LPXTG基序蛋白lmo0160基因缺失對單增李斯特菌生物膜形成的影響

張奇文 ，凌晨 ，馬勛 *，薄新文 ，杜冬冬 ，錢凌霄 ，李紅歡

（1石河子大學動物科技學院，新疆 石河子 832003；2新疆天康畜牧生物技術(shù)股份有限公司，新疆 烏魯木齊，830013；3省部共建綿羊遺傳改良與健康養(yǎng)殖國家重點實驗室/新疆農(nóng)墾科學院，新疆 石河子 832000）

單增李斯特菌(Listeria monocytogenes，LM)是一種胞內(nèi)寄生革蘭氏陽性短桿菌，可寄生在蜱、蠅、昆蟲、魚及甲殼動物體內(nèi)，是引起人和動物致病的重要食源性人畜共患病病原菌[1]。該菌具有較強的環(huán)境適應性，可在低溫、高鹽、酸堿等不利的環(huán)境條件下生長繁殖，可穿越機體三大屏障，引起菌血癥，并引發(fā)全身性感染，如敗血癥、腦膜腦炎、胎膜炎等[2-3]，對新生兒、妊娠母畜和免疫功能不全者等易感動物的發(fā)病率和死亡率均較高[4]。該菌被世界衛(wèi)生組織列為僅次于大腸桿菌O157、沙門氏菌、志賀氏菌后的第四大重要的食源性致病菌[5]。

生物膜(biofilm，BF)，是指細菌粘附于生物或非生物表面，分泌多糖基質(zhì)、纖維蛋白、脂質(zhì)蛋白等，將其自身包繞其中而形成的大量細菌聚集膜樣物，是微生物生活時所采取的一種特殊生存狀態(tài)[6-7]。LM在適宜環(huán)境下可形成生物膜，為細菌提供有效庇護所，還能使細菌獲得抵抗逃避宿主防御能力和普通抗菌藥物。因其抗性強和難清除，從而造成較嚴重的危害[8]。生物膜多與李氏桿菌病有關(guān)，傳統(tǒng)的食品加工原輔料富含營養(yǎng)物質(zhì)，為LM生物膜的形成及生長創(chuàng)造有利條件[9]，LM生物膜使其對消毒劑及光、熱、紫外線等的耐受性顯著增強，傳統(tǒng)的殺菌策略不能有效的處理生物膜，在臨床上形成持續(xù)感染，對人類公共衛(wèi)生和畜牧業(yè)發(fā)展造成嚴重危害。

LM有一類表面蛋白，其前體蛋白C端含有保守基序LPXTG(Leu-Pro-X-Thr-Gly)，這些蛋白由分選酶(SortaseA，SrtA)通過識別LPXTG保守基序，將蛋白共價結(jié)合到細胞壁肽聚糖上，呈現(xiàn)在細胞表面，在感染機體過程中發(fā)揮重要毒力作用[10]。LM基因組序列分析預測，有41個LPXTG保守基序蛋白，其中InlF[11]，InlJ[12]，LapB[13]，Lmo1413[14]，actA[15]等部分蛋白的功能已被研究。

本研究通過對LPXTG基序表面蛋白Lmo0160的分子結(jié)構(gòu)特征及結(jié)構(gòu)域的初步分析，可推測Lmo0160的膠原蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域可能在生物膜形成中發(fā)揮作用。因此，本研究通過SOE-PCR及同源重組技術(shù)構(gòu)建LM90SB2的Δlmo0160基因缺失株，并分析野生株和lmo0160基因缺失株生物膜形成能力的變化，為進一步了解LM生物膜及其致病性提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒

LM90SB2分離株是新疆致綿羊腦炎單增李斯特菌分離株，由石河子大學動物科技學院實驗室分離、鑒定并保存，血清型為4b型；穿梭質(zhì)粒pKSV7載體由浙江大學動物科學學院分子微生物與食品安全衛(wèi)生實驗室保存惠贈；pMD19-T(Simple)載體購自大連寶生物 (Takara)公司；大腸桿菌(Escherichia coli)DH5α購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.1.2 培養(yǎng)基與試劑

