大黃素對(duì)急性肝功能衰竭大鼠肝臟的保護(hù)作用機(jī)制

于盈 王鳳玲

大黃素對(duì)急性肝功能衰竭大鼠肝臟的保護(hù)作用機(jī)制

于盈 王鳳玲

目的 探討大黃素對(duì)急性肝功能衰竭（ALF）大鼠肝臟的保護(hù)作用機(jī)制。方法 將SD大鼠隨機(jī)分為健康對(duì)照組（6只）、ALF模型組（24只）和大黃素保護(hù)組（24只）。模型組、保護(hù)組用D-氨基半乳糖（D-Gal）建立ALF動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停?2h后保護(hù)組按10mg/kg腹腔注射大黃素，2次/d；健康對(duì)照組注射等量0.9%氯化鈉溶液。模型組、保護(hù)組在建模后24、72、120、168h隨機(jī)各取6只，取門靜脈血檢測(cè)肝功能指標(biāo)，取肝組織檢測(cè)其NF-κB水平，并進(jìn)行比較分析。 結(jié)果 模型組造模后24、72、120h ALT水平均明顯高于對(duì)照組（均P＜0.05），24、72、120、168h AST水平均明顯高于對(duì)照組（均P＜0.05）；保護(hù)組造模后24、72h ALT、AST水平均明顯高于對(duì)照組（均P＜0.05）；造模后72h ALT、AST水平均為模型組高于保護(hù)組（均P＜0.05），造模后120、168h AST水平亦均為模型組高于保護(hù)組（均P＜0.05）。HE染色見對(duì)照組大鼠肝組織結(jié)構(gòu)完整，能清晰看到肝索；模型組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)明顯被破壞，肝細(xì)胞大片壞死。造模后24、72、120h模型組、保護(hù)組NF-κB水平均明顯高于對(duì)照組（均P＜0.05），兩組均在72h達(dá)到高峰；模型組造模后168h明顯高于對(duì)照組（P＜0.05）；造模后24、72、120、168h模型組均高于保護(hù)組（均P＜0.05）。 結(jié)論 大黃素對(duì)ALF大鼠的肝臟功能有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與下調(diào)肝臟組織中NF-κB表達(dá)有關(guān)。

急性肝功能衰竭 大黃素 核因子-κB 大鼠

肝功能衰竭是由多種因素引起肝細(xì)胞合成、分泌以及生物轉(zhuǎn)化功能障礙的一種臨床綜合征，臨床表現(xiàn)以黃疸、肝性腦病、腹腔積液、凝血功能障礙等為主，肝臟組織學(xué)可觀察到廣泛的肝細(xì)胞壞死，壞死部位和范圍因病因、病程而異。肝功能衰竭包括急性、慢性、亞急性，其中急性肝功能衰竭（ALF）是由肝臟功能急劇減退引起黃疸、凝血功能低下和肝性腦病等臨床表現(xiàn)的一種臨床綜合征。ALF發(fā)病急、病情進(jìn)展迅速，當(dāng)前臨床上尚無有效的治療方法。大黃是臨床治療ALF應(yīng)用較為廣泛的一種中藥，其主要有效成分是大黃素，目前有研究證實(shí)大黃素具有多種活性作用，包括抗炎、肝功能保護(hù)、免疫調(diào)節(jié)等，亦有學(xué)者應(yīng)用大黃制劑防治肝癌、保護(hù)肝功能等[1－4]。NF-κB參與細(xì)胞增殖過程，其在肝臟組織中表達(dá)水平的變化能直接反映細(xì)胞增殖功能，因此可用來評(píng)價(jià)肝細(xì)胞的再生作用。故本研究通過建立ALF動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ筒⒉捎么簏S素治療，觀察肝組織病理學(xué)改變以及NF-κB表達(dá)、肝功能指標(biāo)的變化，以探討大黃素對(duì)肝臟功能保護(hù)作用的可能機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 儀器與試劑 全自動(dòng)生化分析儀（濟(jì)寧市潤(rùn)煤工礦物資有限公司）；NF-κB-抗（廣州泰諾迪生物科技有限公司）；D-氨基半乳糖（D-Gal，重慶醫(yī)科大學(xué)化學(xué)教研室）；大黃素（廣州泰諾迪生物科技有限公司，批號(hào)：110756-200110）；NF-κB免疫組化試劑盒（廣州泰諾迪生物科技有限公司）。

