牛種布魯氏菌2308參考株ΔVceC基因缺失株的構(gòu)建與鑒定

李敏，史靜雪，李志強，荊明龍，劉洋，陳創(chuàng)夫，張輝

（石河子大學(xué)動物科技學(xué)院/動物疾病防控兵團重點實驗室，新疆 石河子 832003）

布魯氏菌?。˙rucellosis）是人和牛、羊、豬等動物共患的傳染病，也是國家法定檢疫和撲殺被感染家畜的三大疫?。谔阋?、布魯氏菌病和結(jié)核病）之一[1]。近年來，該病在全球范圍呈不斷上升的趨勢，世界200多個國家和地區(qū)中有170多個國家和地區(qū)有布病存在和流行，引起各國政府及研究機構(gòu)的廣泛關(guān)注。

布魯氏菌是革蘭氏陰性菌，為球桿菌或短桿菌，無鞭毛，也不形成芽孢，一般無莢膜也不產(chǎn)生外毒素。根據(jù)其流行病學(xué)特點、宿主偏嗜性以及基因組結(jié)構(gòu)上的差異，分為 9個種，其中對陸生動物具有致病性的有7個種，即牛種布魯氏菌（Brucella abortus）、羊種布魯氏菌（B.melitensis）、豬種布魯氏菌（B.suis）、綿羊附睪種布魯氏菌（B.ovis）、犬種布魯氏菌（B.canis）、沙林鼠種布魯氏菌（B.neotomae）和田鼠種布魯氏菌（B.microti）。對海洋動物具有致病性的有 2個布魯氏菌種，即鯨型布魯氏菌（B.ceti）和鰭型布魯氏菌（B.pinnipedialis）[2]。毒力相關(guān)因子主要是脂多糖、外膜蛋白、Ⅳ型分泌系統(tǒng)、Bvr R/Bvr S雙組分系統(tǒng)、過氧化氫酶、超氧化物歧化酶等應(yīng)激反應(yīng)蛋白，以及密度感應(yīng)系統(tǒng)等[3]。布魯氏菌的 T4SS對其逃避免疫監(jiān)視和持續(xù)性感染發(fā)揮重要作用[4]，IV型分泌系統(tǒng)能分泌復(fù)雜的效應(yīng)因子(類似于核蛋白復(fù)合體或蛋白質(zhì)類)來干預(yù)宿主細胞的功能。

為了更好的研究T4SS效應(yīng)蛋白的功能，本研究以牛種布魯氏2308為親本株，運用同源重組的方法，針對IV型分泌系統(tǒng)的 VceC基因，構(gòu)建 2308-△VceC基因缺失突變株，旨在進一步研究IV型分泌系統(tǒng)分泌蛋白，為探索布魯氏菌IV型分泌系統(tǒng)功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

大腸桿菌DH5α、牛種布魯氏菌由本實驗室保存，PMD19-T（sample）載體購自 TaKaRa公司，PUC19K 載體由北京軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院饋贈。

1.1.2 主要試劑

Taq DNA聚合酶、Pfu聚合酶、DNA Marker均購自TaKaRa；快速瓊脂糖凝膠 DNA回收試劑盒、高純度質(zhì)粒小提取試劑盒、dNTP均購自天根生化科技有限公司；瓊脂糖購自上海生物技術(shù)工程有限公司；布魯氏菌液體（Brucella Broth）和布魯氏菌固體培養(yǎng)基（Brucella Agar）購自美國BD公司；氨芐青霉素和卡那青霉素均購自Sigma公司；其他為國產(chǎn)分析純化。

1.2 方法

1.2.1 引物合成

在GeneBank上查找到卡那抗性基因序列和牛種布魯氏菌標(biāo)準株2308的VceC基因（BAB1_1058）上下游同源臂基因序列，用Primer 5設(shè)計引物，引物由生工生物工程股份有限公司合成。引物序列見表1。

表1 引物和序列Tab.1 Primers and sequence

1.2.2 VceC基因上下游同源臂和卡那抗性基因的擴增

用牛種布魯氏菌 2308基因組為模板，以VceC-N-F、VceC-N-R為引物擴增VceC基因上游同源臂；以VceC-C-F、VceC-C-R為引物擴增 VceC 基因下游同源臂。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5 min；94℃變性 40 s，59 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 1 min，30個循環(huán)；72℃總延伸10 min；最后4℃保存。

