慢性髓性白血病患者骨髓單個核細胞SDF-1水平與病情及臨床參數(shù)的關系

張丹陽，田登梅，劉麗輝，施兵，馮超，何圣科，張永清1,(1河北北方學院，河北張家口075000；解放軍第309醫(yī)院)

慢性髓性白血病患者骨髓單個核細胞SDF-1水平與病情及臨床參數(shù)的關系

張丹陽1，2，田登梅2，劉麗輝2，施兵2，馮超2，何圣科2，張永清1,2
(1河北北方學院，河北張家口075000；2解放軍第309醫(yī)院)

目的 觀察骨髓基質細胞衍生因子1(SDF-1)在慢性髓性白血病(CML)不同病程中的表達，并探討其與臨床參數(shù)的關系。方法 選擇CML患者30例及健康對照者12例，CML患者30例中，初治慢性期10例、慢性期獲得主要分子學反應(MMR)10例(患者接受一代或二代TKI治療)、急變期10例(接受TKI治療疾病仍發(fā)生進展)。抽取骨髓，提取骨髓單個核細胞，采用實時定量PCR技術檢測SDF-1 mRNA，比較CML與健康對照之間及不同病程CML患者之間SDF-1的表達差異，分析SDF-1 mRNA表達水平與CML患者臨床參數(shù)間的關系。選取上述患者中CML初治慢性期患者6例、急變期4例的骨髓活檢標本作為慢性期組及急變期組，并應用5例份無明顯病變的骨髓活檢標本作為對照組，應用免疫組化技術檢測骨髓組織SDF-1蛋白的表達。結果 與健康對照比較，CML初治慢性期患者、急變期患者骨髓單個核細胞SDF-1 mRNA表達水平降低(P均<0.05)，CML慢性期治療后獲得MMR者SDF-1 mRNA水平與健康對照比較，P>0.05；CML急變期患者SDF-1 mRNA表達水平較CML初治慢性期患者高(P<0.05)。急變期組骨髓組織中SDF-1表達陽性率高于慢性期組(P<0.05),慢性期組與對照組比較P>0.05。SDF-1 mRNA低表達(<4.36×10-3)患者外周血白細胞計數(shù)高于SDF-1 mRNA高表達(≥4.36×10-3)者(P<0.05)，而SDF-1 mRNA的表達與患者年齡、性別、血紅蛋白、血小板計數(shù)、CD34+細胞比例、BCR-ABL1/ABL1、染色體核型均無相關性(P均﹥0.05)。結論 CML患者骨髓微環(huán)境中SDF-1表達降低，其水平降低與病情加重及白細胞升高有關。

慢性髓性白血病；骨髓基質細胞衍生因子1；急變期

慢性髓性白血病(CML)是髓系造血干細胞惡性克隆性疾病，以髓細胞大量增殖為主要特征。其主要發(fā)病機制是Ph染色體t(9；22)(q34；q11)易位導致BCR-ABL融合基因的產(chǎn)生。臨床上，CML可分為慢性期、加速期、急變期，酪氨酸抑制劑(TKI)是目前治療CML的首選用藥，對慢性期患者治療效果良好，但仍有約15%患者在治療過程中出現(xiàn)耐藥，發(fā)生進展，預后極差[1]。骨髓微環(huán)境中基質細胞衍生因子(SDF-1)與其受體構成的信號轉導通路與白血病干細胞的增殖、分化和耐藥密切相關[2]。大量研究顯示，SDF-1與TKI耐藥密切相關，但SDF-1在CML患者中的表達及其與白血病耐藥、進展的關系報道較少。本研究應用實時定量PCR和免疫組化法檢測了CML患者骨髓微環(huán)境中SDF-1表達，并探討SDF-1在CML不同病程中表達的臨床意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇解放軍第309醫(yī)院2014年3月～2016年9月診治的CML患者30例，均符合《中國慢性髓性白血病診斷與治療指南》[3]中的診斷標準。男19例、女11例，年齡16～67歲。初治慢性期10例、慢性期獲得主要分子學反應(MMR)10例(患者接受一代或二代TKI治療)、急變期10例(接受TKI治療疾病仍發(fā)生進展)。健康對照者12例，男6例、女6例，年齡32～59歲。選取上述患者中CML初治慢性期患者6例、急變期4例的骨髓活檢標本作為慢性期組及急變期組，并應用5例份無明顯病變的骨髓活檢標本作為對照組。

