蘋果炭疽葉枯病菌GcAP1復(fù)合體β亞基基因的克隆及功能分析

張俊祥，冀志蕊，王娜，徐成楠，遲福梅，周宗山

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所，遼寧興城 125100）

蘋果炭疽葉枯病菌GcAP1復(fù)合體β亞基基因的克隆及功能分析

張俊祥，冀志蕊，王娜，徐成楠，遲福梅，周宗山

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所，遼寧興城 125100）

【目的】明確銜接蛋白（adaptor protein）GcAP1復(fù)合體β亞基在蘋果炭疽葉枯病菌(Glomerella cingulata)生長發(fā)育和致病過程中的功能，檢測GcAP1β在該菌中的時空表達模式，并揭示其是否調(diào)控多聚半乳糖醛酸內(nèi)切酶（endopolygalacturonase）基因CgPG1和CgPG2、果膠裂解酶（pectin lyase）基因pnl-1和pnl-2以及果膠酸酯裂解酶（pectate lyase）基因pelA和pelB的表達，為深入開展蘋果炭疽葉枯病菌銜接蛋白在致病信號傳導(dǎo)途徑中的分子機制研究打下基礎(chǔ)。【方法】通過構(gòu)建GcAP1β基因敲除載體和GcAP1β-gfp融合表達載體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)（ATMT）獲得Δgcap1β突變體和GcAP1β恢復(fù)菌株Δgcap1β-GcAP1β，并由RT-PCR和Southern雜交分析進行鑒定。以野生型菌株W16為對照，對Δgcap1β突變體和GcAP1β恢復(fù)菌株Δgcap1β-GcAP1β的生長速度、產(chǎn)孢能力、分生孢子萌發(fā)率及附著胞形成率和致病性進行測定。利用生物信息學(xué)軟件ProtComp 9.0和TMHMM對GcAP1β蛋白進行結(jié)構(gòu)分析，并結(jié)合GcAP1β-GFP信號觀測，進行GcAP1β的亞細胞定位。利用qRT-PCR技術(shù)，檢測GcAP1β在菌絲、分生孢子、芽管、附著胞和侵染階段的表達量，并檢測CgPG1、 CgPG2、pnl-1、pnl-2、pelA和pelB在野生型菌株和Δgcap1β突變體中的表達量?！窘Y(jié)果】GcAP1β基因全長2 321 bp，含有3個內(nèi)含子，編碼720個氨基酸。與野生型菌株W16相比，Δgcap1β突變體菌落成褶皺狀，菌絲生長速度明顯減慢，而分生孢子產(chǎn)量、分生孢子萌發(fā)率、附著胞形成率無顯著差異。Δgcap1β致病力明顯降低，僅在蘋果葉片上引起極小的點狀斑。GcAP1β基因恢復(fù)菌株Δgcap1β-GcAP1β完全修復(fù)了因GcAP1β基因缺失造成的表型缺陷。熒光檢測顯示，融合蛋白GcAP1β-GFP分布于細胞質(zhì)中。qRT-PCR檢測結(jié)果表明，GcAP1β在蘋果炭疽葉枯病菌各個發(fā)育階段都有表達，且在侵染后表達量相對最高。GcAP1β的缺失導(dǎo)致CgPG1表達量降低至20.3%，CgPG2表達量降低至16.5%，pnl-1表達量降低至8.2%，pnl-2表達量降低至14.4%，pelA表達量降低至4.4%，pelB表達量降至0.8%?！窘Y(jié)論】銜接蛋白GcAP1復(fù)合體分布于細胞質(zhì)中，是蘋果炭疽葉枯病菌生長發(fā)育所需要的；GcAP1調(diào)控CgPG1、CgPG2、pnl-1、pnl-2、pelA和pelB的表達，是蘋果炭疽葉枯病菌一個重要的毒力因子。

