秈稻復交F1花藥培養(yǎng)力的提高技術(shù)

劉凱+唐紅生+嚴國紅+孫明法

摘要：以MS培養(yǎng)基為對照，研究分析M8和N6等2種培養(yǎng)基在不同激素濃度條件下，秈稻復交F1花藥的培養(yǎng)力。結(jié)果表明，在只添加2 mg/L 2，4-D的誘導培養(yǎng)基上，M8培養(yǎng)基可以使秈稻復交F1花藥出愈率達23.97%～38.28%，而N6培養(yǎng)基只有10.77%～19.61%；在M8誘導培養(yǎng)基上，激素配比為2 mg/L 6-BA、0.5 mg/L KT、2 mg/L ABA，花藥出愈率最高可達55.57%，在M8分化培養(yǎng)基上，激素配比為2 mg/L 6-BA、1 mg/L NAA、1 mg/L IAA的培養(yǎng)基能使秈稻復交F1的分化率達到44.97%，因此不同激素配比下的M8培養(yǎng)基更適應于秈稻F1花藥培養(yǎng)，這為建立高效的秈稻F1花藥培養(yǎng)技術(shù)體系提供了依據(jù)。

關(guān)鍵詞：秈稻；復交F1；花藥培養(yǎng)力；誘導；分化；培養(yǎng)基；激素；出愈率

中圖分類號： S511.2+10.43文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）04-0047-02

花藥培養(yǎng)是一種單倍體育種技術(shù)，目前已經(jīng)成功應用于水稻育種中的各個領(lǐng)域，它具有縮短育種周期、提高選擇效率、快速創(chuàng)新種質(zhì)等諸多優(yōu)勢，但植物組織培養(yǎng)存在很強的物種依賴性和基因型特異性。目前，水稻花藥培養(yǎng)效率尤其是秈稻的平均出愈率一般不超過5%，綠苗率大多在20%以下，因此水稻基因型的狹窄和組織培養(yǎng)的低效率極大地限制了水稻花藥培養(yǎng)在生產(chǎn)上的利用[1]。

[JP2]一般認為粳稻培養(yǎng)效率較高，秈粳雜交后代居中，目前以秈粳雜交F1的花藥作為中間型材料在花藥培養(yǎng)技術(shù)上得到了廣泛的應用。王建平等認為，利用廣親和品種與其他秈粳品種雜交的F1或其本身花培效率都較好[2]，并且F1結(jié)實率高，在花培后代出現(xiàn)農(nóng)藝性狀優(yōu)良的個體機率較大[3]。陳成斌等研究發(fā)現(xiàn)，雜交組合中若含有粳稻血緣，則花藥培養(yǎng)力較高，較易獲得大量的花培綠苗，因此花培育種中常以粳稻作為橋梁親本[4]。相關(guān)的研究大大推進了以組織培養(yǎng)為基礎(chǔ)的水稻育種工作，但目前關(guān)于秈稻復交F1花藥培養(yǎng)力的研究比較少見。[JP]

本試驗在以往研究的基礎(chǔ)上，以4個秈稻復交F1組合為試驗材料，利用M8和N6為基本培養(yǎng)基重點研究不同濃度的植物激素類物質(zhì)，對不同秈稻復交F1花藥愈傷組織的誘導和分化的影響，試圖進一步優(yōu)化上述水稻復交F1高效花藥培養(yǎng)的技術(shù)體系。

1材料與方法

1.1供試材料[HT]

4個秈稻雜交組合F1均來自江蘇沿海地區(qū)農(nóng)業(yè)學研究所水稻室。（鎮(zhèn)42/中728）//02428、（中4188/明77）//02428、（559/075）//矮桿、（084/129）//矮桿，材料種植于江蘇沿海地區(qū)農(nóng)業(yè)科學研究所南洋試驗場，2013年5月10日播種，6月10日移栽，田間管理按常規(guī)方法。

1.2培養(yǎng)基

1.2.1誘導培養(yǎng)基

采用MS、M8和N6培養(yǎng)基，M8配方參照文獻[5]，N6配方參照文獻[6]，其中均附加30 g/L蔗糖、8 g/L 瓊脂粉、2 mg/L 2，4-D（2，4-苯氧乙酸）、0.5 mg/L水解絡(luò)蛋白和0.1 mg/L肌醇。

1.2.2分化培養(yǎng)基

采用M8培養(yǎng)基，其中添加30 g/L蔗糖、瓊脂粉10 g/L，分別設(shè)置不同的激素配比（2 mg/L 6-BA+0.5 mg/L KT+2 mg/L ABA、1 mg/L 6-BA+0.5 mg/L KT、2 mg/L 6-BA+0.5 mg/L KT，2 mg/L 6-BA+1 mg/L NAA+1 mg/L IAA、2 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA、2 mg/L 6-BA+1 mg/L NAA）。

1.3水稻花藥培養(yǎng)

選取花粉分化正處在單核靠邊期的穗子，低溫預處理 7 d，將取回的穗子經(jīng)75%乙醇處理90 s，用10%雙氧水溶液浸泡15 min，再用無菌水漂洗3次，然后將消毒過的穗子穎殼剪開，將花粉接種于誘導培養(yǎng)基上面。每瓶接種約50 枚，每個材料3 瓶，3次重復，放入暗培養(yǎng)室（26±2） ℃黑暗條件下培養(yǎng)，接種60 d后記錄出愈的數(shù)目，計算愈傷組織誘導率，分化40 d后統(tǒng)計愈傷分化率。