1.2 骨髓單個核細胞SDF-1 mRNA表達水平檢測 采用實時熒光定量PCR法。無菌條件下采集CML患者骨髓標本，加入淋巴細胞分離液，提取單個核細胞。以TRIzol(Invitrogen 公司)提取細胞總RNA。紫外分光光度計于OD260 nm和OD280 nm檢測RNA濃度及純度。按日本TAKARA公司PrimeScriptTMRTMaster Mix逆轉錄試劑盒進行逆轉錄反應。引物序列：SDF-1上游：5′-ACAGATGCCCATGCCGATTCT-3′，下游：5′-CCTGAATCCACTTTAGCTTCGGGT-3′；GAPDH上游：5′-CTTTTGCGTCGCCAGCCGAG-3′，下游5′-CCAGGCGCCCAATACGACCA-3′。引物由上海生物工程公司合成。擴增完畢后，以GAPDH為內參照基因，與對照組相比。結果采用2-ΔΔCt法計算。

1.3 骨髓活檢組織中SDF-1蛋白表達的檢測 將骨髓活檢標本切3 μm厚切片，采用免疫組化SP法檢測，具體操作步驟參照試劑盒說明書，PBS代替一抗作陰性對照。結果判定標準：以細胞膜和細胞質呈黃色或棕黃色為SDF-1表達陽性。陽性細胞百分數(shù)<1%為0分，1%～29%為1分，30%～59%為2分，≥60%為3分；細胞質染色無色為0分，黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。兩項計分相加，0～1分為陰性，≥2分為陽性。

1.4 臨床參數(shù)的收集及檢測方法 收集采髓當日患者的年齡，性別，病程，治療方案，白細胞、血紅蛋白、紅細胞計數(shù)。流式細胞術檢測骨髓中CD34+細胞百分比，PCR檢測BCR-ABL融合基因表達、BCR-ABL1/ABL1表達以及患者染色體核型。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS20.0統(tǒng)計軟件。SDF-1 mRNA表達數(shù)值以中位數(shù)表示，比較采用Mann-WhitneyU秩和檢驗。組間SDF-1蛋白陽性率比較及SDF-1 mRNA表達與臨床參數(shù)的關系采用χ2檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 CML患者骨髓單個核細胞SDF-1 mRNA表達水平 CML初治慢性期患者、慢性期MMR患者、急變期患者及健康對照者SDF-1 mRNA表達水平分別為0.162(0.048～22.561)、8.413(4.245～16.402)、1.954(0.104～18.711)×10-3、31.129(3.773～817.902) ×10-3。與健康對照相比，CML急變期、CML初治慢性期患者SDF-1 mRNA表達降低(P均<0.05)；慢性期MMR患者與健康對照比較，P>0.05；CML急變期患者SDF-1 mRNA的表達高于CML初治慢性期患者(P<0.05)。

2.2 CML患者骨髓活檢組織中SDF-1蛋白的表達 SDF-1陽性細胞主要分布在骨髓網(wǎng)狀組織。慢性期組、急變期組及對照組SDF-1蛋白表達陽性分別為1、4、6例，表達陽性率分別為16.7%、100%、100%，與慢性期組比較，其余兩組均升高(P均<0.05)。其余兩組間比較，P﹥0.05。

2.3 骨髓單個核細胞中SDF-1 mRNA水平與CML患者臨床參數(shù)之間的關系 依據(jù)患者SDF-1 mRNA中位數(shù)水平4.36×10-3，將CML患者分為高表達者(≥4.36×10-3)和低表達者(<4.36×10-3)。SDF-1 mRNA低表達者外周血白細胞計數(shù)明顯升高(P<0.01)。SDF-1 mRNA表達水平與年齡、性別、血紅蛋白、血小板計數(shù)、BCR-ABL1/ABL1、染色體異常均無相關性(P均>0.05),詳見表1。

表1 CML患者骨髓單個核細胞中SDF-1 mRNA水平與臨床參數(shù)的關系

3 討論

SDF-1屬CXC類趨化因子，又名為CXCL12，其受體為CXCR4和CXCR7。骨髓微環(huán)境中骨髓基質細胞分泌SDF-1結合相應受體后參與造血細胞的生成，白細胞遷移和歸巢。近年研究發(fā)現(xiàn)，SDF-1/CXCR4軸與白血病的發(fā)生和耐藥相關。SDF-1可激活STAT5通路的活化，提高白血病細胞的分化、生存能力，導致急性B淋巴細胞白血病的發(fā)生[4]。SDF-1/CXCR4信號軸在急性髓白血病細胞與骨髓基質細胞的黏附中發(fā)揮重要作用，使其免受化療藥物的細胞毒性作用[5]。SDF-1與CML相關研究多在細胞系和動物模型，發(fā)現(xiàn)SDF-1/CXCR4軸在TKI的耐藥中起到重要作用[6]。

本研究結果顯示，CML初治慢性期患者骨髓單個核細胞SDF-1 mRNA水平和骨髓活檢SDF-1表達陽性率較健康對照明顯下降。SDF-1 mRNA低水平表達患者外周血白細胞計數(shù)明顯升高。白血病細胞破壞了正常骨髓微環(huán)境，導致細胞因子網(wǎng)絡紊亂，SDF-1表達下降[7]。趨化因子SDF-1維持正常造血干細胞的定位、分化，骨髓龕中SDF-1表達水平降低直接參與造血干細胞遷移至骨髓龕外，導致外周血未成熟白細胞大量增殖。經(jīng)過TKI治療后獲得MMR患者，SDF-1 mRNA表達恢復正常，這可能是CML緩解后瘤負荷降低，SDF-1水平得到恢復。

