接種量對(duì)產(chǎn)氣腸桿菌同步糖化暗發(fā)酵產(chǎn)氫的影響

張 甜， 張全國(guó)， 張志萍， 李亞猛， 路朝陽(yáng)， 劉會(huì)亮

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)業(yè)部可再生能源新材料與裝備重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 鄭州 450002)

接種量對(duì)產(chǎn)氣腸桿菌同步糖化暗發(fā)酵產(chǎn)氫的影響

張 甜， 張全國(guó)， 張志萍， 李亞猛， 路朝陽(yáng)， 劉會(huì)亮

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)業(yè)部可再生能源新材料與裝備重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 鄭州 450002)

文章以小麥秸稈為原料，研究了不同接種量對(duì)產(chǎn)氣腸桿菌同步糖化發(fā)酵產(chǎn)氫的影響，以期尋求最佳的接種量條件。試驗(yàn)以累積產(chǎn)氫量、產(chǎn)氫速率等指標(biāo)來(lái)分析產(chǎn)氣腸桿菌利用小麥秸稈進(jìn)行同步糖化發(fā)酵產(chǎn)氫的潛力及其可行性。結(jié)果表明：在以反應(yīng)液體積為200 mL，底物為5 g小麥秸稈，酶負(fù)荷為150 mg·g-1秸稈、初始pH值為6.5，溫度為35℃的條件下，接種量為30%時(shí)產(chǎn)氫效果最好，此時(shí)的累積產(chǎn)氣量達(dá)到737 mL,累積產(chǎn)氫量達(dá)到293 mL,最大產(chǎn)氫速率為35.42 mL·h-1L-1。該實(shí)驗(yàn)研究為秸稈類生物質(zhì)同步糖化厭氧暗發(fā)酵產(chǎn)氫的進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ)并提供了科學(xué)參考。

接種量； 產(chǎn)氣腸桿菌； 同步糖化； 生物制氫

能源短缺、環(huán)境污染是當(dāng)今社會(huì)面臨的兩大難題，因此，研究和開(kāi)發(fā)可再生的潔凈能源已變得迫在眉睫[1]。新能源的開(kāi)發(fā)和利用已經(jīng)成為人們矚目的焦點(diǎn)，在新能源開(kāi)發(fā)領(lǐng)域，生物質(zhì)能的開(kāi)發(fā)利用占了很大的比例，氫能因其燃燒熱值高、無(wú)污染，被認(rèn)為是21世紀(jì)的一種清潔能源，還被認(rèn)為是最理想的化石燃料的替代能源，因此，生物制氫備受廣泛關(guān)注，成為人們研究的熱點(diǎn)。

生物制氫的研究主要集中在厭氧暗發(fā)酵制氫和光合發(fā)酵制氫[2-3]。任南琪[4-6]等對(duì)暗發(fā)酵制氫進(jìn)行了研究，張全國(guó)[7-9]等對(duì)光合發(fā)酵制氫開(kāi)展了大量的研究，這些研究大多采用的是先水解后產(chǎn)氫的兩步發(fā)酵法[10-11]，利用生物質(zhì)進(jìn)行同步糖化制氫的報(bào)道不多[12]。同步糖化發(fā)酵工藝(Simultaneous Saccharification Fermentation Process )主要應(yīng)用于酒精和乳酸工業(yè)[13],應(yīng)用于生物制氫的很少。同步糖化發(fā)酵不僅可以減少反應(yīng)器的數(shù)量，節(jié)約時(shí)間，降低成本，更主要的是可以解除葡萄糖和纖維二糖對(duì)纖維素酶的反饋抑制作用。而且這些研究大多基于活性污泥富集菌群的研究，純菌種因其自身可利用的底物單一等原因，其相關(guān)研究相對(duì)較少。產(chǎn)氣腸桿菌作為產(chǎn)氫主要菌屬之一[14]，溫度適應(yīng)范圍廣(15℃～40℃)，能夠利用葡萄糖、半乳糖、甘露醇、蔗糖、淀粉、纖維素等進(jìn)行暗發(fā)酵制氫[15]。張曉蓉[16]等僅對(duì)產(chǎn)氣腸桿菌與光合細(xì)菌協(xié)同產(chǎn)氫特性進(jìn)行了初步研究，有關(guān)其工藝方面的具體研究相對(duì)較少。因此，本文選擇了厭氧暗發(fā)酵菌群中的優(yōu)勢(shì)菌種之一產(chǎn)氣腸桿菌(AS1.489)，在無(wú)菌操作臺(tái)和培養(yǎng)箱中對(duì)其進(jìn)行接種和純培養(yǎng)，然后采用同步糖化發(fā)酵工藝進(jìn)行產(chǎn)氫實(shí)驗(yàn)，研究了不同接種量對(duì)產(chǎn)氣腸桿菌利用小麥秸稈進(jìn)行厭氧暗發(fā)酵產(chǎn)氫的影響，以期尋求適合產(chǎn)氫的最佳接種量條件。該試驗(yàn)研究為秸稈類生物質(zhì)同步糖化發(fā)酵制氫的進(jìn)一步研究提供了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 原料