1.4統(tǒng)計分析

愈傷組織誘導率=愈傷組織數(shù)/接種花藥數(shù)×100%[7]；

愈傷分化率=愈傷組織分化數(shù)/愈傷組織數(shù)×100% 。

2結(jié)果與分析

2.1不同誘導培養(yǎng)基對秈稻復交F1花藥出愈率的影響

2.2不同激素配比的M8培養(yǎng)基對秈稻復交F1花藥出愈率的影響[HT]

由表2可見，以M8為誘導培養(yǎng)基（添加2，4-D 2 mg/L、蔗糖30 g/L、瓊脂10 g/L）設(shè)為對照，設(shè)置不同的激素配比，整體出愈率最高的培養(yǎng)基是添加了2 mg/L 6-BA+ 0.5 mg/L KT+2 mg/L ABA的培養(yǎng)基，出愈率在41.27%～55.57%，要遠遠高于對照組、只添加2 mg/L 6-BA、0.5 mg/L KT+2 mg/L 6-BA以及添加1 mg/L 6-BA+0.5 mg/L KT的誘導培養(yǎng)基，方差分析差異極顯著。這可能由于在誘導培養(yǎng)基中添加了2 mg/L ABA所致，對比2 mg/L 6-BA+0.5 mg/L KT和1 mg/L6-BA+0.5 mg/L KT等2種激素配比，花粉出愈率也極顯著高于對照，但是兩者之間只有在02428配置的組合中差異極顯著，而其余2個組合差異并不顯著，這表明濃度稍高的6-BA對愈傷的產(chǎn)生具有一定促進作用。

2.3不同激素配比的M8培養(yǎng)基對秈稻復交F1花藥分化率的影響[HT]

以M8為分化培養(yǎng)基（蔗糖30 g/L、瓊脂10 g/L）設(shè)為對照，將產(chǎn)生的愈傷組織進行分化培養(yǎng)，由表3可知，添加 2 mg/L 6-BA+1 mg/L NAA+1 mg/L IAA的M8分化培養(yǎng)基上愈傷組織分化率極顯著高于對照組、激素配比為2 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA組和2 mg/L 6-BA+1 mg/L NAA的分化培養(yǎng)基，分化率變異幅度為22.66%～44.97%，方差分析表明差異極顯著。對比添加2 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA和 2 mg/L 6-BA+1 mg/L NAA的2種激素配比，只有（鎮(zhèn)42/中728）//02428組合的分化率差異極顯著，其余組合兩者之間差異并不明顯。同時，02428配置的雜交組合在各個激素配比下相比其他組合，都獲得了較高的分化率，這與前文中02428配置的雜交組合在M8誘導培養(yǎng)基上獲得高出愈率的結(jié)果相一致，表明秈稻雜交F1中若含有廣親和血統(tǒng)，較易獲得高的分化率，同時表明水稻花藥培養(yǎng)效率受制于水稻品種的基因型。

3討論與結(jié)論

成功的花藥培養(yǎng)在一定程度上依賴于培養(yǎng)基的選擇，不同的培養(yǎng)基對不同基因型的水稻材料有不同的培養(yǎng)效果，目前主要集中在M8、合5和N6等幾種培養(yǎng)基上[8]。本研究采用M8和N6培養(yǎng)基對4個秈稻復交F1進行花藥培養(yǎng)力研究，結(jié)果表明在2 mg/L 6-BA+0.5 mg/L KT+2 mg/L ABA 和2 mg/L 6-BA+1 mg/L NAA+1 mg/L IAA的M8培養(yǎng)基上獲得了較高的出愈率和分化率，因此更加適應于秈稻F1的花藥培養(yǎng)，其中02428配置的雜交后代在出愈率和分化率上也顯著高于其他雜交后代，這表明秈稻F1花藥培養(yǎng)依賴于水稻品種基因型特征，而含有廣親和血統(tǒng)的秈稻雜交后代花藥培養(yǎng)力較高，與前人的研究結(jié)果[2]也相一致。

在植物離體培養(yǎng)過程中，外源生長素被認為是植物胚胎發(fā)育所必需的[9]，外源激素的作用可以促進愈傷組織的發(fā)生和分化，在水稻花藥培養(yǎng)中扮演著重要角色，但研究發(fā)現(xiàn)單一成分的激素培養(yǎng)的效果并不十分理想，而幾種激素的搭配使用卻可以在花粉脫分化階段為組織的分化和成苗提供便利，由此可見水稻花藥培養(yǎng)是一個復雜的生理生化過程，使用合理的激素組分及不同的激素配比是影響花培效率的重要因素[10-11]。本研究在設(shè)計了不同的激素配比后，在出愈率和分化率上面都獲得了較好的效果，如在誘導培養(yǎng)基中添加 6-BA 可以促進愈傷組織的生成，在細胞脫分化過程中可以提高花粉胚狀體的產(chǎn)生和增強形成根的趨勢，對分化成苗起

主導作用，使得分化率和再生率得到顯著提高。此外，在誘導培養(yǎng)基中添加2 mg/L ABA極大地提升了秈稻花藥的出愈率，這可能由于誘導培養(yǎng)基中外源ABA可以誘導胚性愈傷產(chǎn)生，以及在繼代培養(yǎng)中保持愈傷組織的胚性作用所致[12]。在分化培養(yǎng)基中添加IAA后，分化率也得到了提高，表明IAA對愈傷組織的分化有促進作用。

因試驗設(shè)計所限，并沒有進一步增加激素使用種類和使用濃度的范圍，因此該結(jié)論僅在本研究范圍內(nèi)進行討論，今后的試驗可以擴大研究范圍，以探討能夠顯著提高秈稻雜交F1的花藥培養(yǎng)力的技術(shù)方案。

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