亞臨界法提取神香草精油成分及抗氧化活性的研究

徐效圣，吳曉菊，陳亞麗

亞臨界法提取神香草精油成分及抗氧化活性的研究

徐效圣1，吳曉菊1，陳亞麗2

（1.新疆輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品生物技術(shù)學(xué)院，新疆烏魯木齊830021；2.中國科學(xué)院新疆生態(tài)與地理研究所，新疆烏魯木齊830011）

采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（GC-MS）分析亞臨界萃取神香草中揮發(fā)油的化學(xué)成分和相對(duì)含量，并探討其化學(xué)成分與神香草特有香氣之間的關(guān)系，同時(shí)進(jìn)行體外抗氧化能力試驗(yàn)。結(jié)果表明，從揮發(fā)油中分離出46種化合物，鑒定出其中的30種，占揮發(fā)性成分總量的94.29%；揮發(fā)油的主要成分有三甲基二環(huán)[3,1,1]庚烷-3-酮（28.27%）、α-生育酚乙酸酯（16.89%）、硬脂酸乙烯酯（7.32%）；分析得出三甲基二環(huán)[3,3,1]庚烷-3-酮與α-生育酚乙酸酯是神香草精油獨(dú)特香氣的主要成分；神香草揮發(fā)油在DPPH自由基和羥自由基的清除作用方面表現(xiàn)出較高的活性。

神香草；揮發(fā)油；抗氧化；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用；亞臨界萃取

0 引言

神香草是唇形科多年生草本（半灌木），在新疆的北部、內(nèi)蒙古等地常見[1-2]，其作為維吾爾族民間常用草藥，維吾爾語名為“祖法依亞比斯”。《拜地依藥書》載：神香草是一種植物的全草，形狀與麥加指甲花和野指甲花相似，藥用家生神香草，具有消炎平喘、止咳化痰、祛寒止痛、通肝軟脾、利尿消腫、消除毒蟲之毒、驅(qū)除腸蟲的作用[3-4]，神香草含有黃酮類、三萜類、烷烴類、甾體類和揮發(fā)油等成分[5-6]。

神香草揮發(fā)油的提取有2種常用方法，分別是水蒸氣蒸餾法和有機(jī)溶劑浸提法。水蒸氣蒸餾法出油率僅在0.5%～0.7%，產(chǎn)品得率低，而且活性成分破壞多；有機(jī)溶劑方式萃取揮發(fā)油，在食藥等行業(yè)中的應(yīng)用受限。超臨界CO2流體萃取法，雖具有很強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)，但是氣體必須在超高壓狀態(tài)下才能夠進(jìn)行萃取加工，制約了其在工業(yè)上的應(yīng)用。而亞臨界流體常溫常壓條件下是氣體狀態(tài)，因而大大降低了生產(chǎn)成本[7]。

試驗(yàn)采用亞臨界萃取方式對(duì)神香草提取揮發(fā)油，從中鑒定出30種化合物。同時(shí)設(shè)計(jì)自由基清除能力試驗(yàn)對(duì)其抗氧化活性進(jìn)行分析，較系統(tǒng)地評(píng)價(jià)了神香草揮發(fā)油成分及其體外抗氧化能力，為神香草的商業(yè)化種植、神香草精油的高品質(zhì)提取加工提供了理論數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

神香草，新疆伊犁地區(qū)第65團(tuán)場(chǎng)種植；神香草揮發(fā)油，中國科學(xué)院新疆生態(tài)與地理研究所提供[7]；無水乙醚、鄰二氮菲、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼及其他試劑，均為分析純。

GCMS-5977型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國安捷倫科技有限公司產(chǎn)品；722-P型可見分光光度計(jì)，北京普析通用有限公司產(chǎn)品；RE-5298型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠產(chǎn)品；亞臨界萃取設(shè)備，河南安陽晶華油脂有限公司產(chǎn)品。

AL204-IC型電子天平，F(xiàn)SH-2型高速勻漿機(jī)，HWS26型電熱恒溫水浴鍋，TGL-10C型高速臺(tái)式離心機(jī)，以及固相微萃取裝置和加熱蒸餾裝置。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 亞臨界萃取神香草揮發(fā)油

