吲哚胺-2,3-雙加氧酶抑制劑聯(lián)合鋁佐劑對甲型肝炎減毒活疫苗誘導(dǎo)小鼠體液免疫應(yīng)答的效應(yīng)分析

何 慧, 李彥涵, 李建芳, 馬 靜, 胡云章, 胡凝珠

(1. 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所 云南省蟲媒傳染病防控研究重點實驗室, 昆明650118; 2. 昆明醫(yī)科大學(xué), 昆明650500)

吲哚胺-2,3-雙加氧酶抑制劑聯(lián)合鋁佐劑對甲型肝炎減毒活疫苗誘導(dǎo)小鼠體液免疫應(yīng)答的效應(yīng)分析

何 慧1, 李彥涵1, 李建芳1, 馬 靜2, 胡云章1, 胡凝珠1

(1. 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所 云南省蟲媒傳染病防控研究重點實驗室, 昆明650118; 2. 昆明醫(yī)科大學(xué), 昆明650500)

目的 探討吲哚胺-2,3-雙加氧酶(IDO)抑制劑INCB024360類似物與鋁佐劑聯(lián)合對甲型肝炎減毒活疫苗(HepA-l)誘導(dǎo)小鼠體液免疫應(yīng)答的影響，以評價其復(fù)合佐劑效應(yīng)。方法 分別將三種不同劑量的INCB024360類似物(150 μg, 100 μg, 50 μg)與Al(OH)3(300 μg)復(fù)合后與HepA-1共同免疫ICR小鼠分別作為復(fù)合佐劑1組，2組，3組，同時設(shè)空白對照組、單純疫苗組、鋁佐劑對照組和單一INCB024360類似物(100 μg)組, 共免疫一次，于免疫后 4周、8周、12周、16周進(jìn)行尾靜脈采血, 采用間接 酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測小鼠血清抗甲型肝炎病毒(HAV) IgG 抗體水平。結(jié)果 除空白對照組外, 各組小鼠免疫后4周、8周、12周、16周, 均產(chǎn)生抗HAV IgG抗體, 抗體水平隨免疫時間的延長逐漸升高, 于12周達(dá)到峰值。復(fù)合佐劑2組[HepA-118 EU+Al(OH)3300 μg+ INCB024360類似物100 μg]產(chǎn)生的抗體水平最高且持續(xù)時間較長, 在8周和12周時, 其對HepA-1的免疫增強效應(yīng)顯著高于單一佐劑組以及鋁佐劑對照組(P＜0.05, t值分別為3.169、2.439)。4周、8周、12周、16周, 單一佐劑組與單純疫苗組差異均不具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。結(jié)論 IDO抑制劑INCB024360類似物與鋁佐劑復(fù)合后具有較強的復(fù)合佐劑效應(yīng)，免疫增強效應(yīng)優(yōu)于鋁佐劑對照組; 但是單一的INCB024360類似物不具有顯著佐劑效應(yīng)。

吲哚胺-2,3-雙加氧酶(IDO); INCB024360類似物; 疫苗佐劑;甲型肝炎減毒活疫苗(HepA-l); 體液免疫; 佐劑效應(yīng)

吲哚胺-2,3-雙加氧酶(indoleamine-2,3-dioxygenase，IDO)是一種含亞鐵血紅素的氧化還原單體酶, 是催化犬尿氨酸途徑的限速酶，經(jīng)多步分解代謝將基本氨基酸色氨酸轉(zhuǎn)化為犬尿氨酸[1-3]。IDO是經(jīng)γ干擾素(IFN-γ)誘導(dǎo)表達(dá)在多種細(xì)胞內(nèi)的一種酶，在抗原提呈細(xì)胞尤其是漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞內(nèi)高度表達(dá)，該通路可以通過抑制T細(xì)胞的活化來下調(diào)機體的免疫能力[4]。已被證實IDO與阿爾茨海默病、癌癥等多種疾病的發(fā)病機制密切相關(guān),可能成為治療多種疾病的靶標(biāo)[5]。

研究表明[6]，抑制IDO1的活性不僅可以促進(jìn)化學(xué)治療的療效還可以提高免疫接種的效果，這使得IDO1成為一種新的免疫增強設(shè)計靶標(biāo)。相關(guān)研究表明[7-9]，經(jīng)IDO抑制劑1-甲基色氨酸(1-methyl-tryptophan, 1-MT)處理后的慢性粒細(xì)胞性白血病源性樹突狀細(xì)胞的IL-12分泌水平及刺激自體T淋巴細(xì)胞增殖的能力均明顯高于對照組。

