卡波氏肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染神經(jīng)元細(xì)胞SH-SY5Y的特點(diǎn)研究

曹冬冬 ，李英 ，張慧 ，譚曉華 ，楊磊 ，潘澤民 ，李冬妹 *

（1新疆地方與民族高發(fā)病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)教研室，新疆 石河子 832002；2新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究中心，新疆 烏魯木齊 830001；3杭州師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院，浙江 杭州 310036）

卡波氏肉瘤相關(guān)皰疹病毒（KSHV），又名人類8型皰疹病毒 （human herpesvirus 8，HHV8），是由Chang 等[1]首次在卡波氏肉瘤（Kaposi Sarcoma，KS）組織中提取發(fā)現(xiàn)的。KSHV屬于γ-皰疹病毒，基因組全長(zhǎng)大約140.5kb[2]，是一種DNA病毒，含90個(gè)開放閱讀框(open reading frame，ORF)，病毒特有基因被命名為K1～K15，其它則用ORF表示[3-4]。目前報(bào)道KSHV主要感染的細(xì)胞為上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、B細(xì)胞以及巨噬細(xì)胞[5-6]。

該病毒感染引起的疾病主要包括卡波氏肉瘤（Kaposi’ssarcoma，KS）、 原 發(fā) 性 滲 出 性 淋 巴 瘤(primary exudative lymphoma，PEL)與多中心 Castleman’s病(Multicenter Castleman’s Disease，MCD)[1]。KSHV 感染具有鮮明的地區(qū)與民族特點(diǎn)[7]，在我國(guó)，新疆是高感染區(qū)，其感染所引發(fā)的經(jīng)典型KS也主要見于新疆的維吾爾族與哈薩克族人[8]。

隨著研究的深入，近年來發(fā)現(xiàn)KSHV所在的皰疹病毒家族存在嗜神經(jīng)傾向[9]，其感染可導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)病理性改變[9-10]，人類4型皰疹病毒（human herpesvirus 4，HHV4）感染伴發(fā)艾滋?。ˋIDS）患者會(huì)繼發(fā)中樞神經(jīng)系統(tǒng)性淋巴瘤，而在KSHV感染伴發(fā)中樞神經(jīng)系統(tǒng)性疾病患者的腦脊髓液中檢測(cè)到該病毒[11]。

AIDS患者易感KSHV，KSHV感染引發(fā)的卡波氏肉瘤是AIDS患者最常并發(fā)的腫瘤和死亡原因[1，12]，且患者常出現(xiàn)記憶喪失、智力減退和行為改變等神經(jīng)系統(tǒng)癥狀[13-14]。KSHV是否可以直接感染神經(jīng)元細(xì)胞而造成其功能障礙需要進(jìn)一步研究。本研究旨在研究和驗(yàn)證KSHV病毒是否可以直接感染神經(jīng)元細(xì)胞，同時(shí)檢測(cè)KSHV病毒相關(guān)基因的表達(dá)和對(duì)細(xì)胞增殖的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

主要試劑：DMEM培養(yǎng)液、RPMI 1640培養(yǎng)液、0.25%胰酶-EDTA購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，四季清胎牛血清購(gòu)自北京麥瑞博公司，青鏈霉素、1%triton-X-100購(gòu)自 Solarbio公司，PBS購(gòu)自上海生工公司，Ratanti-HHV8[LN35]抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司（抗LANA），山羊抗鼠IgG、DAPI購(gòu)自美國(guó)生命技術(shù)公司，Trizol購(gòu)自德國(guó)Qiagen公司，SuperScript III逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

SH-SY5Y細(xì)胞采用含10%FBS和1%青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，BCBL-1細(xì)胞、BJAB細(xì)胞為懸浮細(xì)胞，采用含10%FBS和1%青鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，BC3細(xì)胞采用含20%FBS和1%青鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，均常規(guī)培養(yǎng)在含5%CO2的37℃恒溫箱中。

1.2.2 誘導(dǎo)提取KSHV

提取BCBL-1細(xì)胞中的KSHV，用20ng/mL TPA刺激BCBL-1細(xì)胞72 h后，收集細(xì)胞液至離心管中，800 r/min，離心10 min。用不含TPA的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞于離心管中，在液氮與60℃水浴鍋中多次凍融細(xì)胞，促使細(xì)胞膜破裂，釋放病毒于上清液中，收集病毒上清液，16000 r/min，離心1 h，獲得的病毒液凍存在-80℃冰箱備用。