1.2 動(dòng)物分組 選取54只健康清潔級(jí)雄性SD大鼠（溫州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證標(biāo)號(hào)：2010-04-12）54只，體重180～220g。按隨機(jī)數(shù)字表法分成健康對(duì)照組（6只）、ALF模型組（24只）和大黃素保護(hù)組（24只），3組大鼠均予相同喂養(yǎng)條件和飲食（溫度18～26℃，相對(duì)濕度5%～10%，噪聲＜85dB，每1h通氣換風(fēng)8～12次，飼喂量5g）。本研究符合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理學(xué)原則。

1.3 模型建立 所有大鼠造模前12h禁食、4h禁飲。稱取10g D-Gal溶于100ml 0.9%氯化鈉注射液中，用1mol/L NaOH將D-Gal溶液pH調(diào)至7.0，最終濃度調(diào)至10%。模型組、保護(hù)組按照1.25g/kg腹腔注射D-Gal溶液以制作ALF動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，?duì)照組注射等量0.9%氯化鈉溶液；造模12h后保護(hù)組按10mg/kg腹腔注射大黃素，2次/d。

1.4 檢測(cè)方法 對(duì)照組給藥24h后取靜脈血，遂將大鼠經(jīng)頸椎脫臼法處死并固定于解剖板上，用碘酒消毒后沿腹中線打開腹腔，取中央肝組織；模型組和保護(hù)組分別在給藥24、72、120、168h時(shí)取6只大鼠行腹腔麻醉、采集靜脈血、取肝組織，方法同上。靜脈血離心取上清液，－80℃冰箱保存；肝組織用甲醛固定，行病理及免疫組化檢測(cè)。（1）使用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清標(biāo)本中ALT、AST等肝功能指標(biāo)變化。（2）將甲醛固定的肝組織用石蠟包埋切片，HE染色，在顯微鏡下觀察肝組織病理學(xué)變化。將甲醛固定的肝組織脫水，嚴(yán)格按試劑盒說明檢測(cè)NF-κB水平。采用苯基丁酸（PBA）為陰性對(duì)照，以出現(xiàn)棕黃色細(xì)胞核為陽性。采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析并測(cè)量肝組織平均光密度值（OD），OD=積分光密度/組織面積。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料用表示，組別間比較采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 3組大鼠肝功能指標(biāo)變化 模型組造模后24、72、120h ALT水平均明顯高于對(duì)照組（均P＜0.05），24、72、120、168h AST水平均明顯高于對(duì)照組（均P＜0.05）；保護(hù)組造模后24、72h ALT、AST水平均明顯高于對(duì)照組（均P＜0.05）。造模后72h ALT、AST水平均為模型組高于保護(hù)組（均P＜0.05），造模后120、168h AST水平亦為模型組高于保護(hù)組（均P＜0.05），見表1。

表1 3組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)肝功能指標(biāo)變化

2.2 肝組織病理學(xué)改變 對(duì)照組大鼠肝組織結(jié)構(gòu)完整，能清晰看到肝索，見圖1a；模型組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)明顯被破壞，肝細(xì)胞大片壞死，見圖1b。

圖1 大鼠肝組織病理學(xué)改變（a：對(duì)照組；b：模型組；HE染色，×400）

2.3 3組大鼠肝組織中NF-κB表達(dá)水平變化 對(duì)照組NF-κB不表達(dá)或有少量表達(dá)，NF-κB表達(dá)水平為（0.038±0.004）μg/ml。造模后24、72、120h模型組、保護(hù)組NF-κB水平均明顯高于對(duì)照組（均P＜0.05），兩組均在72h達(dá)到高峰；模型組造模后168h NF-κB表達(dá)水平亦明顯高于對(duì)照組（P＜0.05）。造模后24、72、120、168h NF-κB表達(dá)水平為模型組高于保護(hù)組（均P＜0.05），見表2。

表2 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)肝組織中NF-κB表達(dá)水平比較（μg/ml）

3 討論

ALF最突出的表現(xiàn)是短時(shí)間內(nèi)肝細(xì)胞變性、壞死，炎癥因子明顯增加。由于ALF病情進(jìn)展快且存在多種并發(fā)癥，因此其臨床治療難度大、預(yù)后差、病死率高。目前肝移植治療肝功能衰竭較為有效，但存在供體缺乏、費(fèi)用昂貴等問題，故尚未推廣應(yīng)用[5－6]。因此，本研究探索一種中藥治療方法具有現(xiàn)實(shí)意義。