試驗(yàn)用產(chǎn)自鄭州科教園區(qū)試驗(yàn)田中的小麥秸稈，自然風(fēng)干后粉碎，經(jīng)40目分樣篩過(guò)篩后密封備用。

小麥秸稈的纖維素、半纖維素以及木質(zhì)素含量的測(cè)定采用改良的王玉萬(wàn)法測(cè)定。測(cè)定結(jié)果如表1所示。

表1 小麥秸稈組分含量 (%)

1.1.2 菌種

試驗(yàn)菌種為產(chǎn)氣腸桿菌(AS1.489)。兼性厭氧，革蘭陰性桿菌，無(wú)芽孢。購(gòu)于南京便診生物科技有限公司。

利用Logistic模型對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)情況進(jìn)行了回歸模擬，得到由細(xì)胞干重表示的細(xì)菌生長(zhǎng)曲線如圖1所示。

圖1 產(chǎn)氣腸桿菌生長(zhǎng)曲線圖

利用Logistic模型對(duì)產(chǎn)氣腸桿菌生長(zhǎng)情況進(jìn)行回歸模擬時(shí)，相關(guān)系數(shù)R2為0.9990，說(shuō)明擬合效果很好。故選擇培養(yǎng)48 h處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后期細(xì)菌活性和濃度都較大的產(chǎn)氣腸桿菌進(jìn)行產(chǎn)氫實(shí)驗(yàn)。

1.1.3 生長(zhǎng)培養(yǎng)基/產(chǎn)氫培養(yǎng)基

每1000 mL無(wú)菌水，加入15 g胰蛋白酶消化物，5 g大豆蛋白酶消化物，5 g NaCl。

1.1.4 纖維素酶

試驗(yàn)用纖維素酶購(gòu)于上海源葉生物科技有限公司，酶活性≥1800 u·mg-1。

1.1.5 檸檬酸—檸檬酸鈉緩沖液

pH值為4.8檸檬酸—檸檬酸鈉緩沖液：

溶液A：準(zhǔn)確稱取C6H8O7·H2O 21.014 g于500 mL燒杯中，用少量蒸餾水溶解后，定容至1000 mL，得到0.1 mol·L-1檸檬酸溶液。

溶液B：準(zhǔn)確稱取Na3C6H5O7·2H2O 29.412 g于500 mL燒杯中，用少量蒸餾水溶解后，定容至1000 mL，得到0.1 mol·L-1檸檬酸鈉溶液。

取A溶液230 mL，B溶液270 mL，充分混合后移入1000 mL容量瓶中，用蒸餾水定容至1000 mL，充分混勻，4℃冰箱中冷藏保存。

1.1.6 調(diào)節(jié)pH值用試劑

5 mol·L-1的KOH溶液和36%～38%的鹽酸。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 產(chǎn)氫試驗(yàn)