銜接蛋白；果膠酶；蘋果；炭疽菌；致病力

0 引言

【研究意義】銜接蛋白（adaptor protein，AP）在哺乳動物細胞內(nèi)信號的傳遞、蛋白質(zhì)的分揀及向囊泡轉(zhuǎn)運過程中發(fā)揮著重要作用[1]，但關(guān)于 AP蛋白在真菌中的功能鮮有報道。以GcAP1復(fù)合體β亞基基因為出發(fā)點，揭示其在蘋果炭疽葉枯病菌生長發(fā)育和致病過程中的功能，可為植物病害防治的新途徑、新方法提供線索，并對植物病原真菌致病機理研究具有重要意義。【前人研究進展】近幾年，蘋果一種重要的新病害——蘋果炭疽葉枯?。℅lomerella leaf spot of apple），在中國蘋果主產(chǎn)區(qū)連年大發(fā)生，給蘋果產(chǎn)業(yè)帶來巨額損失[2]?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，圍小叢殼菌（Glomerella cingulata）（無性態(tài)：膠胞炭疽菌 Colletotrichum gloeosporioides）[3-5]、尖孢炭疽菌（C. acutatum）[6]、喀斯特炭疽菌（C. karstii）[7]、果生刺盤孢（C. fructicola）和隱秘刺盤孢（C. aenigma）[8]均可引起蘋果炭疽葉枯病。炭疽菌通過分生孢子萌發(fā)，產(chǎn)生芽管和附著胞，附著胞下形成的侵染釘可直接侵入寄主[4]。像其他植物病原真菌一樣，炭疽菌（Colletotrichum）侵染過程受cAMP和MAPK路徑調(diào)控[9]。膠胞炭疽菌通過分泌果膠酶，例如聚半乳糖醛酸酶（polygalacturonase，PG）、果膠裂解酶（pectin lyase，PNL）和果膠酸酯裂解酶（pectate lyase，PEL），克服寄主細胞壁中的果膠，使其成功在寄主體內(nèi)定殖。研究表明，PG1、 PG2、pnl-1、pnl-2、pelA和pelB單個基因突變或雙基因突變均明顯地降低病原菌的致病力[10-14]。最近的研究表明，在堿性條件下，轉(zhuǎn)錄因子pacC調(diào)控pelB的表達[15]，但關(guān)于果膠酶基因的調(diào)控機制尚需進一步研究。AP蛋白以復(fù)合體形式存在于生物體中，具有重要的功能[16-17]。在哺乳動物中，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)5種類型的AP復(fù)合體，即AP-1、AP-2、AP-3、AP-4和AP-5[18-19]。AP蛋白由4個不同的亞基構(gòu)成（δ、β、μ和σ），2個大亞基（δ和β）具有識別和結(jié)合網(wǎng)格蛋白的功能，1個中亞基（μ）負責(zé)蛋白的分揀和跨膜裝配，小亞基（σ）具有穩(wěn)定復(fù)合體的作用[18,20-21]。目前，膠胞炭疽菌菌株23的基因組測序已完成，其Contig序列公布在“Comparative Fungal Genomics Platform”。此外，博德研究所（http://www.broadinstitute.org）還公布了玉米炭疽菌（C. graminicola）和希金斯刺盤孢（C. higginsiamim）全基因序列。這些基因組信息為炭疽菌的致病機理研究創(chuàng)造了條件?！颈狙芯壳腥朦c】為開展蘋果炭疽葉枯病菌致病機制研究，筆者課題組之前利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化（ATMT）方法，構(gòu)建了蘋果炭疽葉枯病菌強致病力菌株W16的T-DNA插入突變體庫[5]。在對一些T-DNA插入突變體進行致病性測驗中，發(fā)現(xiàn)一株突變體A7346對蘋果葉片及果實致病力明顯降低。進一步揭示突變體A7346致病力降低的分子機制，將是研究蘋果炭疽葉枯病菌致病機制的一個很好契機。【擬解決的關(guān)鍵問題】闡明 GcAP1復(fù)合體 β亞基在蘋果炭疽葉枯病菌致病過程中的功能，明確GcAP1復(fù)合體是否調(diào)控CgPG1、CgPG2、pnl-1、pnl-2、pelA和 pelB的表達，為深入開展 AP蛋白在蘋果炭疽葉枯病菌致病信號傳導(dǎo)途徑中的分子機制研究打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