IDO抑制劑分為競爭性抑制劑, 非競爭性抑制劑以及反競爭性抑制劑。4-氨基-N-(3-氯-4-氟苯基) -N'-羥基-1,2,5-口惡二唑-3-甲脒(又稱INCB024360)是一種口服、強效、選擇性的小分子競爭性IDO抑制劑, IC50為10 nmol, 目前作為抗腫瘤藥物已經(jīng)進(jìn)入II期臨床試驗[10-12]。臨床前試驗證明, IDO抑制劑INCB024360 能夠促進(jìn)T細(xì)胞、自然殺傷(NK)細(xì)胞的生長，減少調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)[13-15]。綜上所述, IDO抑制劑在一定程度上可以增強免疫反應(yīng)。

INCB024360類似物是在INCB024360的基礎(chǔ)上進(jìn)行改造，分子量更小且抑制效果以及安全性更好的IDO抑制劑, 其分子式為C9H7ClFN5O2, 結(jié)構(gòu)式見圖1, IC50為67 nmol。鑒于IDO抑制劑INCB024360類似物潛在的免疫增強效應(yīng), 推測其具備潛在的疫苗佐劑效應(yīng)。本文作者選擇IDO抑制劑INCB024360類似物作為候選佐劑，通過與HepA-l聯(lián)合免疫小鼠和與鋁佐劑聯(lián)合后再與HepA-l共同免疫小鼠，以評價其對小鼠體液免疫應(yīng)答的影響，并分析其潛在的疫苗佐劑效應(yīng)。

圖 1 INCB024360類似物結(jié)構(gòu)式Figure 1 The structural formula of INCB024360 analogue

1 材料與方法

1.1 主要試劑

甲型肝炎減毒活疫苗(HepA-l)，甲型肝炎病毒(HAV)抗原滴度為256 EU/mL, 由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所提供; 甲型肝炎抗原(HAV顆粒)，由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所提供; 鋁佐劑為Al(OH)3膠體(12.5 mg/mL), 由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所提供; IDO抑制劑INCB024360類似物購于美國Selleck公司; 血清IgG ELISA 試劑盒，購自美國KPL公司。

1.2 實驗動物

清潔級雌性ICR小鼠共42只，5～6周齡，體質(zhì)量18～22 g，由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所小動物實驗部[SCXK(滇) K2014-0002]提供。試驗計劃通過醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所動物實驗倫理委員會審查, 動物飼養(yǎng)設(shè)施符合相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)[SYXK(滇)K2014-0007]。

1.3 動物分組及免疫

將42只雌性ICR小鼠隨機分成7組，6只/組，分組情況詳見表1。均經(jīng)背部皮下注射ICR小鼠，200 μL/只。于免疫后的4周、8周、12周和16周,小鼠尾靜脈采血，分離血清，以備檢測。

表 1 動物分組

1.4 小鼠血清抗-HAV IgG 抗體水平檢測

本實驗采用間接ELISA法檢測小鼠血清抗-HAV IgG 抗體水平。具體操作步驟為: 用包被液稀釋甲型肝炎抗原后, 加入酶標(biāo)反應(yīng)板中, 100 μL/孔，A1孔不加包被液, 作為空白對照, 并于濕盒中4 ℃包被過夜; 次日用小牛血清(BSA)于37 ℃ 封閉60 min, 200 μL/孔; 待檢測小鼠血清自 20倍起倍比稀釋, 加入酶標(biāo)板, 100 μL/孔, 3個陰性對照孔加未免疫小鼠血清，于37 ℃反應(yīng) 60 min; 洗滌拍凈板子后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體, 100 μL/孔,于37 ℃反應(yīng) 60 min。洗滌酶標(biāo)板, 并拍凈板子后加入四甲基聯(lián)苯胺(TMB)顯色液, 100 μL/孔, 顯色30 min; 加入2 moL/L H2SO4, 100 μL/孔，終止顯色反應(yīng); 于酶標(biāo)儀405 nm和605 nm雙波長檢測各孔吸光度(A)值，陽性反應(yīng)孔的判定cutoff值=3個陰性對照孔平均A值×2.1, 大于cutoff值判定為陽性，小于等于cutoff值判定為陰性, 以陽性反應(yīng)孔的最大稀釋度作為該孔的抗體效價, 以log10 表示。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示, 應(yīng)用Graphpad prism 5軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析, 組間比較采用t檢驗, P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