用電子天平分別準(zhǔn)確稱取5 g備用的小麥秸稈，置于洗凈烘干備用的錐形瓶中，由于本試驗(yàn)采用的是同步糖化發(fā)酵法產(chǎn)氫，因此，同時(shí)向錐形瓶中各加入0.75 g纖維素酶(酶負(fù)荷150 mg·g-1)，100 mL pH值4.8的緩沖液、按容積比分別加入產(chǎn)氫培養(yǎng)基、按試驗(yàn)設(shè)計(jì)好的接種量梯度分別加入10%，20%，30%，40%，50%，60%處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌種，然后調(diào)節(jié)反應(yīng)液的初始pH值為6.5。最后，將裝置置于35℃ 的恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行產(chǎn)氫試驗(yàn)。試驗(yàn)用排水法收集氣體。每個(gè)接種量梯度設(shè)置3個(gè)平行試驗(yàn)組，試驗(yàn)結(jié)果取3組試驗(yàn)的平均值。試驗(yàn)裝置如圖2所示：

1.氣體凈化器； 2.恒溫培養(yǎng)箱； 3.反應(yīng)器； 4.測(cè)樣口； 5.氬氣； 6.導(dǎo)氣管； 7.氣相色譜儀； 8.集氣瓶； 9.貯水瓶圖2 產(chǎn)氫實(shí)驗(yàn)裝置圖

1.2.2 pH值的測(cè)定

反應(yīng)料液的pH值采用上海世諾物理光學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)的PHB-1筆型酸度計(jì)測(cè)定，用蒸餾水沖洗pH計(jì)電極，然后用濾紙吸干電極上殘余的溶液(也可以用待測(cè)液沖洗電極)，再將電極浸入放有待測(cè)溶液的燒杯中，并輕輕晃動(dòng)電極桿，待示數(shù)穩(wěn)定后記下數(shù)據(jù)即可。

1.2.3 產(chǎn)氣量和氫氣含量的測(cè)定

實(shí)驗(yàn)用排水法收集氣體，然后用安捷倫公司生產(chǎn)的6820GC-14B型氣相色譜儀進(jìn)行氫氣含量的測(cè)定。色譜條件：進(jìn)樣口溫度100℃，柱溫80℃，TCD檢測(cè)器150℃，進(jìn)樣量500 μL,保留時(shí)間2 min。每天定時(shí)取一定量的氣體進(jìn)行測(cè)定，按測(cè)定值計(jì)算出氫氣的濃度。

用氣相色譜分析儀測(cè)定其峰面積,然后使用公式(1)計(jì)算出氫氣的百分含量。

Y=0.00087×S-0.76363

(1)

式中：S為所測(cè)的峰面積。

1.2.4 生物制氫過(guò)程的回歸分析

采用修正后的Gompertz方程對(duì)生物制氫過(guò)程中的產(chǎn)氫情況進(jìn)行分析，修正后的Gompertz 方程如式(2)所示。

(2)

式中：PH2(t)為累積產(chǎn)氫量，mL；Pmax為最大產(chǎn)氫潛能，mL；rm為最大產(chǎn)氫速率，mL·h-1；λ為產(chǎn)氫延遲期，h；t為產(chǎn)氫反應(yīng)進(jìn)行的時(shí)間，h；e為自然對(duì)數(shù)底數(shù)，e=2.72。

利用非線性回歸方程直接進(jìn)入非線性最小二乘擬合，采用試樣法使得參數(shù)平方和最小進(jìn)而進(jìn)行循環(huán)迭代估計(jì)參數(shù)Pmax，rm和λ，收斂標(biāo)準(zhǔn)為10-6。

2 結(jié)果與討論

單因素試驗(yàn)選取底物為5 g小麥秸稈，酶負(fù)荷為150 mg·g-1秸稈，初始pH值為6.5，反應(yīng)溫度為35℃。為了得到產(chǎn)氣腸桿菌發(fā)酵產(chǎn)氫的最適接種量條件，筆者選取接種量為10%，20%，30%，40%，50%，60%這6個(gè)梯度進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)氫試驗(yàn)，每個(gè)接種量梯度設(shè)置3個(gè)平行試驗(yàn)組，試驗(yàn)結(jié)果取3組試驗(yàn)的平均值。試驗(yàn)用累積產(chǎn)氫量和產(chǎn)氫速率作為評(píng)價(jià)產(chǎn)氣腸桿菌產(chǎn)氫潛力及其可行性的指標(biāo)。