質(zhì)粒小提取試劑盒、細菌基因組DNA提取試劑盒等購自天根生化科技有限公司(北京)；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購自北京諾維森生物科技有限公司；DNA Marker、Pfu DNA 高保真聚合酶、dNTPs等購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；2×PCR Mix購自上海東盛公司；限制性內(nèi)切酶 (BamHⅠ和PstⅠ)、T4 DNA連接酶等購自Promega生物技術(shù)有限公司 (上海)；氨芐青霉素、氯霉素等購自美國Sigma公司；腦心浸液培養(yǎng)基（brain heart infusion broth，BHI）、胰蛋白胨、酵母浸粉等購自北京陸橋技術(shù)股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計與合成

參照GenBank中參考菌株F2365和EGD-e的序列（ID：AE017262和 AL601824），應用 Primer 5.0軟件設(shè)計用于擴增lmo0160基因上下游同源臂片段、驗證缺失株以及LM的特異性引物，在lmo0160-F1和lmo0160-R2的 5’端分別引入 BamHⅠ和 PstⅠ(斜體下劃線部分)和保護性堿基(斜體部分)(表1)，由上海生工有限公司合成。

表1 構(gòu)建LM90SB2 lmo0160基因缺失株特異性引物Tab.1 Specific primers for construction of lmo0160 gene deletion strain of LM90SB2

1.2.2 lmo0160基因上下游同源臂的擴增

用細菌基因組DNA提取試劑盒提取LM90SB2的基因組 DNA，用 lmo0160-F1、lmo0160-R1、lmo0160-F2和lmo0160-R2分別擴增上、下游同源臂片段；25 μL 反 應 體 系 ：10×PCR Buffer2.5 μL，PfuDNA 高保真聚合酶 1 μL，dNTPs 1 μL，DNA 模板2 μL，上下游引物各 1 μL，ddH2O 16.5 μL。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠后，用膠回收試劑盒回收。

1.2.3 lmo0160基因缺失片段的擴增、克隆及測序

以上下游同源臂為模板，采用20 μL反應體系：10×PCR Buffer 2 μL，dNTPs 2.5 μL，上下游同源臂各 3 μL，TapDNA 聚合酶 0.5 μL，ddH2O 9 μL。反應條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，61 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，12個循環(huán)；72 ℃ 10 min。然后加入lmo0160-F1和 lmo0160-R2引物各 0.5 μL擴增 30個循環(huán)。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收后，與pMD19-T(Simple)載體連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中。挑取單菌落擴大培養(yǎng)提取質(zhì)粒，通過 PCR(lmo0160-F1和 lmo0160-R2)和BamHⅠ、PstⅠ雙酶切鑒定后篩選出陽性克隆菌，送北京六合華大基因科技有限公司測序。將測序正確的陽性克隆菌命名為pMD19-T-Δlmo0160。

1.2.4 pKSV7重組穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建

分別將pMD19-T-Δlmo0160和pKSV7穿梭質(zhì)粒用BamH Ⅰ和PstⅠ置于37℃水浴中雙酶切，酶切3 h后，加入 4 μL 10×Loading buffer終止酶切反應，經(jīng)凝膠電泳驗證正確后切膠回收目的條帶，利用T4 DNA連接酶將酶切后的 lmo0160片段連入pKSV7載體；然后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中，經(jīng)菌液 PCR(lmo0160-F1和 lmo0160-R2)和雙酶切驗證成功后，送北京六合華大基因科技有限公司測序。

1.2.5 電轉(zhuǎn)后陽性轉(zhuǎn)化子篩選與鑒定

參照文獻[16]制備單增李斯特菌LM90SB2感受態(tài)細胞。取10 μL pKSV7-Δlmo0160重組穿梭質(zhì)粒加入100μL LM90SB2感受態(tài)細胞中，并將其混勻后加到處理好的電轉(zhuǎn)杯中，冰浴10 min，電轉(zhuǎn)化(2.5 kV，5 ms)后，加入 1 mL BHI(含 0.5 mol/L蔗糖)液體培養(yǎng)基，冰浴30 min后轉(zhuǎn)置30℃恒溫培養(yǎng)箱靜置3 h，8000 r/min離心5 min，棄上清，剩余菌體涂布于BHI瓊脂平板 (含10 μg/mL氯霉素)，30 ℃培養(yǎng)48 h，挑取單菌落置30℃過夜培養(yǎng)，通過菌液PCR(lmo0160-F1和lmo0160-R2)篩選出陽性轉(zhuǎn)化子。