將神香草葉和花于40℃條件下烘干處理72 h，烘干后粉碎過篩，取40目的粉末備用。采用亞臨界方式提取，詳見參考文獻(xiàn)[7]。

1.2.2 樣品處理及氣相色譜-質(zhì)譜測(cè)定方法[8]

樣品預(yù)處理：采用針式固相微萃取處理（PDMS），使用前于280℃條件下老化30 min，放入樣品瓶，于40℃條件下預(yù)熱10 min，然后在40℃條件下萃取40 min后直接進(jìn)樣，解析3 min。

色譜柱：30 m×0.25 mm，0.25 μm石英毛細(xì)管柱；升溫程序：60℃保持2 min，以4℃/min升至140℃保持2 min，再以6℃/min升至220℃保持8 min；檢測(cè)器：FTD；載氣：N2；靈敏度：32×10-12AFS；進(jìn)樣量：1.0 μL；分流比：2∶1。

離子源：EI；能量：70 eV；進(jìn)樣口溫度：230℃，接口溫度：230℃；電子倍增電壓：1.5 kV；溶劑延遲：6 min；掃描范圍：40～500 u。

1.2.3 風(fēng)味物質(zhì)分析方法

用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀分析鑒定神香草揮發(fā)油樣品溶液，得到總離子色譜圖。經(jīng)計(jì)算檢索，同時(shí)對(duì)目標(biāo)組分用峰面積歸一法進(jìn)行積分計(jì)算，從而得出反應(yīng)生成的各組分含量，確定神香草揮發(fā)油物質(zhì)的化學(xué)成分。

1.2.4 抗氧化活性的測(cè)定

（1）DPPH自由基清除能力的測(cè)定。參照文獻(xiàn)[8-9]方法改進(jìn)，分別配制質(zhì)量濃度為0.01，0.02，0.03，0.04，0.05 mg/mL神香草揮發(fā)油及VC溶液，在一系列10 mL比色管中分別加入3.5 mL 1.0×10-4mol/L的DPPH溶液，然后加入0.5 mL無水乙醇，搖勻并反應(yīng)30 min，以無水乙醇為參比，測(cè)定其于波長517 nm處的吸光度A1；同時(shí)用同樣方法測(cè)定3.5 mL 1.0×10-4mol/L的DPPH溶液和0.5 mL樣品液的吸光度A；測(cè)定3.5 mL無水乙醇與0.5 mL樣品液于波長517 nm處的吸光度A0，以相同質(zhì)量濃度的VC溶液作陽性對(duì)照，所有操作重復(fù)測(cè)定3次。按照公式（1）計(jì)算DPPH自由基清除率。

（2）羥自由基清除能力的測(cè)定。參照文獻(xiàn)[10-11]方法改進(jìn)，采用結(jié)晶紫法，配制0.05 mg/mL的VC和純化后神香草揮發(fā)油溶液。在中號(hào)比色管中加入0.2 mL 0.4 mmol/L的結(jié)晶紫，然后加入3 mL pH值4.0的磷酸氫二鉀-檸檬酸緩沖溶液，同時(shí)添加2 mL 15 mmol/L的FeSO4溶液和相同濃度、體積的H2O2溶液，緩沖溶液定容至10 mL，搖勻后放置30 min，于波長580 nm處測(cè)吸光度A0，同時(shí)測(cè)定不加H2O2時(shí)的吸光度Ab。試驗(yàn)組中，加入H2O2之前，加入不同體積純化后神香草揮發(fā)油樣品液，測(cè)定其吸光度Ax，以相同質(zhì)量濃度的VC溶液作陽性對(duì)照，所有操作重復(fù)測(cè)定3次。按照公式（2）計(jì)算羥自由基清除率。