2.1 不同接種量條件下反應(yīng)料液產(chǎn)氫過(guò)程中pH值的變化

厭氧暗發(fā)酵產(chǎn)氫的pH值一般在7.5～5.0之間，多為酸性條件，但是過(guò)低的pH值會(huì)使產(chǎn)氫細(xì)菌細(xì)胞失活，從而影響產(chǎn)氫效率。本試驗(yàn)調(diào)節(jié)反應(yīng)液的初始pH值為6.5。圖3為不同接種量條件下產(chǎn)氫過(guò)程中pH值的變化情況。

圖3 不同接種量條件下產(chǎn)氫過(guò)程中pH值的變化

由圖3可以看出：前12 h產(chǎn)氫料液的pH值均從初始的6.5迅速降至4.5～5.0之間。隨著產(chǎn)氫過(guò)程的進(jìn)行，接種量為10%的反應(yīng)液的pH值先上下浮動(dòng)，后有所下降；接種量為20%的反應(yīng)液的pH值上下浮動(dòng)，基本保持不變；接種量為30%，40%，50%，60%的反應(yīng)液的pH值均慢慢恢復(fù)上升到起初的6.5左右，且接種量越大，pH值恢復(fù)得越快也越接近于6.5。分析其原因可能是：隨著產(chǎn)氫過(guò)程的進(jìn)行，會(huì)有小分子酸的積累，當(dāng)酸的積累量大于酸的消耗量時(shí)，就會(huì)出現(xiàn)pH值下降的現(xiàn)象，接種量大的反應(yīng)液的pH值后來(lái)又慢慢恢復(fù)上升，可能是由于在底物量一定的條件下，過(guò)量的菌種消耗產(chǎn)氫過(guò)程中積累的小分子酸用于自身生長(zhǎng)代謝的量大于產(chǎn)氫過(guò)程中小分子酸的積累量，從而引起了pH值的恢復(fù)上升。由此得出：接種量小的產(chǎn)氫料液產(chǎn)氫過(guò)程中的pH值呈現(xiàn)出下降或上下波動(dòng)的變化趨勢(shì)，而接種量大的產(chǎn)氫料液產(chǎn)氫過(guò)程中的pH值呈現(xiàn)出先下降后緩慢恢復(fù)上升的趨勢(shì)。

2.2 接種量對(duì)產(chǎn)氣腸桿菌厭氧暗發(fā)酵產(chǎn)氫的影響

2.2.1 不同接種量條件下的累積產(chǎn)氫量

不同接種量條件下的累積產(chǎn)氫量如圖4所示。

圖4 不同接種量條件下的累積產(chǎn)氫量

利用修正的 Gompertz 方程對(duì)不同接種量條件下的產(chǎn)氫過(guò)程進(jìn)行擬合，相關(guān)系數(shù)R2均在 0.99 以上，表明擬合結(jié)果較好。由圖4試驗(yàn)結(jié)果可以看出，接種量為30%時(shí)，累積產(chǎn)氫量最大，累積產(chǎn)氫量達(dá)到293 mL，此接種量條件下，平均氫氣濃度達(dá)到40%左右，最大氫氣濃度達(dá)到46.9%；接種量為10%時(shí)，累積產(chǎn)氫量最小，20%，40%，50%，60%的累積產(chǎn)氫量均位于10%和30%之間，分別為215 mL，212 mL，172 mL，152 mL。由試驗(yàn)結(jié)果可知：接種量過(guò)大或過(guò)小都不利于產(chǎn)氫，因?yàn)榻臃N量過(guò)小，底物不能被充分用于發(fā)酵產(chǎn)氫，從而造成了底物轉(zhuǎn)化率低，產(chǎn)氫效率低；接種量過(guò)大，過(guò)量的菌種就會(huì)消耗產(chǎn)氫過(guò)程中積累的有機(jī)物用于自身的生長(zhǎng)代謝，從而影響產(chǎn)氫的效率，造成產(chǎn)氫量的下降。