1.2.6 同源重組及l(fā)mo0160基因缺失株的鑒定

將上述鑒定的陽性轉(zhuǎn)化子接種于BHI液體培養(yǎng)基，在溫度(42℃)和氯霉素抗性(10 μg/mL)的雙重壓力下進行同源重組。傳代培養(yǎng)25代后，挑單菌落，菌液PCR篩選出有氯霉素抗性的單交換重組菌。然后在無氯霉素抗性BHI液體培養(yǎng)基中30℃培養(yǎng)，以丟失抗性質(zhì)粒。通過影印接種于抗氯霉素和不抗氯霉素BHI板篩選出無抗性的缺失株，再經(jīng)驗證引物和LM特異性引物PCR進一步鑒定。最終得到正確基因缺失株LM90SB2-Δlmo0160。

1.2.7 缺失株生長曲線

挑取LM90SB2、LM90SB2-Δlmo0160單菌落接種于BHI液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至OD600nm≈0.4，以1∶100的比例分別接種于20 mL BHI液體培養(yǎng)基中，37℃恒溫細菌振蕩培養(yǎng)箱(180 r/min)培養(yǎng)，每 2 h取 200 μL菌液加入 96孔板中測定 600 nm波長處的光密度值（OD600nm），根據(jù)不同時間點的OD600nm值，繪制生長曲線。設(shè)置平行組，重復3次。

1.2.8 結(jié)晶紫染色法觀察生物膜形態(tài)

將 LM90SB2、LM90SB2-Δlmo0160 菌液以 1∶100的比例分別接種于新鮮配制BHI液體培養(yǎng)基中，使其 OD600nm≈0.2(約 109CFU/mL)，取 8 mL 菌液分別加入放置有8個無菌蓋玻片的90 mm無菌培養(yǎng)皿中，37 ℃培養(yǎng)，分別于 8、12、24和 48 h，無菌取出2個蓋玻片于平皿中，加5 mL PBS輕輕晃動，去除懸浮和粘附不牢固的細菌，置55℃干燥箱中干燥30 min，加入1%結(jié)晶紫于室溫染色30 min，棄結(jié)晶紫染液，用PSB洗滌5次，室溫下干燥30 min，重復3次。置于顯微鏡下觀察生物被膜的形態(tài)，拍照并記錄。

1.2.9 結(jié)晶紫染色法測定生物膜形成能力

取200 μL OD600nm≈0.2菌液加入到 96孔微孔板中，每個樣品分3組，每組設(shè)置12個平行重復，并封閉微孔板周圍，37℃靜置培養(yǎng)，分別于 8、12、24和48 h；棄孔中培養(yǎng)基，加入200 μL PBS洗滌3次，去除浮游菌體，55℃干燥箱中干燥30 min，然后每個孔中分別加入150 μL 1%結(jié)晶紫溶液，在室溫下染色 30 min，棄染色液，再用 200 μL PBS洗滌5次，55℃干燥箱中干燥30 min；再加入150 μL 95%乙醇脫色30 min，用酶標儀測定其OD570nm值，重復3次。

1.2.10 數(shù)據(jù)處理

利用Graphpad軟件繪制折線圖和柱形圖，lmo0160基因缺失菌株和野生菌株的生長曲線和生物被膜定量數(shù)據(jù)分析均采用T檢驗法進行比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 lmo0160基因上下游同源臂融合

以 lmo0160-F1 和 lmo0160-R1、lmo0160-F2 和lmo0160-R2為引物分別擴增上、下游同源臂，經(jīng)凝膠電泳分別得到479 bp單一目的條帶(圖1)。SOE-PCR融合上、下游同源臂，lmo0160-F1和lmo0160-R2為引物PCR擴增上下游同源臂融合片段，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳得到大小約為958 bp(圖2)。經(jīng)測序、序列比對分析表明上下游同源臂已成功融合。

圖1 lmo0160基因上下游同源臂PCR擴增結(jié)果Fig.1 Homologous arms amplified of lmo0160 gene by PCR