2 結(jié)果與分析

2.1 神香草揮發(fā)油（亞臨界萃?。┗瘜W(xué)成分神香草揮發(fā)油的總離子流見圖1。

圖1 神香草揮發(fā)油的總離子流

經(jīng)儀器所配置的LIB譜庫進(jìn)行檢索，化合物通過保留指數(shù)進(jìn)行定性，峰面積歸一化法進(jìn)行定量。經(jīng)鑒定，神香草揮發(fā)油共獲得30種化合物。

在上述條件下獲得的GC-MS圖譜，結(jié)合色譜保留規(guī)律，與NIST譜圖庫作對(duì)比。

由圖1可知，共分離出46個(gè)質(zhì)譜峰，經(jīng)檢索并結(jié)合參考相關(guān)文獻(xiàn)[12]，初步判斷出其中30種化合物成分。其中，以含碳、氫、氧的化合物為主，也有少量的物質(zhì)含有氮等其他原子，包括4種烷烴類化合物（3種環(huán)烷烴和1種直鏈烷烴）、8種萜烯類化合物、4種酯類化合物、8種芳香族醇類化合物、4種酮類化合物、2種酸類化合物、1種生物堿類化合物。神香草揮發(fā)油獨(dú)特的香味即由上述物質(zhì)呈現(xiàn)。

神香草揮發(fā)油的主要化學(xué)成分（亞臨界）見表1，三甲基二環(huán)[3,1,1]庚烷-3-酮的特征指紋見圖2，α-生育酚乙酸酯的特征指紋見圖3。

表1 神香草揮發(fā)油的主要化學(xué)成分（亞臨界）

圖2 三甲基二環(huán)[3,1,1]庚烷-3-酮的特征指紋

圖3 α-生育酚乙酸酯的特征指紋

通過表1，圖1和圖2分析，其中生物活性比較高的成分有十五烷、β-水芹烯、桃金娘烯醇、乙酸里哪酯、石竹烯、香樹烯、G-橄香烯、硬脂酸乙烯酯、α-生育酚乙酸酯、三甲基二環(huán)[3,1,1]庚烷-3-酮等。

通過峰面積可以判斷萜烯、酯酮類化合物是神香草揮發(fā)油的主要成分，其含量為三甲基二環(huán)[3,1,1]庚烷-3-酮（28.27%）、α-生育酚乙酸酯（16.89%）、硬脂酸乙烯酯（7.32%）。三甲基二環(huán)[3,1,1]庚烷-3-酮與α-生育酚乙酸酯是神香草精油獨(dú)特香氣的主要成分。

2.2 神香草揮發(fā)油對(duì)DPPH自由基的清除作用

通過前人的研究成果及DPPH自由基抗氧化物的供氫能力分析，它在有機(jī)溶劑波長517 nm處有強(qiáng)吸收[13]。在反應(yīng)中，體系顏色變得越淺則表示檢測(cè)物質(zhì)的抗氧化能力越強(qiáng)。

DPPH自由基清除率與樣品液質(zhì)量濃度的關(guān)系見圖4。

圖4 DPPH自由基清除率與樣品液質(zhì)量濃度的關(guān)系

由圖4可知，神香草揮發(fā)油具有清除DPPH自由基的作用，且隨質(zhì)量濃度增加清除率增大；但與VC這種人工抗氧化劑相比，其清除效果仍然低于同質(zhì)量濃度的VC。試驗(yàn)表明，神香草揮發(fā)油符合隨質(zhì)量濃度增加清除DPPH自由基能力增強(qiáng)的趨勢(shì)。2.3神香草揮發(fā)油對(duì)羥自由基清除能力的測(cè)定

羥自由基清除率與樣品液質(zhì)量濃度的關(guān)系見圖5。

圖5 羥自由基清除率與樣品液質(zhì)量濃度的關(guān)系

試驗(yàn)采用結(jié)晶紫作為氧化還原指示劑，其顏色變化可敏銳地反映溶液氧化還原的狀態(tài)。由圖5可知，隨著神香草揮發(fā)油質(zhì)量濃度增大羥自由基清除率也逐漸升高，說明神香草化學(xué)成分具有清除羥自由基的能力，但比VC的清除能力低。因此可知，神香草揮發(fā)油可以有效清除羥自由基，對(duì)人體健康有益。