2.2.2 不同接種量條件下的產(chǎn)氫速率

由圖5產(chǎn)氫速率曲線圖可以看出：產(chǎn)氫效果最好的接種量為30%時(shí)的最大產(chǎn)氫速率亦最大，此時(shí)最大產(chǎn)氫速率為35.42 mL·h-1L-1，接種量為10%時(shí)的最大產(chǎn)氫速率最小，20%，40%，50%，60%的最大產(chǎn)氫速率位于10%和30%之間。并且由圖5還可以看出：接種量越小，其最大產(chǎn)氫速率出現(xiàn)的時(shí)間越晚，即其產(chǎn)氫延緩時(shí)間越長(zhǎng)；接種量越大，其最大產(chǎn)氫速率出現(xiàn)的時(shí)間越早，即其產(chǎn)氫延緩時(shí)間越短，分析其可能是由于菌種前期需先適應(yīng)環(huán)境，并利用有機(jī)物進(jìn)行生長(zhǎng)繁殖的緣故。

圖5 不同接種量條件下的產(chǎn)氫速率

3 結(jié)論

(1)接種量過(guò)大或過(guò)小都不利于產(chǎn)氫。在反應(yīng)液體積為200 mL，底物為5 g小麥秸稈，酶負(fù)荷為150 mg·g-1秸稈，初始pH值為6.5，溫度為35℃ 的條件下，30%為最佳接種量。此時(shí)，累積產(chǎn)氫量和最大產(chǎn)氫速率均最大，累積產(chǎn)氣量達(dá)到737 mL,累積產(chǎn)氫量達(dá)到293 mL,平均氫氣濃度達(dá)到40%左右，最大氫氣濃度達(dá)到46.9%，最大產(chǎn)氫速率為35.42 mL·h-1L-1。

(2)產(chǎn)氫過(guò)程中，前12 h產(chǎn)氫料液的pH值均從初始的6.5迅速降至4.4～5.0之間，隨著產(chǎn)氫過(guò)程的進(jìn)行，接種量較小的反應(yīng)液的pH值上下浮動(dòng)基本保持不變或稍有所下降；接種量較大的反應(yīng)液的pH值均慢慢恢復(fù)上升到起初的6.5左右，且接種量越大，pH值恢復(fù)得越快也越接近于6.5。

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The Effects of Inoculum Size on Hydrogen Production byEnterobacterAerogeneswith Simultaneous Saccharification during Dark Fermentation /

ZHANG Tian, ZHANG Quan-guo , ZHANG Zhi-ping, LI Ya-meng, LU Chao-yang , LIU Hui-liang /

( Key Laboratory of New Materials and Facilities for Rural Renewable Energy of China's Ministry of Agriculture, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China)

Wheat straw was taken as raw material, the effect of different inoculum size on the hydrogen production byenterobacteraerogeneswith simultaneous saccharification in dark fermentation, were studied in this paper, aiming at seeking the best inoculum size. Parameters of cumulative hydrogen production and its production rate were taken as indicators for analyzing. The results showed that, under the condition of 200 mL of reaction liquid, 5 g of wheat straw substrate, 150 mg of enzyme per gram of substrate,initial pH value of 6.5, and temperature of 35℃, the best inoculum size was 30%, from which the cumulative hydrogen production was 293 mL, the maximum hydrogen production rate reached 35.42 mL·h-1L-1.

inoculum size;enterobacteraerogenes; simultaneous saccharification; bio-hydrogen production

2016-10-14

項(xiàng)目來(lái)源： 國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(51376056)； 國(guó)家自然科學(xué)基金(U1504509)

張 甜(1991- )，女，碩士，主要從事可再生能源工程方面的研究工作，E-mail:1287590177@qq.com

張全國(guó)，E-mail: zquanguo@163.com

S216.4; TQ920

A

1000-1166(2017)02-0024-04