CML急變期患者SDF-1 mRNA水平和骨髓活檢SDF-1表達陽性率均較CML初治慢性期患者升高。這與我們預期的隨著疾病發(fā)生進展、瘤負荷增加，SDF-1表達進行性降低結果不符?？赡艽嬖诘脑蚴潜敬?0例急變期患者均為口服伊馬替尼治療過程中CML進展至急變期。本研究顯示患者應用TKI治療緩解后骨髓單個核細胞SDF-1表達升高。Jin等[8]研究顯示，伊馬替尼可提高CML細胞表面的CXCR4表達。SDF-1/CXCR4軸介導部分CML細胞遷移至骨髓基質，從而此類CML細胞駐扎于骨髓微環(huán)境中，避免伊馬替尼的殺傷作用，形成微小殘留病灶[9～11]。此類CML細胞進一步分化擴增，導致疾病進入急變期。因此，我們推測SDF-1升高在CML耐藥進展中起到重要作用。本研究中，急變期組SDF-1蛋白陽性表達率與對照組相同，考慮到本次實驗骨髓活檢標本例數(shù)少，且免疫組化為定性研究，急變期患者SDF-1 mRNA定量表達明顯低于健康對照者，并不能說明急變期患者SDF-1升高到正常水平。CML急變期患者SDF-1水平低于健康對照者仍需擴大實驗樣本證實。

綜上所述，CML患者骨髓微環(huán)境中SDF-1分泌減少，治療獲得MMR后SDF-1 mRNA水平恢復。CML初治慢性期患者SDF-1水平降低與CML發(fā)病和外周血白細胞計數(shù)升高密切相關。SDF-1在TKI耐藥、CML進展中具有一定作用，但其具體分子機制及表達上調的調控因素可能與其他細胞因子、信號通路的相關作用有關[10]，有待進一步研究。

[1] Foroni L, Gerrard G, Nna E, et al. Technical aspects and clinical applications of measuring BCR-ABL1 transcripts number in chronic myeloid leukemia[J]. Am J Hematol, 2009,84(8):517-522.

[2] Kurata M, Suzuki S, Abe S, et al. Bone marrow cell death and proliferation: controlling mechanisms in normal and leukemic state[J]. World J Hematol, 2013,2(1):1-5.

[3] 中華醫(yī)學會血液學分會.中國慢性髓性白血病診斷與治療指南(2016版)[J].中華血液學雜志,2016,37(8):633-639.

[4] Mowafi F, Cagigi A, Matskova L, et al. Chemokine CXCL12 enhances proliferation in pre-B-ALL via STAT5 activation[J]. Pediatr Blood Cancer, 2008,50(4):812-817.

[5] Kim HY, Lee SY, Kim DY, et al. Expression and functional roles of the chemokine receptor CXCR7 in acute myeloid leukemia cells[J]. Blood Res, 2015,50(4):218-226.

[6] 房麗君，涂懷軍，李劍.MSC通過CXCL12/CXCR4軸介導CML細胞對TKI耐藥的進展[J].中國實驗血液學雜志,2015,23(4):1221-1224.

[7] Zhang B, Ho YW, Qin H, et al. Altered Microenvironmental Regulation of Leukemic and Normal Stem Cells in Chronic Myelogenous Leukemia[J]. Cancer Cell， 2012,21(4):577-592.

[8] Jin L, Tabe Y, Konoplev S, et al. CXCR4 up-regulation by imatinib induces chronic myelogenous leukemia (CML) cell migration to bone marrow stroma and promotes survival of quiescent CML cells[J]. Mol Cancer Ther, 2008,7(1):48-58.

[9] Dillmann F， Veldwijk MR， Laufs S， et al. Plenxafor inhibits chemotaxis toward SDF-l and CXCR4-mediaced stroma contact in a dose-dependent manner resulting in increased susceptibility of BCR-ABL+ cell to Imatinib and Nilotinib[J]. Leuk Lymphoma, 2009,50(10):1676-86.

[10] Xie J, Wang W, Si JW, et al. Notch signaling regulates CXCR4 expression and the migration of mesenchymal stem cells[J]. Cell Immunol, 2013,281(1):68-75.

[11] 沙寧，田兆方，李玉紅.甲磺酸伊馬替尼對高氧暴露新生大鼠肺保護作用及其機制[J].山東醫(yī)藥,2015，55(40)：21-23.

張永清(E-mail: zhangyongqing0725@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.13.021

R733.7

B

1002-266X(2017)13-0067-03

2016-11-14)