3 結(jié)論

試驗(yàn)以神香草揮發(fā)油為底物，使用GC-MS法分析了的其化學(xué)成分與含量，并鑒定出30種化合物成分，含量較多的化合物為酯類、烷烴類和萜類，相對(duì)含量最高的是三甲基二環(huán)[3,1,1]庚烷-3-酮和α-生育酚乙酸酯。祖麗菲亞·吾斯曼等人的研究結(jié)果與試驗(yàn)有些差別，從維藥神香草超臨界CO2流體萃取經(jīng)GC-MS分析、鑒定出所有34種化合物，其中γ-谷甾醇（31.882%）、二十八烷（19.953%）化合物含量最高。分析其產(chǎn)生較大差別的原因，可能是試驗(yàn)所用的神香草揮發(fā)油采用亞臨界萃取制得，經(jīng)文獻(xiàn)檢索報(bào)道較多的為水蒸氣提取制得；也可能因神香草的產(chǎn)地和品種不同，導(dǎo)致其揮發(fā)油化學(xué)成分有所差異。神香草揮發(fā)油成分的復(fù)雜性，為進(jìn)一步合理開發(fā)利用神香草資源帶來一定的優(yōu)勢(shì)。

揮發(fā)油是含有多種揮發(fā)性成分的復(fù)雜體系，其抗氧化活性是多種化學(xué)成分共同作用的結(jié)果。神香草揮發(fā)油對(duì)DPPH自由基和羥自由基的清除能力有一定影響，但明顯略弱于VC；作為一種多用途植物，其富含特有的活性物質(zhì)及營養(yǎng)成分，具有抗氧化、防衰老、抑菌等多種生理功能，擁有廣闊的市場(chǎng)開發(fā)潛力和研究價(jià)值。目前，報(bào)道的文獻(xiàn)研究中較多的是化學(xué)成分的分析，對(duì)于其抗氧化方面報(bào)道較少，試驗(yàn)對(duì)此部分進(jìn)行了完善。神香草揮發(fā)油相應(yīng)的生理活性、藥理作用尚不明確，還需要進(jìn)一步研究。

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Studies on Chemical Components and in Vitro Antioxidant Capacity of Essential from Hyssopus with Subcritical Treatment

XU Xiaosheng1，WU Xiaoju1，CHEN Yali2
（1.College of Food and Biotechnology，Xinjiang Institute of Light Industry Technology，Urumqi，Xinjiang 830021，China；2.Xinjiang Institute of Ecology and Geography，Chinese Academy of Sciences，Urumqi，Xinjiang 830011，China）

Subcritical extraction followed by GC-MS combined with quantification by peak area normalization method is used to analyze volatile compounds in the fruitbodies of hyssopus.Meanwhile，the relationship between volatile compounds and characteristic aroma of the fruitbodies of hyssopus is explored.Hyssopus antioxidant activities are evaluated by this method.Results show that 46 compounds are identified，accounting for 94.29%of the total volatile compounds from the fruitbodies of hyssopus among which the predominant compounds are trimethylbicyclo[3,1,1]heptane-3-ketone（28.27%），D-alpha-Tocopheryl acetate（16.89%）and vinyl Stearate（7.32%）.Trimethylbicyclo[3,3,1]heptane-3-ketone and D-alpha-Tocopheryl acetate are mainly responsible for the characteristic aroma of the fruitbodies of hyssopus.The hyssopus shows high antioxidant activity，through the elimination of（DPPH）free radicals and hydroxyl radical.

hyssopus；volatile oil；antioxidant activity；gas chromatography-mass spectrometry（GC-MS）；subcritical extraction

R284.2

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2017.03.039

1671-9646（2017）03b-0043-04

2017-02-20

新疆維吾爾自治區(qū)高校科研計(jì)劃項(xiàng)目（XJEDU2014I066）。

徐效圣（1983—），男，碩士，講師，研究方向?yàn)槭称焚|(zhì)量與控制。