試驗于 2015—2016年在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所完成。

1.1 供試菌株及培養(yǎng)條件

蘋果炭疽葉枯病菌（G. cingulata）強致病力菌株W16，由筆者課題組2014年分離自遼寧省綏中市一個病害重發(fā)生果園[5]，W16和由其衍生的轉(zhuǎn)化子采用PDA 培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefacien）菌株 LBA4404（由云南農(nóng)業(yè)大學(xué)何月秋教授惠贈）采用LB培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，用于ATMT。大腸桿菌（Escherichia coli）菌株TG1采用LB培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，用作質(zhì)粒的宿主。為檢測GcAP1β的表達模式，RNA提取樣品分別取自菌絲（PDA培養(yǎng)3 d的菌絲體）、分生孢子（無菌蒸餾水刮洗 PDA平板10 d的培養(yǎng)物，2層擦鏡紙過濾除去菌絲后，離心收集分生孢子）、芽管（用毛筆將106個/mL分生孢子懸浮液涂在葉片正面，28℃條件下保濕培養(yǎng)6 h后，用滅菌刀片輕刮葉子葉面，收集萌發(fā)的分生孢子）、附著胞（方法同芽管，保濕培養(yǎng)10 h，收集葉片表面形成的附著胞）和葉片接種48 h（方法同芽管，保濕培養(yǎng) 48 h，將整個葉片液氮速凍后研磨）。為檢測CgPG1、CgPG2、pnl-1、pnl-2、pelA和pelB在GcAP1β突變體中的表達量，RNA提取樣品分別取自PDA培養(yǎng)6 d的菌絲體。

1.2 核酸操作

表 1 PCR引物序列Table 1 The primers used in this study

1.3 突變體A7346 T-DNA右翼序列分析

以質(zhì)粒pCamhybgfp1（GenBank accession number：KX223837）為模板，用引物H-F1和H-F2進行PCR擴增，產(chǎn)物純化后作為探針（P1）進行A7346 T-DNA插入拷貝數(shù)的Southern blot分析。A7346 T-DNA右翼序列采用hiTAIL-PCR方法[26]進行PCR擴增，產(chǎn)物連結(jié)到pUCm-T載體（生工生物），由北京三博遠志生物技術(shù)有限責(zé)任公司測序。獲得的 T-DNA右翼序列參考圍小從殼菌菌株23基因組（http://genome.jgi.doe. gov/Gloci1/Gloci1.home.html），進行本地blast分析。目的GcAP1復(fù)合體β亞基基因（GcAP1β）利用比較真菌基因組平臺[27]進一步進行分析，并提取基因結(jié)構(gòu)及其上下游序列和蛋白序列信息。