1.2.3 SH-SY5Y細(xì)胞感染

按照KSHV∶DMEM培養(yǎng)基=1∶5比例配制病毒濾液。將配置的病毒濾液加入到SH-SY5Y細(xì)胞液中，在含5%CO2的37℃恒溫箱中常規(guī)培養(yǎng)。將KSHV感染的SH-SY5Y細(xì)胞命名為SH-KSHVBCBL1。KSHV感染細(xì)胞48 h后，顯微觀察細(xì)胞并拍照，以未感染的細(xì)胞做對(duì)照。

1.2.4 RT-PCR

嚴(yán)格按照Trizol提取RNA的方法進(jìn)行操作，提取KSHV感染和未感染的SH-SY5Y細(xì)胞及BC3中提取總RNA，按照Super Script III逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作步驟將RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，采用PCR技術(shù)擴(kuò)增病毒裂解態(tài)的基因ORF26和潛伏態(tài)的LANA基因，BC3細(xì)胞作為陽性對(duì)照，β-actin作為內(nèi)對(duì)照，ORF26、LANA以及β-actin的引物序列見表1。RT-PCR的反應(yīng)條件為95 ℃，5 min；95 ℃，30 s，56 ℃，30 s，72 ℃，30 s，共計(jì)35個(gè)循環(huán)，然后72℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5% 的瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

1.2.5 間接免疫熒光（IFA）檢測(cè) LANA蛋白的表達(dá)

分別取 2×104個(gè) BC3、BJAB、SH-SY5Y 和感染KSHV后的SH-SY5Y細(xì)胞，使用4%的多聚甲醛固定細(xì)胞30 min，用1%triton-X-100破膜，接種在干凈的載玻片上使其干燥。一抗使用Rat anti-HHV8[LN35]（抗LANA，1∶25）滴加在固定細(xì)胞的載玻片上，4℃孵育過夜。第二天用吸水紙吸去一抗，1×PBS清洗細(xì)胞3 min×5次，二抗使用山羊抗鼠IgG（Alexa Fluor 594，1∶200），DAPI（1∶400），37 ℃孵育2 h。棄去二抗，PBS清洗細(xì)胞3 min×3次，用吸水紙吸取多余的PBS，封片，在激光共聚焦顯微鏡下觀察細(xì)胞并拍照。

1.2.6 細(xì)胞計(jì)數(shù)

消化KSHV感染與未感染的SH-SY5Y細(xì)胞，每種細(xì)胞分別同時(shí)接種于4個(gè)60 mm培養(yǎng)皿，每皿3×105個(gè)細(xì)胞，于接種后 1、3、5、7 d消化計(jì)數(shù)細(xì)胞，每次消化一皿細(xì)胞，去除細(xì)胞上清液，用PBS輕輕洗滌細(xì)胞，胰酶消化細(xì)胞3 min，利用臺(tái)盼藍(lán)染色，于Vi-CELL XR細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)并記錄細(xì)胞數(shù)，本實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)增殖數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，采用配對(duì)樣本的t檢驗(yàn)，其中P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 鏡下觀察KSHV感染與未感染的SH-SY5Y細(xì)胞形態(tài)

感染KSHV 48 h后，采用倒置顯微鏡觀察KSHV感染與未感染SH-SY5Y的細(xì)胞形態(tài)（200×），未感染的SH-SY5Y細(xì)胞呈梭形，表現(xiàn)為聚團(tuán)生長(zhǎng)，感染KSHV后，細(xì)胞變大，形態(tài)變圓，傾向于分散生長(zhǎng)（圖1）。

圖1 KSHV感染SH-SY5Y細(xì)胞形態(tài)改變情況（200×）Fig.1 Morphological changes in SH-SY5Y cells infected by KSHV（200×）

