高等級生物安全實驗室生物反應(yīng)器加樣過程風險識別與控制

孟軻音，王承宇，錢軍，郭振東，田圓，郝鐲，李楠，萬忠海

高等級生物安全實驗室生物反應(yīng)器加樣過程風險識別與控制

孟軻音，王承宇，錢軍，郭振東，田圓，郝鐲，李楠，萬忠海

目的：對生物反應(yīng)器在高等級生物安全實驗室加樣操作過程中的風險加以識別，并通過設(shè)備的改進加以防范控制。方法：研究設(shè)計了生物反應(yīng)器用加樣口針頭封閉器，并通過激光粒子計數(shù)器進行檢漏。結(jié)果：制作了生物反應(yīng)器用加樣口針頭封閉器，通過激光粒子計數(shù)器對加樣口周圍環(huán)境進行檢測，與環(huán)境本底比較未見氣溶膠粒子檢出。結(jié)論：在高等級生物安全實驗室采用本研究設(shè)計的生物反應(yīng)器用加樣口針頭封閉器既能簡便操作，又能有效防止此環(huán)節(jié)中病原微生物的泄漏，從而保證了操作人員及實驗室內(nèi)環(huán)境的生物安全。

高等級生物安全實驗室；生物反應(yīng)器；風險識別與控制

生物反應(yīng)器是指利用生物體所具有的生物功能，通過生化反應(yīng)或生物自身的代謝獲得目標產(chǎn)物的裝置系統(tǒng)，因其具有產(chǎn)量高、成本低、密封性強及污染少等優(yōu)點，被諸多領(lǐng)域的科學工作者廣泛應(yīng)用。目前，利用生物反應(yīng)器代替轉(zhuǎn)瓶進行細胞規(guī)?；囵B(yǎng)已成為現(xiàn)代生物技術(shù)發(fā)展的趨勢，而規(guī)?；囵B(yǎng)的細胞通常又是作為病毒或細胞產(chǎn)品的底物[1-2]。故對生物反應(yīng)器在使用過程中的風險識別與防范顯得尤為重要，尤其是在從事烈性病原研究的高等級生物安全實驗室。本實驗設(shè)計主要是為了解決德國SARTORIUS公司生產(chǎn)的15L攪拌型生物反應(yīng)器在國產(chǎn)化高等級病原微生物模式實驗室進行病毒接種加樣過程中存在的安全隱患問題。研究表明，此生物反應(yīng)器在病毒接種加樣過程中存在以下兩個風險點：一是加樣口加入病毒培養(yǎng)液后，針頭拔出隔膜時，液體會殘留在隔膜上，暴露在空氣中；殘留在針頭上的病毒液也存在暴露在室內(nèi)的危險；二是注射器注入病毒液和拔出的過程中也存在產(chǎn)生氣溶膠的風險。為了解決以上兩個問題，本實驗室研究設(shè)計了一種新型加樣口針頭封閉器，采用此封閉器，加樣前后，針頭均裝置在封閉的筒體中，即使加樣后針頭拔出時帶有殘留液體，也能封存在筒體中，不會與外界接觸，從而保證針頭上的培養(yǎng)液不會擴散到外部，大大規(guī)避了風險，降低了操作中的風險系數(shù)，同時也簡便了操作。

1 資料和方法

1.1 主要儀器設(shè)備德國SARTORIUS公司生產(chǎn)的15L攪拌型生物反應(yīng)器；美國TSI306-V2型激光粒子計數(shù)器。

1.2 研究方法

1.2.1 病毒接種加樣口的風險識別此生物反應(yīng)器加樣口加樣時為了避免病毒液在環(huán)境中暴露時間過長，污染環(huán)境，需兩人配合快速操作。首先，一人打開加樣口，拿酒精棉對加樣口膠墊進行消毒，隨后在消毒后的加樣口周圍放一圈酒精棉；另一人快速將預(yù)先放置于酒精棉中的接毒器拔出插入隔膜注入病毒，然后用一部分酒精棉消毒拼接樣口，用剩余的酒精棉與接毒器一起拔出裝入銳器盒后放入高壓滅菌袋，待高壓滅菌處理。操作過程見圖1。

圖1 操作過程

1.2.2 加樣口針頭封閉器的設(shè)計為了解決在加樣過程中的病毒泄漏問題，我們設(shè)計了加樣口針頭封閉器。此針頭封閉器由針頭1、右端蓋2、筒體3、連接蓋4、密封蓋5及橡膠墊6、8構(gòu)成，筒體的一端通過螺紋連接有右端蓋及橡膠墊，右端蓋的中部設(shè)有針孔9；筒體的另一端通過螺紋連接有橡膠墊、連接蓋，連接蓋的中部設(shè)有中間孔7，密封蓋通過橡膠墊扣在連接蓋的另一端，構(gòu)成封閉的筒體結(jié)構(gòu)。其整體結(jié)構(gòu)原理圖見圖2，筒體結(jié)構(gòu)原理圖見圖3。

1.2.3 防漏效果檢測方法防漏檢測在環(huán)境溫度為19℃，相對濕度為40%，負壓值為-60 Pa的實驗室里進行。采用激光粒子計數(shù)器分別對生物反應(yīng)器病毒模擬實驗加樣前后加樣口周圍環(huán)境進行檢測。程序設(shè)置為每隔4 s分別測試200 s（50 t），記錄各時間段的粒子數(shù)，測試數(shù)據(jù)通過t檢驗法進行統(tǒng)計學分析[3]。