除空白對照組外，各組小鼠在免疫后4周、8周、12周、16 周，均產(chǎn)生抗-HAV IgG，抗體水平隨著免疫時間延長而逐漸升高，于12周達(dá)到峰值，此后逐漸下降。

4周、8周、12周, 三個劑量的復(fù)合佐劑組抗體水平顯著高于單純疫苗組(P＜0.05), 復(fù)合佐劑1組4周、8周、12周的t值分別為3.901、2.610、4.188，復(fù)合佐劑2組的t值分別為5.482、4.427、3.769，復(fù)合佐劑3組的t值分別為3.221、 2.457、2.589; 第16周，復(fù)合佐劑2組的抗體水平顯著高于單純疫苗組(P＜0.05，t=3.100); 復(fù)合佐劑1組和復(fù)合佐劑3組的抗體水平也高于單純疫苗組但差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義。

4周、8周、12周、16周，單一佐劑組與單純疫苗組差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義。表明單一的INCB024360類似物不具有顯著佐劑效應(yīng)。4周、8周、12周和16周，復(fù)合佐劑2組的抗體水平高于其他兩組復(fù)合佐劑組但差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義。

8周、12周, 復(fù)合佐劑2組的抗體水平顯著高于鋁佐劑對照組(P＜0.05，8周、12周的t值分別為3.169、2.439); 其余兩組復(fù)合佐劑組的抗體水平高于鋁佐劑對照組但差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義; 4周、16周, 三組復(fù)合佐劑組的抗體水平與鋁佐劑對照組差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義。表明INCB024360類似物與Al(OH)3復(fù)合佐劑可增強HepA-l誘導(dǎo)的特異性體液免疫應(yīng)答, 具有佐劑效應(yīng), 較佳劑量為100 μg/組(圖2)。

圖 2 不同時間各組小鼠血清抗-HAV IgG 水平Figure 2 Anti-HAV IgG titers in sera of mice in different groups at 4, 8, 12 and 16 weeks

3 討論

佐劑是一種能夠增強疫苗組分抗原特異性免疫應(yīng)答或改變免疫反應(yīng)的物質(zhì)[16]。鋁佐劑是最早被批準(zhǔn)用于人類疫苗的佐劑, 其優(yōu)點突出, 如鋁佐劑安全性較高，價格便宜，引起的免疫應(yīng)答持續(xù)時間較長。Al(OH)3佐劑經(jīng)長期實踐證實了其安全高效等特點[17]，但其與許多新型疫苗如重組蛋白和亞單位疫苗抗原共同免疫時不能有效的激發(fā)免疫應(yīng)答, 使之很難滿足新型疫苗發(fā)展的需要。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，盡管已有大量的新型疫苗佐劑處于研究開發(fā)和臨床試驗階段, 但是真正獲得批準(zhǔn)用于人用疫苗的佐劑屈指可數(shù)。MF59是第二個被批準(zhǔn)用于人類疫苗的疫苗佐劑, 作為新型疫苗佐劑, MF59比鋁佐劑更適合應(yīng)用于流感疫苗, 但在實施接種過程中易造成短暫性劇痛, 引起局部強烈的炎癥反應(yīng)而且不能有效的激發(fā)細(xì)胞免疫。因此,目前新型疫苗佐劑的主要研發(fā)任務(wù)是尋找一種不僅安全可靠而且能很好的增強體液免疫和細(xì)胞免疫的疫苗佐劑。

復(fù)合佐劑是將兩種或多種不同作用機制的佐劑混合使用，進(jìn)一步增強或調(diào)節(jié)對某一抗原的免疫應(yīng)答[18]。將不同類型的佐劑復(fù)合研制新型疫苗佐劑成為佐劑發(fā)展的新趨勢。王麗萍等[19]將酵母多糖與角鯊烯兩種物質(zhì)聯(lián)合使用作為復(fù)合佐劑，適當(dāng)配比的復(fù)合佐劑能顯著增強甲型肝炎抗原的體液免疫應(yīng)答且效果優(yōu)于鋁佐劑。王琳等[20]將內(nèi)源性危險信號分子煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)與具有佐劑效應(yīng)的鋁佐劑聯(lián)合使用，結(jié)果表明NAD與Al(OH)3聯(lián)合佐劑能顯著增強乙肝抗原誘導(dǎo)的體液免疫應(yīng)答且效果優(yōu)于單一鋁佐劑以及單一NAD佐劑。