圖2 lmo0160重疊延伸PCR擴增結(jié)果Fig.2 Products amplification of lmo0160 by SOE-PCR

2.2 重組穿梭質(zhì)粒 pKSV7-Δlmo0160構(gòu)建及鑒定

Δlmo0160與pMD19-T(Simple)載體連接后，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α中，經(jīng)PCR鑒定為陽性的菌液，提取質(zhì)粒經(jīng)雙酶切鑒定得到2692和958 bp 2個條帶(圖3)，將測序正確重組質(zhì)粒命名為pMD19-T-Δlmo0160。將同步雙酶切膠回收后的Δlmo0160與pKSV7載體連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α中，PCR篩選出陽性菌液，提取質(zhì)粒雙酶切鑒定得到6900和958 bp 2個條帶(圖4)，表明重組穿梭質(zhì)粒pKSV7-Δlmo0160成功構(gòu)建。

圖3 pMD19-T-Δlmo0160雙酶切鑒定Fig.3 Identification of pMD19-T-Δlmo0160 by double enzyme digestion

圖4 pKSV7-Δlmo0160雙酶切鑒定Fig.4 Identification of pKSV7-Δlmo0160 by double enzyme digestion

2.3 LM90SB2-Δlmo0160缺失株篩選及鑒定

經(jīng)電轉(zhuǎn)化將pKSV7-Δlmo0160重組載體導入單增李斯特菌感受態(tài)細胞內(nèi)，增菌后，挑取單菌落進行PCR(lmo0160-A和lmo0160-B)鑒定，篩選出的陽性轉(zhuǎn)化子可擴增得到2841和1133 bp目的條帶(圖5A)；含pKSV7-Δlmo0160質(zhì)粒的LM90SB2菌株，在溫度和氯霉素抗性雙重壓力下發(fā)生同源重組，可獲得無氯霉素抗性和不含pKSV7和lmo0160基因的LM90SB2-Δlmo0160菌株，經(jīng) PCR擴增得到 1條1133 bp目的條帶，表明成功構(gòu)建了LM90SB2-Δlmo 0160缺失株 (圖5B)；37℃無抗性傳代培養(yǎng)25代，菌液PCR檢測顯示：缺失株只能擴增出1133 bp單一條帶，野生株只能擴增出2841 bp單一條帶，結(jié)果表明缺失條帶穩(wěn)定存在，即得到了穩(wěn)定遺傳的lmo0160基因缺失株(圖5C)。

圖5 LM90SB2-Δlmo0160重組菌PCR檢測Fig.5 Identification of recombinant bacteria LM90SB2-Δlmo0160 by PCR

2.4 缺失株生長曲線

將LM90SB2和LM90SB2-Δlmo0160分別置于37℃條件下培養(yǎng)，以測定的OD600nm值為縱坐標，時間為橫坐標繪制其生長曲線。

圖6 LM90SB2和LM90SB2-Δlmo0160的生長曲線Fig.6 Growth curves of LM90SB2 and LM90SB2-Δlmo0160

由圖6可知，培養(yǎng)4 h后，LM90SB2-Δlmo0160生長顯著低于LM90SB2，隨著時間的推移，OD600nm值差別更加明顯(P＜0.01)，說明lmo0160基因很可能是LM正常生長過程中必需的基因，結(jié)果顯示lmo0160基因的缺失對細菌本身的生長活力造成一定影響。

2.5 lmo0160基因缺失生物膜形態(tài)學觀察

顯微鏡下觀察細菌生物膜的形態(tài)。8和12 h生物膜均為網(wǎng)格結(jié)構(gòu)，但LM90SB2-Δlmo0160菌的聚集程度低于 LM90SB2(圖 7A、B、E、F)；24 h 時LM90SB2-Δlmo0160網(wǎng)格結(jié)構(gòu)較LM90SB2松散 (圖7C、G)；48 h 時與 LM90SB2-Δlmo0160 相比，LM90SB2形成高度致密的生物膜(圖7D、H)?？梢妉mo0160基因的缺失對LM90SB2形成生物膜的時間和形態(tài)有一定程度的影響。

圖7 LM90SB2和LM90SB2-Δlmo0160形成的生物膜(×400)Fig.7 Formation of biofilm by LM90SB2 and LM90SB2-Δlmo0160(×400)