1.4 GcAP1復(fù)合體β亞基基因的敲除與恢復(fù)

以野生型菌株W16基因組為模板，用引物S2Dr1和S3S1擴增GcAP1β基因上游序列，SalⅠ/SpeⅠ酶切后，連結(jié)到SalⅠ/SpeⅠ酶切的pCambiaMX9（GenBank accession number：KX755248），生成質(zhì)粒pCamS1。再以野生型菌株W16基因組為模板，用引物S2G2和S2DF2擴增GcAP1β基因下游序列，EcoRⅠ/SalⅠ酶切后，連結(jié)到 EcoRⅠ/SalⅠ酶切的 pCambiaMX9（GenBank accession number：KX755248），生成質(zhì)粒pCamS2。約2.0 kb的潮霉素抗性基因（hph）序列從質(zhì)粒pTFCM[28]（由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)姜道宏教授惠贈）SalⅠ酶切得到后，連結(jié)到SalⅠ酶切的pCamS2，形成GcAP1β基因敲除載體 pCamS2KN1（圖 1）。pCamS2KN1被電轉(zhuǎn)到農(nóng)桿菌 LBA4404中后，利用ATMT方法[29]將GcAP1β從W16基因組中敲除。篩選潮霉素B（生工生物，終濃度100 μg·mL-1）抗性轉(zhuǎn)化子，對假定的GcAP1β基因突變體用引物HB1和S2R1進行特定位點的PCR擴增分析（圖1），并以探針P2（以野生型菌株W16基因組為模板，由引物P-f和P-r進行PCR擴增及純化獲得）進行Southern blot鑒定。以 W16基因組為模板，用引物 HB1和 HB2擴增GcAP1β及其假定的啟動子序列，BamHⅠ/SalⅠ酶切后，連結(jié)到載體 pGapneoR12（GenBank accession number：KY363244），生成的GcAP1β基因恢復(fù)載體pCamGcAP1β（形成GcAP1β-gfp融合表達結(jié)構(gòu)）被電轉(zhuǎn)到農(nóng)桿菌LBA4404中，利用ATMT[29]將GcAP1β-gfp融合基因轉(zhuǎn)移到Δgcap1β突變體基因組中，篩選G418（生工生物，終濃度500 μg·mL-1）抗性轉(zhuǎn)化子，對假定的GcAP1β基因恢復(fù)菌株用引物S2F和S2R進行PCR擴增分析和GFP信號檢測（DM5000B型熒光顯微鏡，德國Leica）進行確定。

圖 1 GcAP1β的克隆和鑒定Fig. 1 The cloning and identification of GcAP1β

1.5 表型分析

真菌的生長速度和產(chǎn)孢能力測驗采用WU等[30]的方法進行。挑取氣生菌絲接種于PDA平板上（直徑9 cm），培養(yǎng)6 d后，測量菌落直徑；平板繼續(xù)培養(yǎng)至10 d，用10 mL無菌水刮洗平板，用擦鏡紙濾去菌絲后，采用血球計數(shù)板進行測定，計算每毫升孢子懸浮液中的產(chǎn)孢量。分生孢子的萌發(fā)、附著胞的形成能力測驗采用XU等[31]的方法。將無菌的疏水載玻片至于水瓊脂（8%）平板上，將10 μL分生孢子懸浮液（104個/mL）滴于載玻片，28℃黑暗條件下，保濕培養(yǎng)至8 h，觀測生孢子萌發(fā)情況，保濕培養(yǎng)至20 h，觀測附著胞形成情況。每個重復(fù)觀測100個分生孢子。計算公式：孢子萌發(fā)率（%）=萌發(fā)的孢子數(shù)/檢測的孢子總數(shù)×100；附著胞形成率（%）=形成附著胞的萌發(fā)孢子數(shù)/檢測的萌發(fā)孢子總數(shù)×100。

葉片致病性測定：摘取成熟度一致的金冠（感病品種）葉片，無菌水沖洗后，用2 μL分生孢子懸浮液（1×105個/mL）滴在葉片正面，每個葉片接種6個懸滴，接種后，置于塑料盒中冷凝的10%水瓊脂上。28℃條件下，黑暗培養(yǎng)10 h后，轉(zhuǎn)入光照14 h，以此循環(huán)。每天觀察發(fā)病情況。蘋果致病性測定：蘋果果實被75%酒精消毒后，用牙簽刺約3 mm深的傷口，2 μL分生孢子懸浮液（1×105個/mL）接種于傷口處，28℃條件下，接種10 d后觀測果實發(fā)病情況。野生型菌株W16作為陽性對照。每個處理重復(fù)3次，用DPS軟件進行差異顯著性分析。

優(yōu)質(zhì)的思想政治教育是培養(yǎng)高素質(zhì)人才的保障，加強思想政治教育的研究，探討思想政治教育的有效途徑，才能使思想政治教育取得好的效果，才能使大學(xué)生思想政治素質(zhì)得到提高，進而使大學(xué)生符合社會發(fā)展的要求。經(jīng)過社會、教育者和大學(xué)生的共同努力，相信思想政治教育會朝著更好的方向發(fā)展，大學(xué)生的思想政治素質(zhì)會得到更大地提高。

