陰離子表面活性劑降解菌Sp—1的紫外線(xiàn)誘變研究

劉維琦　常立莉　張博　楊佳利+侯憲春

摘要：對(duì)已經(jīng)篩選出陰離子表面活性劑降解菌Sp-1進(jìn)行紫外線(xiàn)誘變，提高對(duì)陰離子表面活性劑月桂醇醚硫酸鈉（SLES）的降解率。經(jīng)過(guò)篩選后，選取10株Sp-1的突變菌株，測(cè)定Sp-1對(duì)SLES的降解率。10株突變菌株的降解率都比原始菌株較高，其中2號(hào)突變菌株的降解率為80%。通過(guò)對(duì)Sp-1紫外線(xiàn)誘變，選取的10株突變菌株對(duì)SLES的降解率普遍高于原始菌株，降解效果更為理想。

關(guān)鍵詞：降解菌；陰離子表面活性劑；紫外線(xiàn)誘變；降解率

中圖分類(lèi)號(hào)：Q93-33 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI：10.11974/nyyjs.20170132001

陰離子表面活性劑具有乳化、增溶、起泡消泡、滲透洗滌、潤(rùn)滑和殺菌等作用，是合成洗滌劑的重要成分。隨著現(xiàn)代工業(yè)的迅速發(fā)展，陰離子表面活性劑通過(guò)污水排放和工業(yè)廢渣等途徑進(jìn)入環(huán)境，成為最常見(jiàn)的一類(lèi)有機(jī)污染物。因此對(duì)陰離子表面活性劑的檢測(cè)已經(jīng)成為我國(guó)環(huán)保部門(mén)的一項(xiàng)重要任務(wù)。本實(shí)驗(yàn)在原有微生物法降解陰離子表面活性劑的基礎(chǔ)之上，通過(guò)紫外線(xiàn)誘變進(jìn)一步提高降解菌的效率。近年來(lái)許多學(xué)者利用紫外線(xiàn)誘變技術(shù)來(lái)研究有機(jī)氮、苯酚和農(nóng)藥等污染物降解菌的降解特性，但是對(duì)于陰離子表面活性劑的降解菌研究目前還鮮見(jiàn)報(bào)道。該研究通過(guò)對(duì)從活性污泥中篩選的陰離子表面活性劑降解菌Sp-1進(jìn)行紫外線(xiàn)誘變，來(lái)探討誘變菌株對(duì)陰離子表面活性劑的降解能力；選取降解性能較高的降解菌，有利于對(duì)水環(huán)境中陰離子表面活性劑處理工作的進(jìn)行，同時(shí)為陰離子表面活性劑降解菌的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株來(lái)源

從活性污泥中提取并經(jīng)過(guò)分離純化的陰離子表面活性劑降解菌Sp-1。

1.2 培養(yǎng)基

分離培養(yǎng)基采用高氏一號(hào)培養(yǎng)基；

篩選培養(yǎng)基采用周理志配方配制；

無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基為高氏一號(hào)改良配方。

1.3 Sp-1生長(zhǎng)曲線(xiàn)的測(cè)定

將Sp-1接種到SLES濃度為0.1g/L分離培養(yǎng)基中，經(jīng)過(guò)分離純化后再接種到SLES濃度為0.1g/L的發(fā)酵培養(yǎng)基中，在30℃、150 r/min條件下振蕩培養(yǎng)24h，每隔2 h取5.0 mL菌液在分光光度計(jì)下測(cè)出OD460值，并以空白作為對(duì)照，繪制Sp-1的生長(zhǎng)曲線(xiàn)。

1.4菌懸液的制取

取出Sp-1降解菌的發(fā)酵液，用無(wú)菌蒸餾水配制菌懸液，分別將菌體濃度稀釋到10^-2、10^-3、10^-4、10^-5倍，然后用血球計(jì)數(shù)板觀(guān)察菌落的個(gè)數(shù)，取菌落個(gè)數(shù)100～200之間的濃度為最佳稀釋濃度，并以此濃度制備菌懸液。