圖2 整體結(jié)構(gòu)原理圖

圖3 筒體結(jié)構(gòu)原理圖

2 結(jié)果

2.1 制作了加樣口針頭封閉器首先將針頭與此封閉器裝配好，高壓滅菌后待用；加樣時，先將針頭從連接蓋的中間孔扎出，再扎入加樣口，并將連接蓋與反應(yīng)器的加樣口擰緊，使本封閉器固定在加樣口上，進行加樣；加樣完成后，將針頭與連接蓋分離，直接退回到密封的筒體內(nèi)，并將連接蓋與反應(yīng)器的加樣口分離，將密封蓋扣在連接蓋上將筒體密封，完成生物反應(yīng)器的加樣。加樣口針頭封閉器與針頭連接實物圖見圖4。

圖4 加樣口針頭封閉器與針頭連接實物圖

2.2 激光粒子計數(shù)器檢測分析結(jié)果通過t檢驗法進行統(tǒng)計學分析，加樣前后加樣口周圍氣溶膠數(shù)量比較，[（7.560×103/L）VS.（7.490×103/L），P= 0.28]，差異不顯著。

3 討論

近年來，世界各地頻頻暴發(fā)突發(fā)性公共衛(wèi)生事件，2003年發(fā)生在我國大范圍的SARS、2004年發(fā)生在泰國等地的禽流感以及2014年發(fā)生在西非的埃博拉疫情，都給人類社會造成了巨大的生命和財產(chǎn)損失，因此對上述烈性病毒、病原體的系列研究迫在眉睫[4-5]。研制出相應(yīng)烈性病毒、病原體的疫苗仍是解決此問題的行之有效的辦法。利用規(guī)?；a(chǎn)的細胞接種病毒又是實現(xiàn)這一目標的有效手段。上述烈性病原的研究需在高等級生物安全實驗室內(nèi)進行。高等級生物安全實驗室的生物安全工作是一項很重要的工作，而風險評估又是生物安全工作的核心。風險評估包括病原微生物特征的風險評估和實驗活動的風險評估[6-9]。國內(nèi)外有關(guān)高等級生物安全實驗室風險評估的研究已有相關(guān)報道，但在高等級生物安全實驗室中利用生物反應(yīng)器開展細胞規(guī)?；囵B(yǎng)并接種病毒過程的風險評估報道較少。

本項目主要是研究在高等級生物安全實驗室模擬病毒在試驗和生產(chǎn)過程中的風險識別與控制。本研究主要是對生物反應(yīng)器加樣過程中的風險加以識別，并通過設(shè)備的改進加以控制。改進后的設(shè)備在加樣過程中一個人即可獨立完成，且全程操作處在封閉狀態(tài)下進行，盡可能的避免了因人員配合不當、注意力不集中或操作意外等不可抗力造成的風險。同時，也對改進后加樣操作過程中能否產(chǎn)生氣溶膠進行了檢測并做了統(tǒng)計差異分析。分析結(jié)果表明加樣后沒有氣溶膠粒子擴散至加樣口周圍環(huán)境中。我們在做此項研究的同時，也為使用同種型號，從事相關(guān)研究，面臨同樣問題的同行提供一個參考。

[1]張前程，張鳳寶，姚康德，等.動物細胞反應(yīng)器研究進展[J].化工進展，2002，21（8）：560-563.

[2]駱海燕，竇冰然，姜開維，等.攪拌式動物細胞反應(yīng)器研究應(yīng)用與發(fā)展[J].生物加工過程，2016，14（2）：75-80.

[3]吳佳，宋冬林，唐浩，等.BSL-3實驗室內(nèi)氣溶膠擴散實驗研究[J].中國預(yù)防醫(yī)學雜志，2013，14（2）：157-159.

[4]Frieden T R.Review of CDC anthrax lab incident [EB/OL].http://www.cdc.gov/washington/testimony/2014/t20140716.htm.

[5]Hottes AK，Rusek B，Sharples F.Biosecurity challenges of the global expansion of high-containment biological laboratories[M].Washington，DC：National Academies Press，2012.

[6]中華人民共和國衛(wèi)生部.人間傳染的病原微生物名錄[EB/OL].2006.

[7]中華人民共和國國務(wù)院.病原微生物實驗室生物安全管理條例[EB/OL].2004.

[8]實驗室生物安全通用要求[EB/OL].(GB19489-2008)

[9]實驗室生物安全手冊.世界衛(wèi)生組織（第3版）.2004.（收稿：2016-12-25修回：2017-01-30編校：齊彤）

Risk identification and control of samples adding in bioreactor from high-level bio-safety laboratories

MENG Ke-yin，WANG Cheng-yu，QIAN Jun，GUO Zhen-dong，TIAN Yuan，HAO Zhuo，LI Nan，WANZhong-hai
.Institute of Military Veterinary，Academy of Military Medical Sciences，Key Laboratory of Jilin Province for Zoonosis Prevention and Control，Jilin Changchun 130122，China Corresponding author：WAN Zhong-hai，E-mail：wzhyjs531@163.com

Objective：Identify the risk of samples adding in bioreactor from high-level bio-safety laboratories，then control by improving equipment.Methods：Design a syringe needle closure that is applied to the mouth samples adding and detect the leak with a laser ion counter.Results：Compared with background environment，there is nothing aerosol particles to be detect in air.Conclusion：Using of the syringe needle closure can not only simplify the operation but also prevent the leak of pathogenic microorganism, to make sure the safety of operating personnel and environment.

high-level biosafety laboratories；bioreactor；risk identification and control

Q

A

2095-3496（2017）01-0005-03

10.19372/j.cnki.issn.2095-3496.2017.01.002

國家科技部重點研發(fā)項目（2016YFC1202303）

130122吉林長春，軍事醫(yī)學科學院十一所，吉林省人獸共患病預(yù)防與控制重點實驗室（孟軻音，王承宇，錢軍，郭振東，田圓，郝鐲，李楠，萬忠海）

萬忠海，E-mail：wzhyjs531@163.com