2.6 lmo0160基因缺失生物膜形成能力測定

以測定時間為橫坐標，OD570nm值為縱坐標繪制柱狀圖，8 h和 12 h時，LM90SB2和 LM90SB2-Δlmo0160生物膜生成能力有差異但不顯著 (P＞0.05)；24 h時，LM90SB2-Δlmo0160形成生物膜的能力明顯低于 LM90SB2，差異顯著(P＜0.05)；48 h 時，LM90SB2形成生物膜能力明顯高于 LM90SB2-Δlmo0160，差異極顯著(P＜0.001)。隨著培養(yǎng)時間的延長，lmo0160基因缺失對生物膜形成的影響越明顯。

圖8 LM90SB2和LM90SB2-Δlmo0160的生物膜形成能力Fig.8 The biofilm-forming capability of LM90SB2 and LM90SB2-Δlmo0160

3 討論

LM致病過程不僅毒力因子 (如內(nèi)化素，Act A，李氏桿菌溶血素O，磷酸脂酶C，蛋白Cwh A和金屬蛋白酶等)起關(guān)鍵作用[6，9]，生物膜也發(fā)揮重要的作用[17]。生物膜是細菌通過分泌胞外基質(zhì)粘附于生物或非生物表面，并嵌入其所分泌的胞外多聚物中而形成具有一定立體結(jié)構(gòu)的微生物聚集群體[18]。在適宜環(huán)境下，LM均可在表面形成生物膜，形成生物膜的菌體在胞外基質(zhì)的保護下可以增強其耐藥性，阻礙臨床抗菌藥物治療以及引起宿主免疫反應。

有研究報道[3，10]，SrtA特異識別含有LPXTG保守基序的表面蛋白并將這類蛋白通過蛋白修飾定位到細胞壁上，SrtA基因的缺失導致細菌細胞壁成分的改變，從而對細菌的生長增殖產(chǎn)生一定影響。Lmo0160蛋白屬于LPXTG保守基序的表面蛋白，生長曲線測定試驗發(fā)現(xiàn)lmo0160基因的缺失使得細菌自身的生長繁殖能力顯著降低 (P＜0.01)，說明lmo0160基因?qū)毦陨淼纳L繁殖能力有一定的調(diào)控作用，也提示lmo0160基因可能是細菌生長繁殖中起關(guān)鍵作用的調(diào)控因素。

細菌生物膜是機體對抗不利環(huán)境的一種自我保護機制，一旦形成后極難去除并增強其耐藥性，易造成一些疾病呈現(xiàn)持續(xù)性感染并發(fā)展為慢性炎癥[19]。細菌生物膜形成的動態(tài)過程一般為五階段[20]：浮游細菌可逆性地吸附于生物或非生物表面 (此階段是抗菌藥物發(fā)揮藥效的最佳時間)；細菌對表面的吸附轉(zhuǎn)變?yōu)椴豢赡娴倪^程，并開始分泌多種表面聚合物(生物膜活性的關(guān)鍵)；早期生物膜結(jié)構(gòu)即微菌落的形成；形成成熟的生物膜 (圓柱形視覺可見的空腔結(jié)構(gòu))；生物膜中細菌被釋放到環(huán)境中再次變成浮游菌狀態(tài)。本試驗通過缺失lmo0160基因研究LM90SB2生物膜的生成能力，在顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，基因缺失株形成成熟生物膜的時間比LM90SB2明顯延后，且生物膜密度和完整性明顯不如LM90SB2。在570 nm波長下測定生物膜生成量，早期階段8和12 h，有影響但不顯著(P＞0.05)；后期24和48 h缺失株生物膜生成能力顯著和極顯著低于LM90SB2(24 h時，P＜0.05；48 h 時P＜0.001)。這表明 LM90SB2 形成生物膜的能力在一定程度上直接或間接受到lmo0160基因表達的影響。

總之，本試驗成功構(gòu)建了單增李斯特菌lmo0160基因缺失株 LM90SB2-Δlmo0160，并發(fā)現(xiàn) lmo0160基因?qū)M90SB2生長增殖和生物膜具有一定的調(diào)控作用，為進一步闡明LM毒力因子的致病機理奠定了理論基礎(chǔ)。

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