以PUC19K質(zhì)粒為模板，以Kan-F、Kan-R為引物擴增卡那抗性基因，反應(yīng)條件為：預(yù)變性95℃ 5 min；變性 94 ℃ 40 s，退火 58 ℃ 30 s，延伸 72℃ 1 min 20 s，總延伸 72℃ 10 min，30個循環(huán)；最后 4℃ 保存；反應(yīng)擴增結(jié)束后，PCR產(chǎn)物于1.5%瓊脂糖凝膠中電泳。用DNA回收試劑盒說明書回收目的基因。

1.2.3 VceC基因上游同源臂、卡那抗性基因和下游同源臂基因的融合

用VceC基因上游同源臂、卡那抗性基因和下游同源臂基因的膠回收產(chǎn)物按1∶1∶1混合作為模板進行融合擴增，PCR擴增分為2輪。

第一輪PCR反應(yīng)條件為：預(yù)變性 95℃ 5 min；變性 94℃ 30 s，退火 62℃ 30 s，延伸 72 ℃ 60 s，72℃總延伸10 min，10個循環(huán)，最后4℃保存。得到缺失突變盒VceC-K。

第二輪反應(yīng)是以第一輪PCR反應(yīng)的產(chǎn)物為模板，以VceC-N-F和VceC-C-R為引物進行擴增，反應(yīng)條件為：預(yù)變性 95℃ 5 min；變性 94℃ 40 s，退火57℃ 30 s，延伸 72℃ 3 min，72℃總延伸10 min，30個循環(huán)；最后4℃保存。擴增結(jié)束后，PCR產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠中電泳。電泳產(chǎn)物根據(jù)DNA回收試劑盒說明書進行操作回收。

1.2.4 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

將回收的缺失突變盒VceC-K與PMD19-T載體相連，連接體系（10 μL），連接產(chǎn)物于16℃水浴鍋中過夜連接；將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α中，涂平板（卡那霉素50 μg/mL、氨芐青霉素50 μg/mL），37℃倒置培養(yǎng)過夜。

從過夜培養(yǎng)的平板中挑取單個菌落，接種于800 μL含氨芐和卡那抗性的LB液體培養(yǎng)基中；37℃、120r/min培養(yǎng) 4h后，以 VceC-N-F和VceC-C-R為引物進行菌液PCR鑒定，產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠電泳。將鑒定為陽性的菌液和質(zhì)粒測序分析。

1.2.5 牛種布魯氏菌2308-△VceC缺失突變株的構(gòu)建

將測序正確的重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)入牛種布魯氏菌2308感受態(tài)中，并且涂平板與含有卡那抗性的布魯氏菌固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)3-5 d，挑取卡那抗性平板上單克隆菌落接種于含有卡那抗性的布魯氏菌液體培養(yǎng)基中，37℃搖菌24 h后取100 μL菌液85℃滅活1 h為模板，以VceC-N-F和Kan-R為引物進行PCR擴增鑒定。經(jīng)過初步篩選的布魯氏菌突變株經(jīng)過15次反復(fù)傳代培養(yǎng)后，分別用外部檢測引物和內(nèi)部檢測引物對布魯氏菌菌進行PCR鑒定和遺傳穩(wěn)定性分析。

1.2.6 牛種布魯氏菌2308-△VceC缺失突變株生長特性檢測

分別挑取2308和2308-△VceC缺失突變株單克隆菌落接種于布魯氏菌液體培養(yǎng)基中，200 r/min 37℃培養(yǎng)到OD600=0.8時，然后均稀釋到OD600=0.1，繼續(xù)搖床培養(yǎng)，間隔2 h收樣測定1次OD600值，直至生長到平臺期為止并繪制布魯氏菌的生長曲線圖。

1.2.7 牛種布魯氏菌2308-△VceC缺失突變株侵染人胚胎滋養(yǎng)層細胞的CFU計數(shù)

將長勢良好的胚胎滋養(yǎng)層細胞（HPT-8）傳到六孔板中，每孔細胞量為106個，加入生長至對數(shù)生長期的布魯氏菌2308和2308-△VceC的菌量為108作用 1 h，然后每孔加入慶大霉素 5 μL（2.5 μL/mL）作用45 min再更換新鮮的細胞培養(yǎng)液，此時開始計時到3、12、24 h時用0.1%曲達通裂解細胞涂布魯氏菌固體培養(yǎng)基，37℃倒置培養(yǎng)3-5 d，進行CFU計數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 VceC基因的上、下游同源臂和卡那抗性基因的擴增

