2色譜圖比較

分別采用DB44/T 543-2008方法（A）和改進(jìn)后的方法（B），進(jìn)行草魚樣品和草魚加標(biāo)樣品的檢測(cè)，得到圖譜如圖1-3所示。圖1為氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖；由圖2和圖3（草魚基質(zhì)和在草魚基質(zhì)添加0.2 mL 50ng/mL氯霉素）可以看出，采用方法A的干擾雜質(zhì)相對(duì)較多，而且基線不平穩(wěn)，按照實(shí)驗(yàn)方法1-3操作進(jìn)行，采用方法B的圖譜基線平穩(wěn)，基線噪聲低，干擾雜質(zhì)相對(duì)較少，且目標(biāo)物區(qū)分清晰。

2.3線性范圍和檢出限

用甲醇配制質(zhì)量濃度依次為1.00、5.00、10.00、25.00、50.00、75.00和100.00ng/mL的氯霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液，測(cè)定其峰面積相應(yīng)值，以峰面積對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度做工作曲線。當(dāng)進(jìn)樣量為1μL時(shí)，氯霉素在質(zhì)量濃度為0.5-100.00ng/mL的范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，線性方程為Area=34.1232795×Amt+8.6549223，線性系數(shù)r=0.9996。在本方法測(cè)定條件下，按信噪比S/N=3所對(duì)應(yīng)的濃度為依據(jù)計(jì)算檢出限，得到氯霉素的檢出限為0.27μg/kg。

3回收率及精密度試驗(yàn)

取陰性樣品，加入水平分別為5μg/kg、10μg/kg、和15μg/kg標(biāo)樣，每組水平7次平行樣，按上述實(shí)驗(yàn)條件，進(jìn)行加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)。試驗(yàn)數(shù)據(jù)見表1所列。氯霉素的回收率在74.6%～87.6%之間，重復(fù)性較好，RSD值為1.2%～1.9%，因此該方法的準(zhǔn)確度和精確度均可以滿足測(cè)定要求。

4結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)在DB44/T 543-2008的基礎(chǔ)上進(jìn)行了改進(jìn)，簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)步驟，提高工作效率。結(jié)果表明，DB44/T 543-2008經(jīng)本文改進(jìn)后，回收率高，精密度好，適用于水產(chǎn)品中氯霉素留量的檢測(cè)。