1.6 生物信息學(xué)分析

應(yīng)用ClustalX對GcAP1β基因序列及其cDNA序列進行比對，以確定GcAP1β基因內(nèi)含子的有無。應(yīng)用 InterProScan[32-33]對 GcAP1β進行保守結(jié)構(gòu)域（Conserved Domain）分析。應(yīng)用 SignalP 4.1[34]對 GcAP1β的N端進行信號肽分析。應(yīng)用ProtComp 9.0（http://www.softberry.com）對GcAP1β進行亞細胞定位分析。應(yīng)用TMHMM Server v. 2.0（http://www.cbs. dtu.dk/services/TMHMM/）對GcAP1β進行跨膜螺旋結(jié)構(gòu)分析。

2 結(jié)果

2.1 GcAP1β的克隆與分析

Southern blot分析結(jié)果表明，T-DNA插入突變體A7346經(jīng)過酶切的泳道只雜交出一個條帶，推測其表型是由T-DNA以單拷貝插入至基因組所致（圖2）。運用hiTail-PCR技術(shù)克隆得到的T-DNA右翼序列與圍小從殼菌菌株23基因組進行比對，發(fā)現(xiàn)T-DNA插入位點位于一個注釋但功能尚未解析的基因（e_gw1.11.622.1）的第一個外顯子內(nèi)。InterProScan分析顯示該基因蛋白序列含有典型的銜接蛋白AP1復(fù)合體 β亞基結(jié)構(gòu)域（IPR026739）。因此，將這一基因命名為 GcAP1β（GcAP1復(fù)合體 β亞基基因）。GcAP1β基因全長2 321 bp，含有3個內(nèi)含子，編碼720個氨基酸。SignalP預(yù)測該基因蛋白序列無信號肽，表明其可能不是分泌蛋白。

圖 2 T-DNA插入突變體A7346 Southern雜交分析Fig. 2 Southern hybridization analysis of T-DNA insertional mutant A7346

2.2 Δgcap1β突變體和GcAP1β基因恢復(fù)菌株的分子鑒定

特定位點的PCR檢測結(jié)果（圖3-A）顯示，Δgcap1β突變體Δgcap1β-1、Δgcap1β-2和Δgcap1β-3基因組中的GcAP1β均被敲除。Southern blot分析結(jié)果顯示，Δgcap1β-1、Δgcap1β-2和Δgcap1β-3均雜交出一條帶，而野生型菌株 W16雜交出與敲除突變體長度不同的一條帶（圖3-B），表明外源的hph在Δgcap1β突變體基因組中為單位點、單拷貝的插入，也證實GcAP1β被hph替換。RT-PCR檢測結(jié)果（圖3-C）表明，GcAP1β被導(dǎo)入到突變體Δgcap1β-1基因組中，且能在恢復(fù)菌株Δgcap1β-GcAP1β中表達。

2.3 GcAP1β缺失對菌絲生長的影響

在PDA平板上，與野生型菌株W16相比，Δgcap1β突變體Δgcap1β-1、Δgcap1β-2和Δgcap1β-3菌落成褶皺狀，菌絲生長速度明顯減慢（圖4、表2），但分生孢子產(chǎn)量、分生孢子萌發(fā)率、附著胞形成率則無顯著差異（表2）。

2.4 GcAP1β的缺失對致病力的影響

致病測驗結(jié)果顯示，Δgcap1β在蘋果葉片上引起極小的點狀斑，與A7346極為相似，然而同條件下，W16引起明顯的壞死斑（圖5-A）；Δgcap1β在蘋果果實上引起較小的凹陷斑，而W16引起的病斑明顯比Δgcap1β大的多（圖5-B）。此外，GcAP1β基因恢復(fù)菌株Δgcap1β-GcAP1β完全修復(fù)了因GcAP1β基因缺失造成的表型缺陷（圖5、表2）。這些結(jié)果表明GcAP1β的缺失導(dǎo)致蘋果炭疽葉枯病菌菌絲生長減慢和致病力降低。表 2 蘋果炭疽葉枯病菌野生型菌株及其衍生的轉(zhuǎn)化子表型分析