以布魯氏菌2308基因組為模板對VceC基因的上、下游同源臂序列進行PCR擴增，獲得大小分別約為517和546 bp的片段，與布魯氏菌VceC基因上下游同源臂的理論值相符，結(jié)果見圖1、2。以PUC19K為模板擴增卡那抗性基因，獲得的基因片段約為1093 bp，結(jié)果見圖3。

圖1 PCR擴增VceC基因上游同源臂Fig.1 PCR amplification upstream homology arms of VceC gene

圖2 PCR擴增VceC基因的下游同源臂Fig.2 PCR amplification downstream homology arms of VceC gene

圖3 Kan基因的擴增Fig.3 Amplication Kan gene

2.2 VceC基因上、下游同源臂和卡那基因的融合擴增與載體的構(gòu)建

PCR技術(shù)進行融合擴增，獲得大小約2156 bp的基因序列，與VceC上下游同源臂和卡那抗性基因序列疊加的理論值一致，結(jié)果見圖4。將融合片段與PMD19-T載體連接轉(zhuǎn)化到DH5α，獲得的重組載體PMD19-T-ΔVceC-Kan經(jīng)菌液驗證與疊加片段大小相同，結(jié)果見圖5。

圖4 VceC-N-K-C融合PCRFig.4 Fusion PCR of VceC-N-K-C

2.3 布魯氏菌2308-ΔVceC基因突變株的初步篩選鑒定

將PMD19-T-ΔVceC-Kan質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化到布魯氏菌2308感受態(tài)中，通過VceC基因上下游同源臂基因的互換，卡那抗性基因替換出染色體上的VceC基因，利用卡那抗性來篩選并獲得的突變株2308-ΔVceC， 用 VceC-N-F和 Kan-R分 別 對2308-ΔVceC和2308進行擴增鑒定，結(jié)果顯示，突變株2308-ΔVceC可擴增出大小為1774的特異片段，而親本株2308未擴增出來（圖6），表明抗性基因正確替換了VceC基因。

圖6 △VceC缺失株的篩選鑒定Fig.6 Screening and identification of deletion strain△VceC

2.4 布魯氏菌2308-ΔVceC基因突變株傳代

將鑒定正確的突變株2308-ΔVceC傳代到第15代，在傳代培養(yǎng)過程中與親本株比較，肉眼未見變化，比如突變株的生長速度，大小形態(tài)和菌落顏色等特征。分別用內(nèi)部檢測引物（VceC-F、VceC-R）和外部檢測引物（VceC-N-F、Kan-R）對每傳一代的菌液進行PCR驗證，內(nèi)部檢測引物只有2308株出現(xiàn)特異性條帶而外部檢測引物只有2308株未出現(xiàn)特異性條帶，達到了預(yù)想的結(jié)果（圖7、8），說明成功獲得了2308-ΔVceC突變株，并且基因突變株經(jīng)過15代連續(xù)培養(yǎng)后未發(fā)生回復(fù)突變現(xiàn)象，即2308-ΔVceC可進行穩(wěn)定遺傳。

圖5 同源重組載體PMD19-T-ΔVceC-Kan的菌液PCR鑒定Fig.5 Bacteria PCR identification homologous recombination vectors PMD19-T-ΔVceC-Kan

圖7 內(nèi)部引物檢測缺失株Fig.7 Internal primer detection deletion strain

圖8 外部引物檢測缺失株Fig.8 External primers to detect deficient strains

2.5 布魯氏菌2308-ΔVceC基因突變株生長特性檢測

圖9 牛種布魯氏菌2308-ΔVceC缺失突變株與親本株2308的生長曲線Fig.9 The growth curve ofB.abortus2308-ΔVceC strain andB.abortus2308 strain

由圖9可見，牛種布魯氏菌2308-ΔVceC和它的親本株2308生長趨勢基本一致，12 h時進入對數(shù)生長期，30 h時進入平臺期。

2.6 牛布魯氏菌2308-ΔVceC基因突變株侵染HPT-8細胞

用布魯氏菌2308-ΔVceC基因突變株和其本株以50∶1的侵染復(fù)數(shù)侵染HPT-8細胞，在侵染后3、12、24 h時用曲達通裂解細胞收樣，并且梯度稀釋至102和103，分別涂于布魯氏菌固體培養(yǎng)基，培養(yǎng)3-5 d數(shù)菌落數(shù)。計算log值繪制柱狀圖（圖10），侵染12 h后缺失株胞內(nèi)細菌數(shù)量明顯下降（P＜0.01）。12 h時親本株2308和2308-ΔVceC缺失突變株差異顯著（P＜0.05）。