大黃素是大黃主要有效成分之一，屬于蒽醌類，近年來在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的相關(guān)研究較為廣泛。目前已證實(shí)大黃素具有保護(hù)肝細(xì)胞、抗炎、抗腫瘤等生物學(xué)作用；此外，大黃素對(duì)機(jī)體具有雙重調(diào)節(jié)作用，既能抑制T淋巴細(xì)胞增殖，減少膿毒血癥陽性率，減少炎癥因子過度釋放，又能抑制不同有絲分裂刺激脾細(xì)胞增殖。有學(xué)者應(yīng)用大黃素治療急性胰腺炎發(fā)現(xiàn)，連續(xù)治療1周的患者血淀粉酶、二胺氧化酶（DAO）等明顯下降，且明顯低于對(duì)照組，推測(cè)大黃素能抑制鈉離子、鉀離子，促進(jìn)上皮細(xì)胞離子主動(dòng)運(yùn)轉(zhuǎn)，具有廣泛抗菌、抗病毒的效果[7]。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，保護(hù)組血清ALT、AST水平明顯下降，且低于模型組，說明大黃素對(duì)肝功能有一定保護(hù)作用。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)大黃素能抑制炎癥因子，減少內(nèi)毒素血癥，此外在清除氧自由基、減少炎癥遞質(zhì)方面也有明顯作用[8]。其他研究還發(fā)現(xiàn)注射大黃素后體內(nèi)炎癥因子如TNF-α、IL-6、IL-1等分泌明顯減少，認(rèn)為大黃素能減少肝細(xì)胞凋亡、減輕炎癥反應(yīng)[9]。本研究中大黃素對(duì)肝的保護(hù)作用可能與上述機(jī)制有關(guān)。由于細(xì)胞DNA合成與NF-κB密切相關(guān)[10]；NF-κB表達(dá)量能直接反映細(xì)胞增殖和復(fù)制活躍程度，是反映細(xì)胞增殖效應(yīng)的重要指標(biāo)[11-14]。本研究比較NF-κB表達(dá)發(fā)現(xiàn)隨著時(shí)間的推移，模型組大鼠肝組織中NF-κB水平明顯上升，造模后72h達(dá)高峰；而保護(hù)組大鼠肝組織中各時(shí)間點(diǎn)NF-κB水平均明顯低于模型組。這說明大黃素不僅對(duì)ALT、AST產(chǎn)生影響，還會(huì)影響NF-κB表達(dá)水平；提示大黃素可能通過抑制炎性細(xì)胞分泌和聚集以減少NF-κB表達(dá)，進(jìn)而發(fā)揮抗細(xì)胞凋亡的作用。

綜上所述，大黃素可能減少炎性細(xì)胞的釋放，抑制IKK細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路，進(jìn)而達(dá)到抑制肝細(xì)胞凋亡的效果，為肝細(xì)胞再生提供微環(huán)境。以上可能是大黃素治療ALF的機(jī)制，這為大黃素的臨床應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)。

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Effects of emodin on liver function in rats with acute liver failure and its mechanism

YU Ying,WANG Fengling.Department of Infectious Diseases,Taizhou Municipal Hospital,Taizhou 318000，China

Objective To investigate the effect of emodin on liver function in acute hepatic failure and its mechanism. Methods SD rats were randomly divided into three groups:healthy control group(n=6),acute liver failure(ALF)model group (n=24)and emodin treatment group (n=24).Acute liver failure was induced by intraperitoneal injection of D-galactosamine (D-Gal).Twelve hours after the model was established,the emodin group received intraperitoneal injection of 10mg/kg emodin twice daily.At 24,72,120 and 168h after modeling,6 rats were sacrificed in ALF group and emodin group.The portal vein blood samples were collected and hepatic function was examined.Liver tissue was fixed with 10%formalin,and the expression of NF-κB in liver tissue was detected by immunohistochemistry. Results After 24h of modeling,the levels of alanine aminotransferase(ALT)and aspartate aminotransferase(AST)in serum were significantly higher than those in healthy control group (P＜0.01),after 72h of modeling,the liver function of rats in ALF group was significantly higher than of emodin group at the same time point(P＜0.01),after 24h of modeling,the expression of NF-κB in ALF group was significantly higher than that in healthy control group(P＜0.01),reached the peak at 72h,then decreased after 120h.The expression of NF-κB in emodin group was significantly lower than that in ALF group at 72,120 and 168h after modeling(P＜0.01). Conclusion Emodin has protective effect on acute liver failure in rats,which may be related to the down-regulation of NF-κB expression.

Acute liver failure Emodin NF-κB Rat

2017-01-03）

（本文編輯：陳丹）

10.12056/j.issn.1006-2785.2017.39.7.2017-21

浙江省中醫(yī)藥科學(xué)研究基金計(jì)劃項(xiàng)目（2010ZA118）；臺(tái)州市椒江區(qū)科技計(jì)劃項(xiàng)目（112070）

318000 臺(tái)州市立醫(yī)院感染內(nèi)科

于盈，E-mail：lhjyy@126.com