圖 3 Δgcap1β突變體和GcAP1β基因恢復(fù)菌株的分子鑒定Fig. 3 Molecular confirmation of the Δgcap1β mutants and the GcAP1β complementation strain Δgcap1β-GcAP1β

圖4 蘋果炭疽葉枯病菌野生型菌株及其衍生的轉(zhuǎn)化子菌落形態(tài)Fig. 4 Colony morphology of G. cingulata strain W16 and its derived transformants

圖5 蘋果炭疽葉枯病菌野生型菌株及其衍生的轉(zhuǎn)化子致病力測定Fig. 5 Pathogenicity assay of G. cingulata strain W16 and its derived transformants

Table 2 Phenotypic analysis of G. cingulata strain W16 and its derived transformants

**表示在P=0.01水平與野生型的差異顯著** represented statistically significant difference compared with W16, P=0.01

2.5 GcAP1β亞細胞定位

TMHMM Server v. 2.0分析結(jié)果表明，GcAP1β不具有跨膜螺旋結(jié)構(gòu)；ProtComp 9.0分析結(jié)果表明，GcAP1β沒有明確的定位信號。為了確定該蛋白的亞細胞定位，構(gòu)建了GcAP1β-gfp融合表達的GcAP1β恢復(fù)菌株 Δgcap1β-GcAP1β。熒光顯微鏡下檢測結(jié)果表明，融合蛋白 GcAP1β-GFP分布于細胞質(zhì)中，與T-DNA插入突變體A7346中GFP蛋白（gfp的表達由GAPDH啟動子控制）分布特點相似（圖6）。

圖6 融合蛋白GcAP1β-GFP分布于細胞質(zhì)中Fig. 6 The fused protein GcAP1β-GFP is distributed to cytoplasm

2.6 GcAP1β在蘋果炭疽葉枯病菌發(fā)育各階段表達情況qRT-PCR檢測結(jié)果表明，GcAP1β在蘋果炭疽葉枯病菌各個發(fā)育階段均有表達。相對于菌絲階段（PDA培養(yǎng)3 d時）的表達量，GcAP1β在分生孢子、芽管和附著胞階段表達量均有不同程度的降低，而在侵染后（葉片接種 48 h）表達量卻明顯提高（圖7）。

圖 7 GcAP1β在各發(fā)育階段的表達情況Fig. 7 The expression of GcAP1β at different development stages

2.7 GcAP1β的缺失對CgPG1、CgPG2、pnl-1、pnl-2、pelA和pelB表達量的影響

由于Δgcap1β突變體導(dǎo)致蘋果炭疽葉枯病菌致病力的降低（圖7），筆者假設(shè)Δgcap1β突變體中果膠酶相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄受阻。因此，利用qRT-PCR技術(shù)檢測了CgPG1、CgPG2、pnl-1、pnl-2、pelA和pelB在 Δgcap1β突變體中的表達情況。相比于野生型菌株W16，在 Δgcap1β突變體中，CgPG1表達量降低至20.3%，CgPG2表達量降低至16.5%，pnl-1表達量降低至8.2%，pnl-2表達量降低至14.4%，pelA表達量降低至4.4%，pelB表達量降低了至0.8%（圖8）。這些結(jié)果顯示GcAP1β正調(diào)控基因CgPG1、CgPG2、pnl-1、pnl-2、pelA和pelB的表達。