2.2 KSHV感染的SH-SY5Y細(xì)胞中ORF26與LANA的mRNA表達(dá)檢測(cè)

為了驗(yàn)證KSHV感染是否成功，同時(shí)檢測(cè)KSHV裂解態(tài)基因ORF26與潛伏態(tài)基因LANA的mRNA表達(dá)水平，我們從KSHV感染的SH-SY5Y細(xì)胞中提取了總RNA，以未感染的細(xì)胞為對(duì)照，以含有KSHV病毒的BC3細(xì)胞為陽性對(duì)照，采用RT-PCR擴(kuò)增ORF26和LANA。結(jié)果顯示，KSHV感染后的SH-SY5Y細(xì)胞中存在裂解態(tài)的ORF26基因的表達(dá)，同時(shí)也存在潛伏態(tài)的LANA基因的表達(dá)。這也證實(shí)了KSHV可以直接感染SH-SY5Y細(xì)胞（圖2）。

圖2 RT-PCR檢測(cè)ORF26和LANA mRNA的表達(dá)水平Fig.2 The expression levels of ORF26 and LANA mRNA by RT-PCR

2.3 采用IFA檢測(cè)SH-KSHVBCBL1細(xì)胞中LANA蛋白的表達(dá)

為了從蛋白質(zhì)水平進(jìn)一步證明KSHV感染的成功以及分析LANA蛋白的表達(dá)情況，我們采用了IFA技術(shù)檢測(cè)了SH-KSHVBCBL1中的LANA蛋白水平。BC3細(xì)胞自身帶有KSHV，我們以BC3為陽性對(duì)照，以無KSHV的BJAB細(xì)胞為陰性對(duì)照，同時(shí)檢測(cè)LANA蛋白的表達(dá)，以不加LANA一抗而只加二抗的細(xì)胞排除因二抗造成的陽性信號(hào)。采用激光共聚焦顯微鏡在各細(xì)胞中檢測(cè) Alexa fluor 594，紅色為陽性信號(hào)。結(jié)果顯示BC3細(xì)胞可見明顯的LANA基因表達(dá)，BJAB細(xì)胞未出現(xiàn)LANA基因的表達(dá)（圖3A）。SH-KSHVBCBL1細(xì)胞中有LANA基因的表達(dá)，未感染KSHV的SH-SY5Y細(xì)胞無LANA基因的表達(dá)，只加二抗的細(xì)胞均未見陽性信號(hào)，這些結(jié)果證實(shí)了KSHV可以感染SH-SY5Y細(xì)胞，并可表達(dá)LANA蛋白（圖 3B）。

圖3 IFA檢測(cè)LANA蛋白的表達(dá)水平Fig.3 IFA detected the level of LANA protein expression

2.4 KSHV感染對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞增殖能力的影響

接種相同的SH-SY5Y細(xì)胞數(shù)目，在感染KSHV后的1、3、5、7 d分別計(jì)數(shù)細(xì)胞，結(jié)果如圖1所示。

圖4 感染與未感染KSHV的神經(jīng)元細(xì)胞SH-SY5Y不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞計(jì)數(shù)Fig.4 The cell count at different time points in the infected and uninfected KSHV neuron cell SH-SY5Y

由圖4可知：在培養(yǎng)1天后，兩種細(xì)胞數(shù)目差別不大，但在培養(yǎng)3天后，感染KSHV的SH-SY5Y細(xì)胞數(shù)目明顯高于未感染組細(xì)胞(P<0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義)，說明感染KSHV感染促進(jìn)了細(xì)胞的增殖（圖4）。

3 討論

新疆是我國(guó)KSHV的高感染區(qū)[7]，新疆的卡波氏肉瘤患者KSHV的感染率高達(dá)91.67%[15]，正常人群的感染率為25.9%[12]，大量研究表明，KSHV感染細(xì)胞后導(dǎo)致細(xì)胞因子合成和分泌增加，促進(jìn)細(xì)胞增殖分化。血管內(nèi)皮細(xì)胞增生可導(dǎo)致卡波氏肉瘤，B細(xì)胞增生可引發(fā)淋巴細(xì)胞瘤，上皮細(xì)胞增生發(fā)展為鱗狀上皮細(xì)胞癌[16]。