圖10 牛布魯氏菌2308-ΔVceC和2308在HPT-8細胞中的存活能力Fig.10 The survival ability ofB.abortus2308-ΔVceC strain andB.abortus2308 strain in cell HPT-8

3 討論

布魯氏菌病是由布魯氏菌引起的一種動物源性人畜共患傳染病。該病的典型癥狀是波浪熱，動物發(fā)病后最顯著癥狀是引起懷孕母蓄流產(chǎn)和公畜發(fā)生睪丸炎、附睪炎或關(guān)節(jié)炎[4]。人感染布病后，也可導(dǎo)致流產(chǎn)和不育，而且病程長、反復(fù)發(fā)作、長期不愈，嚴重危害畜牧業(yè)的發(fā)展和人類健康。布魯氏菌T4SS最早在B.suis基因組中發(fā)現(xiàn)，位于II號染色體上，是12種蛋白組成的蛋白復(fù)合體[5]。Ⅳ型分泌系統(tǒng)主要是通過分泌各種效應(yīng)分子來逃避宿主細胞的防御機制，對于致病性細菌而言，這些分泌性的蛋白幫助細菌發(fā)揮定殖、吸附等作用，還可以調(diào)理宿主細胞，逃逸宿主的免疫機制等[6-8]。

VceC和Vce A是第一次被鑒定出的布魯氏菌T4SS分泌蛋白，其感染布魯氏菌后，VceC最先進入巨噬細胞[9]。研究人員發(fā)現(xiàn)VceC被轉(zhuǎn)運到巨噬細胞中，引起 LDH 釋放增加，顯示了其細胞毒性，張沾等[10，13]在VceC的研究中也發(fā)現(xiàn)其對人的胚胎滋養(yǎng)層細胞具有毒性。研究還證明VceC能夠與細胞的Bip蛋白結(jié)合，布魯氏菌利用VceC募集 Bip，從而引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的未折疊反應(yīng)（UPR），內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)被破壞。本研究以牛種布魯氏菌2308為基礎(chǔ)構(gòu)建分泌蛋白VceC的基因缺失突變株為進一步研究T4SS的分泌蛋白功能提供相關(guān)數(shù)據(jù)。

本研究根據(jù)同源重組的原理構(gòu)建了牛種布魯氏菌2308-△VceC基因缺失突變株，布魯氏菌是胞內(nèi)寄生菌，無質(zhì)粒，而且大多數(shù)外源的質(zhì)粒不能在其中復(fù)制，所以很多質(zhì)粒均可作為自殺載體來構(gòu)建布魯氏菌的基因突變株[12，15-16]，不同于傳統(tǒng)的缺失突變株構(gòu)建載體，本研究中利用T載體來構(gòu)建牛種布魯氏菌2308-△VceC基因缺失突變株，抗性基因替換的方法避免了質(zhì)粒整合帶來的問題，此方法較傳統(tǒng)構(gòu)建自殺載體的方法更加簡便快速[13-14]，無需酶切連接的過程，簡化了突變載體構(gòu)建的步驟，同時的檢出假陽性概率低的優(yōu)點，可大幅提高研究VceC基因功能的效率，而且此方法具有一個篩選標(biāo)記，通過篩選可容易得到突變株[13]。

本研究還進一步研究了牛種布魯氏菌2308-△VceC基因缺失突變株和其親本株在生長特性上的區(qū)別，由圖9可見突變株和親本株在生長趨勢上無顯著區(qū)別，基本趨于一致，所以VceC基因的缺失，不會對牛種布魯氏菌2308的生長規(guī)律或生長狀態(tài)產(chǎn)生較大影響。其對HPT-8細胞的侵襲力，根據(jù)胞內(nèi)CFU計數(shù)結(jié)果，12 h時缺失株在胞內(nèi)的存活率開始下降而其親本株卻開始增殖復(fù)制，親本株2308和2308-ΔVceC缺失突變株在12 h時差異顯著。這可能與布魯氏菌VceC蛋白的功能密切相關(guān)。本研究可為布魯氏菌致病機制的研究奠定一定的基礎(chǔ)。

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