本實驗為了探究IDO抑制劑作為新型疫苗佐劑的可行性，將不同劑量的INCB024360類似物和Al(OH)3復(fù)合使用，初步研究其對HepA-l誘導(dǎo)的小鼠體液免疫應(yīng)答。結(jié)果顯示，INCB024360類似物和Al(OH)3聯(lián)合的復(fù)合佐劑可以顯著增強HepA-l誘導(dǎo)的體液免疫應(yīng)答。適當(dāng)劑量的復(fù)合佐劑的增強效應(yīng)顯著高于單一鋁佐劑和單一INCB024360類似物佐劑。但單一INCB024360類似物不具有顯著的佐劑效應(yīng), 原因是IDO是由炎性因子誘導(dǎo)表達(dá)的[21,22]，而單純HepA-l不足以引起較強的免疫反應(yīng); 也可能是因為Al(OH)3可以吸附INCB024360類似物起到緩釋作用，從而引起高效而持久的免疫應(yīng)答。

IDO抑制劑INCB024360類似物和Al(OH)3復(fù)合佐劑有望成為HepA-1新型佐劑。下一步將細(xì)化INCB024360類似物的劑量分組，降低鋁佐劑劑量，進(jìn)一步研究其作為佐劑的安全性和有效性。

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Effects of Indoleamine-2,3-dioxygenase Inhibitor Combined with Aluminum Adjuvant on Humoral Immune Response Induced by Hepatitis A Virus Attenuated Live Vaccine in Mice

HE Hui1, LI Yan-han1, LI Jian-fang1, MA Jing2, HU Yun-zhang1, HU Ning-zhu1
(1. Institute of Medical Biology, Chinese Academy of Medical Science and Peking Union Medical College, Yunnan Key Laboratory of Prevention & Control Research on Insect-Borne Infectious Diseases, Kunming 650118, China; 2. Kunming Medical University, Kunming 650500, China)

ObjectiveTo investigate the compound effect of indoleamine-2,3-dioxygenase (IDO) inhibitor INCB024360 analogue combined with aluminum adjuvant on humoral immune response induced by hepatitis A virus (HAV) attenuated live vaccine(HepA-l) in mice.MethodsThe ICR mice were injected respectively with HepA-l (18EU) and Al(OH)3(300 μg) and three different doses (150 μg, 100 μg, 50 μg) of INCB024360 analogue as experimental group, 200 μL for each and one immunization. At the same time, set up the blank group, pure vaccine group, aluminum adjuvant control group and single INCB024360 analogue (100 μg) group. The sera from tail vein blood of mice were collected at the end of 4, 8, 12 and 16 weeks after immunization and the specific IgG antibody against HAV were detected by indirect ELISA method.ResultsIn addition to the blank group, mice in various group generated anti-HAV IgG at 4, 8, 12, 16 weeks after the immunization. The antibody levels increased as time went on and reached peak at 12 weeks, then decreased gradually. The antibody level of compound adjuvant 2 group is the highest. At 8, 12 weeks, the antibody level was significantly higher than pure vaccine group, aluminum adjuvant control group and single INCB024360 analogue group (P＜0.05). At 4, 8, 12, 16 weeks, the difference between the single adjuvant group and the simple vaccine group was not statistically significant.Conclusions The compound adjuvant of IDO inhibitor INCB024360 analogue combined with aluminum adjuvant can obviously enhance the HepA-l induced humoral immune response in mice, and the immunity enhancement effect is better than aluminum adjuvant control group. But the single INCB024360 analogue does not have significant adjuvant effect.

Indoleamine-2,3-dioxygenase (IDO); INCB024360 analogue; Vaccine adjuvant; Hepatitis A virus attenuated live vaccine (HepA-l); Humoral immunity; Adjuvant effect

Q95-33

A

1674-5817(2017)02-0108-05

10.3969/j.issn.1674-5817.2017.02.005

2017-01-16

國家科技支撐計劃項目(2014BAI01B01); 云南省創(chuàng)新團(tuán)隊“中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所新型疫苗佐劑應(yīng)用研究省創(chuàng)新團(tuán)隊”(2011CI140);國家自然科學(xué)基金項目(31500748); 國家重點研究計劃生物安全關(guān)鍵技術(shù)研究發(fā)重點專項(2016YFC1202300)

何 慧(1990-), 女, 碩士研究生, 專業(yè): 生物化學(xué)與分子生物學(xué), E-mail: 1129368425@qq.com

胡凝珠(1961-), 女, 主任技師,

E-mail: huningz@126.com