3 討論

真菌菌絲的生長與囊泡（vesicles）的營養(yǎng)運輸密切相關(guān)[35]。本研究結(jié)果表明，GcAP1復(fù)合體β亞基的缺失導(dǎo)致蘋果炭疽葉枯病菌菌絲生長緩慢；qRT-PCR檢測結(jié)果表明，GcAP1β在菌絲生長階段表達量相對較高（圖 7）。值得注意的是，在哺乳動物中，銜接蛋白 AP-1復(fù)合體負責(zé)運輸?shù)鞍字辆W(wǎng)格蛋白包被的囊泡（clathrin-coated vesicles）中[18,36]。因此，筆者推測真菌菌絲的生長與 GcAP1復(fù)合體負責(zé)運輸?shù)鞍字聊遗莸墓δ苊芮邢嚓P(guān)。膠胞炭疽菌侵入寄主后，先保持活體營養(yǎng)型生長，然后轉(zhuǎn)為死體營養(yǎng)型生長[30]。蘋果炭疽葉枯病菌發(fā)病速度特別快，從侵染葉片到發(fā)病落葉僅需3—4 d[37]。本研究中，蘋果炭疽葉枯病菌葉片接種48 h時已出現(xiàn)病斑。qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，GcAP1復(fù)合體β亞基基因在蘋果炭疽葉枯病菌各個發(fā)育階段均有表達，但是以侵染后（葉片接種48 h時）表達量相對最高（圖7）。這些結(jié)果說明，GcAP1復(fù)合體β亞基基因在蘋果炭疽葉枯病菌死體營養(yǎng)型生長階段中發(fā)揮著重要作用。

圖 8 Δgcap1β突變體CgPG1、CgPG2、pnl-1、pnl-2、pelA和pelB的表達量分析Fig. 8 The expression analyses of CgPG2, pnl-1, pnl-2, pelA and pelB in the Δgcap1β mutant

在植物病原真菌中，由附著胞調(diào)節(jié)的侵入寄主方式在其致病過程起到重要作用。在炭疽菌中，絲裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinase，MAPK）級聯(lián)信號途徑調(diào)控其分生孢子的萌發(fā)、附著胞的形成[9]。在釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中，銜接蛋白Ste50與G蛋白有關(guān)的Cdc42-Ste20激酶復(fù)合體互作后，激活MAPKKK基因Ste11的轉(zhuǎn)錄，進而激活 MAPK級聯(lián)信號傳遞鏈[38]。在膠胞炭疽菌中，MAPK途徑基因中的CgMEK1或Cgl-SLT2的缺失，導(dǎo)致萌發(fā)的分生孢子不能形成附著胞。本研究中，GcAP1復(fù)合體β亞基基因的缺失對分生孢子的萌發(fā)、附著孢的形成無影響（表2）。這一結(jié)果暗示，GcAP1復(fù)合體可能對基因CgMEK1和Cgl-SLT2的轉(zhuǎn)錄無直接或間接的影響。

在植物病原菌和寄主相互作用中，病原菌分泌果膠酶降解寄主細胞壁的果膠聚合體，促進病原菌的侵入和定殖[10-14]。此外，病原菌的果膠酶分泌量不僅決定其致病力的強弱，還決定其致害的癥狀[39]。因為Δgcap1β突變體僅在蘋果葉片上引起極小的點狀斑以及在蘋果果實（有傷接種）上引起較小的凹陷斑（圖5），筆者假設(shè)Δgcap1β突變體果膠酶有關(guān)基因（CgPG1、CgPG2、pnl-1、pnl-2、pelA和 pelB）轉(zhuǎn)錄可能受阻。qRT-PCR檢測結(jié)果表明，Δgcap1β突變體果膠酶有關(guān)基因的表達量與野性型菌株的相比明顯降低（圖8）。這些結(jié)果表明，Δgcap1β突變體致病力下降的一個重要原因是，GcAP1蛋白β亞基基因的缺失阻遏果膠酶有關(guān)基因的表達。但是，GcAP1蛋白是否直接或間接調(diào)控果膠酶有關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，有待進一步研究。