KSHV感染細(xì)胞后主要以兩種方式存在，即持續(xù)的潛伏感染（潛伏態(tài)）和短暫的裂解感染（裂解態(tài)）。潛伏態(tài)的病毒為了逃避宿主細(xì)胞免疫應(yīng)答，保護(hù)病毒的持續(xù)存活，基因組以共價(jià)環(huán)狀形式游離于細(xì)胞染色體之外，僅表達(dá)有限的蛋白；而裂解態(tài)的病毒基因組演變?yōu)榫€性DNA，便于病毒大量而快速的復(fù)制[17]。KSHV潛伏態(tài)與裂解態(tài)的作用不同，編碼與表達(dá)不同的致病蛋白。KSHV潛伏態(tài)編碼的致病蛋白主要為ORF73編碼的潛伏相關(guān)核抗原（LANA）；裂解態(tài)編碼的致病蛋白包括 ORFK1、ORFK2編碼的白介素-6（vIL-6）、ORF26編碼的小衣殼蛋白、ORF74編碼的病毒G蛋白偶聯(lián)受體(vGPCR)和ORF16表達(dá)的皰疹病毒家族的BCL-2（vBCL-2）等。其中，ORF26、ORF75可作為 KSHV 檢測(cè)的診斷依據(jù)[18]。在體內(nèi)，大多數(shù)細(xì)胞都處于潛伏態(tài)，只有約1%-5%的原發(fā)性滲出性淋巴瘤細(xì)胞和5%-10%的多中心Castleman’s病細(xì)胞中KSHV會(huì)自發(fā)的進(jìn)入裂解態(tài)[16，19]。而在體外，KSHV感染成功的細(xì)胞中，KSHV均保持了潛伏態(tài)感染，但在特殊的環(huán)境和生理因素下，如缺氧、炎癥性細(xì)胞因子和TPA等因素的刺激下，潛伏態(tài)病毒可進(jìn)入裂解復(fù)制期[20-21]。

目前發(fā)現(xiàn)的KSHV主要感染的細(xì)胞為B淋巴細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞，隨著皰疹病毒家族成員表現(xiàn)出的嗜神經(jīng)傾向，有研究者開始關(guān)注KSHV與中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染的關(guān)系，Volpi A[22]利用PCR技術(shù)檢測(cè)到KSHV血清陽性患者的腦組織樣本中存在KSHV感染，BrinkNS等[23]在伴隨有艾滋病病人的腦脊髓中擴(kuò)增到KSHV的DNA。這些研究都是PCR技術(shù)，PCR技術(shù)無法區(qū)分病毒感染的是腦組織中的血管內(nèi)皮細(xì)胞或免疫細(xì)胞造成PCR結(jié)果陽性，還是病毒感染的是腦細(xì)胞本身，并未直接證明KSHV對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞的感染，也未進(jìn)行其感染的功能研究。

我們的研究是為了確定KSHV能夠感染神經(jīng)元細(xì)胞并表達(dá)病毒基因。ORF26為KSHV晚期裂解基因，基因序列相對(duì)保守，促進(jìn)病毒的裂解復(fù)制并感染新的細(xì)胞，這可能與細(xì)胞增殖能力變強(qiáng)有關(guān)。LANA基因能夠與ORF50編碼KSHV分子開關(guān)的立早蛋白R(shí)TA（Replication and Transcription Activator，RTA）競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合Norch信號(hào)通路的轉(zhuǎn)錄抑制子RBP-Jκ蛋白上的結(jié)合位點(diǎn)來抑制RTA的自我活化，最終使得RTA不能有效的激活裂解態(tài)基因的表達(dá)從而持續(xù)保持病毒的潛伏態(tài)，形成中樞神經(jīng)系統(tǒng)KSHV儲(chǔ)存池而造成神經(jīng)元細(xì)胞持續(xù)感染，引發(fā)其功能障礙。

本研究利用免疫熒光檢測(cè)LANA蛋白和PCR擴(kuò)增ORF26與LANA結(jié)果表明KSHV成功感染了神經(jīng)元細(xì)胞SH-SY5Y并表達(dá)病毒基因，這些為進(jìn)一步闡明KSHV感染伴發(fā)神經(jīng)系統(tǒng)疾病提供新的思路，也為進(jìn)一步研究KSHV感染在神經(jīng)系統(tǒng)型疾病進(jìn)展中的作用提供理論依據(jù)。

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