1.5紫外線(xiàn)誘變

紫外線(xiàn)誘變采用波長(zhǎng)為260nm，20W的紫外線(xiàn)殺菌燈。在超凈工作臺(tái)上先將紫外照射燈開(kāi)啟20min殺菌預(yù)熱，將配制好的菌懸液放置于實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，取15個(gè)滅菌平板分成5組，每組3個(gè)，每個(gè)培養(yǎng)基中倒入0.5mL的菌懸液涂布平板，在距紫外照射燈為20cm處，進(jìn)行紫外照射，5組平板的照射時(shí)間依次為30s、60s、90s、120s、150s。以未照射的菌懸液作為對(duì)照組，計(jì)算誘變致死率。

致死率計(jì)算公式：

（1）

1.6Sp-1突變菌株的篩選

1.6.1初篩

選擇致死率為75%-80%的Sp-1突變菌株，接種到篩選培養(yǎng)基中，37℃下恒溫培養(yǎng)24h。測(cè)量藍(lán)色暈圈的直徑，用接種針挑選出10個(gè)藍(lán)色暈圈直徑比原始直徑大的Sp-1菌株進(jìn)行復(fù)篩。

1.6.2復(fù)篩

將挑選的10株突變菌株和1株原始菌株接種到無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基上振蕩培養(yǎng)48h。在150r/min離心10 min除去菌體；將處理離心后的菌液放在紫外分光光度計(jì)中，并分別測(cè)量篩選的10株突變菌株對(duì)陰離子表面活性劑的降解率。

降解率計(jì)算公式：

（2）

2結(jié)果與分析

2.1降解菌株Sp-1的生長(zhǎng)曲線(xiàn)

在Sp-1降解菌的生長(zhǎng)曲線(xiàn)中，可以觀(guān)察到在12h之前，菌株處于緩慢生長(zhǎng)的階段，從12h后開(kāi)始逐漸進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，當(dāng)?shù)?0h時(shí)處于生長(zhǎng)較穩(wěn)定的生長(zhǎng)狀態(tài)，此時(shí)菌株對(duì)外界環(huán)境因素的作用敏感，達(dá)到生長(zhǎng)的最佳狀態(tài)，因此應(yīng)選擇培養(yǎng)20h的Sp-1降解菌株進(jìn)行紫外線(xiàn)誘變處理（見(jiàn)圖1）。

2.2不同照射時(shí)間對(duì)降解菌株的致死效應(yīng)

由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，隨著照射時(shí)間的不同，SLES降解菌的致死率有所不同。隨著照射時(shí)間的增加，致死率不斷上升，但時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致致死率上升逐漸緩慢，因此選擇90s為紫外誘變劑量時(shí)間。致死率為77.3%（見(jiàn)圖2）。

2.3微生物降解菌株Sp-1的高效篩選

2.3.1Sp-1降解菌株的初篩

測(cè)量接種到篩選培養(yǎng)基中10株Sp-1突變菌株的直徑，其中2號(hào)突變菌株的直徑最大，為1.7mm，對(duì)照組菌株為0.6mm（0號(hào)菌株為對(duì)照組）（見(jiàn)圖3）。

2.3.2Sp-1降解菌株的復(fù)篩

將菌液離心沉淀，并將菌液的pH調(diào)至7保持中性。分別測(cè)量10株突變菌株的降解率，經(jīng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，10株突變菌株的降解率都高于原始菌株的降解率，其中2號(hào)突變菌株的降解能力最高，降解率達(dá)到80%，比原始菌株的降解率提高了20%（見(jiàn)圖4）。

3討論

對(duì)降解菌Sp-1進(jìn)行紫外線(xiàn)誘變，增加陰離子表面活性劑降解菌Sp-1的降解率，使降解效果達(dá)到理想。因紫外線(xiàn)照射劑量目前沒(méi)有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，故借鑒曹禮等在研究紫外誘變釀酒酵母時(shí)的試驗(yàn)條件，采用20W的紫外照射燈，照射距離為20cm，誘變劑量采用75%-80%的誘變致死率。通過(guò)紫外線(xiàn)誘變提高降解菌Sp-1對(duì)陰離子表面活性劑的降解率，降解能力增強(qiáng)，使陰離子表面活性劑降解菌Sp-1達(dá)到理想降解效果。