4 結(jié)論

銜接蛋白 GcAP1復(fù)合體分布于細胞質(zhì)中。GcAP1β在分生孢子、芽管和附著胞階段均表達，但表達量明顯低于菌絲生長階段，是蘋果炭疽葉枯病菌生長發(fā)育所需要的。GcAP1調(diào)控 CgPG1、CgPG2、pnl-1、pnl-2、pelA和pelB的表達，是蘋果炭疽葉枯病菌一個重要的毒力因子。

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（責(zé)任編輯 岳梅）

Gene Cloning and Functional Analysis of GcAP1 Complex Beta Subunit in Glomerella cingulata

ZHANG JunXiang, JI ZhiRui, WANG Na, XU ChengNan, CHI FuMei, ZHOU ZongShan
(Research Institute of Pomology, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Xingcheng 125100, Liaoning)

【Objective】 The objectives of this study are to determine the function of β subunit of adaptor protein GcAP1 complex in growth and pathogenicity of Glomerella leaf spot of apple pathogen Glomerella cingulata, investigate expression patterns of the GcAP1β in the fungal growth and pathogenicity, decipher whether or not GcAP1β regulate the expression of endopolygalacturonase genes CgPG1 and CgPG2, pectin lyase genes pnl-1 and pnl-2, pectate lyase genes pelA and pelB, and to lay a foundation for further studies of adaptor protein in pathogenic signal transduction pathways of G. cingulata.【Method】 Based on theGcAP1β deletion vector and GcAP1β-gfp fused expression vector, the Δgcap1β mutant and the GcAP1β complementation strain Δgcap1β-GcAP1β were structured using ATMT, respectively, verified by RT-PCR and Southern blot analysis. Colony growth rate, sporulation, germination rate, appressorial formation rate and pathogenicity of the Δgcap1β mutant and the GcAP1β complementation strain Δgcap1β-GcAP1β were assayed, compared with the wild-type strain W16. GcAP1β subcellular localization was carried out with the bioinformatics softwares ProtComp 9.0 and TMHMM, along with signal observation of GcAP1β-GFP. The GcAP1β expression levels in hyphae, conidia, appressoria and pathogenicity stage were identified by qRT-PCR. Moreover, the expression levels of CgPG1, CgPG2, pnl-1, pnl-2, pelA and pelB in the wild-type strain W16 and the Δgcap1β mutant were detected, respectively. 【Result】 GcAP1β is 2 321 bp in length, including 3 introns, which encodes a 720 amino acids. Compared with the wild-type strain W16, the Δgcap1β mutant showed a rill-like fold colony and decreased growth, while sporulation, germination rate and appressorial formation rate were unaffected. Virulence of the Δgcap1β mutant reduced significantly, which induced tiny spots on the leaves. Moreover, the GcAP1β complementation strain Δgcap1β-GcAP1β fully restored the phenotype flaws by reintroducing GcAP1β to the Δgcap1β mutant. Fluorescent signal showed that the fused protein GcAP1β-GFP was distributed to the cytoplasm. qRT-PCR analysis showed that GcAP1β expresses through the lifecycle of G. cingulata, and the highest expression level of GcAP1β occurred at the post-invasion to leaves. Compared with WT, the Δcgap1β mutant showed a drastic reduction of CgPG1 transcripts (20.3%), CgPG2 transcripts (16.5%), pnl-1 transcripts (8.2%), pnl-2 transcripts (14.4%), pelA transcripts (4.4%) and pelB transcripts (0.8%). 【Conclusion】 The adaptor protein GcAP1 complex is distributed to the cytoplasm and is necessary for growth and development of G. cingulata; GcAP1 regulates the expression of CgPG1, CgPG2, pnl-1, pnl-2, pelA and pelB and is a vital virulence factor of G. cingulata.

adaptor protein; pectinase; apple; Colletotrichum; virulence

2016-12-26；接受日期：2017-02-06

國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金（31501596）、中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費專項（1610182016002）、中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程

聯(lián)系方式：第一作者、共同通信作者張俊祥，E-mail：zhangjunxiang@caas.cn。通信作者周宗山，E-mail：zszhouqrj@163.com