畬藥“十二時(shí)辰”水煎劑的急性毒性實(shí)驗(yàn)研究

張繼州 周春權(quán) 李細(xì)彬 雷華杰 韓 靜 賀肇東 胡 娟1,3

1. 福建省中醫(yī)藥研究院，福建 福州 350003；2.福建省寧德市閩東畬族青草藥發(fā)展協(xié)會(huì)，福建 寧德 352100；3.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州 350122

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實(shí)驗(yàn)研究

畬藥“十二時(shí)辰”水煎劑的急性毒性實(shí)驗(yàn)研究

張繼州*周春權(quán)*李細(xì)彬2雷華杰2韓 靜*賀肇東*胡 娟1,3*

1. 福建省中醫(yī)藥研究院，福建 福州 350003；2.福建省寧德市閩東畬族青草藥發(fā)展協(xié)會(huì)，福建 寧德 352100；3.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州 350122

目的：研究畬藥“十二時(shí)辰”水煎劑對(duì)小鼠的急性毒性，以初步評(píng)價(jià)其安全性。方法：以不同劑量“十二時(shí)辰”水煎劑對(duì)小鼠灌胃，觀察毒性癥狀，記錄死亡情況，并計(jì)算最大耐受量(MTD)、最小致死量(MLD)及半數(shù)致死量(LD50)的值。結(jié)果：小鼠口服“十二時(shí)辰”水煎劑的最大耐受量(MTD)為27.44g/kg，最小致死量(MLD)為39.2g/kg，半數(shù)致死量(LD50)為60.08g/kg。結(jié)論：“十二時(shí)辰”臨床應(yīng)用時(shí)，需嚴(yán)格控制口服劑量。

十二時(shí)辰；急性毒性；最大耐受量；最小致死量；半數(shù)致死量

“十二時(shí)辰”為毛茛科植物重瓣鐵線蓮ClematisfloridaThunb. var．plenaD.Don的干燥根[1]，為福建福安畬醫(yī)習(xí)用藥?！陡０伯屷t(yī)畬藥》記載，其性溫、味辛，具有通經(jīng)活絡(luò)、通關(guān)竅、怯風(fēng)除濕、活血止痛、理氣通便、利尿、解毒等功效，主治跌打損傷，關(guān)節(jié)腫痛，蟲蛇咬傷[2]；《中華本草》記載其“味苦、微辛; 性溫，小毒，歸肝、脾、腎經(jīng)，可利尿、通絡(luò)、理氣通便、解毒”，主治風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、小便不利、閉經(jīng)、便秘腹脹、風(fēng)火牙痛、眼起星翳、蟲蛇咬傷、黃疸等[3]，是一味地方特色鮮明的民族藥，值得進(jìn)一步研究并加以開發(fā)應(yīng)用。關(guān)于十二時(shí)辰的化學(xué)成分，近年已有相關(guān)報(bào)道[4-5]，其主要活性成分包括棕櫚酸及其甲酯、乙酯以及齊墩果酸等。但迄今為止，對(duì)于“十二時(shí)辰”及其原植物重瓣鐵線蓮的安全性評(píng)價(jià)還未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。研究通過(guò)小鼠口服不同劑量“十二時(shí)辰”水煎劑，觀察毒性癥狀，記錄死亡情況，并計(jì)算最大耐受量(MTD)、最小致死量(MLD)及半數(shù)致死量(LD50)的值，為其臨床安全使用奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1 儀器與試藥 YP502N電子天平(上海精密科學(xué)有限公司)、WK2102電磁爐(美的)，“十二時(shí)辰”生藥(批號(hào)：20160501)購(gòu)買自福建福安。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)昆明種小鼠，雌雄各半，體重20～22g，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(合格證號(hào)：SCXK(滬)2012-0002)，光暗周期12/12 h(光照時(shí)間8∶00～20∶00)下飼養(yǎng)，自由飲食，室溫保持 18～22℃，相對(duì)濕度 40%～70% ，實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性喂養(yǎng)3d。

2 方法

2.1 水煎劑制備 用電子天平稱取“十二時(shí)辰”藥材400g，加水12倍體積煎煮1h，再先后加水10倍體積和8倍體積各煎煮0.5h，合并三次煎煮液，濃縮至200mL，即得2g/mL濃縮液備用，用時(shí)再用蒸餾水配成相應(yīng)濃度。2.2 最大耐受量和最小致死量的測(cè)定 預(yù)試驗(yàn)中，80g/kg劑量的“十二時(shí)辰”水煎劑灌胃造成小鼠全部死亡，而8g/kg及0.8g/kg兩劑量無(wú)死亡。因此正式試驗(yàn)中，在80g/kg和8g/kg劑量之間，以0.70等比組距，設(shè)置5個(gè)劑量組，其劑量分別為56g/kg、39.2g/kg 、27.44g/kg、19.2g/kg、13.44g/kg。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為5個(gè)實(shí)驗(yàn)組及1個(gè)空白對(duì)照組，每組10只，雌雄各半，實(shí)驗(yàn)前禁食不禁水16h。各實(shí)驗(yàn)組按0.4mL/10g體重灌胃給予上述劑量“十二時(shí)辰”水煎劑，空白對(duì)照組給予等體積的蒸餾水，觀察其毒性癥狀，記錄死亡情況，確定小鼠口服“十二時(shí)辰”水煎劑的最大耐受量(MTD)和最小致死量(MLD)。

2.3 LD50的測(cè)定 參考2.2結(jié)果，經(jīng)預(yù)試驗(yàn)，得出小鼠口服“十二時(shí)辰”水煎劑的100%致死量(Dm)為64 g/kg，0%致死量(Dn)為32.8g/kg，兩者之比接近2倍。故根據(jù)改良寇氏法(K?rber氏法)[6]，參考Dm和Dn，以0.85等比組距，設(shè)置6個(gè)劑量組，其劑量分別為75.3g/kg、64g/kg、54.4g/kg、46.2g/kg、39.3g/kg、33.4g/kg。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為6個(gè)實(shí)驗(yàn)組及1個(gè)空白對(duì)照組，每組10只，雌雄各半，實(shí)驗(yàn)前禁食不禁水16小時(shí)。各實(shí)驗(yàn)組按0.4mL/10g體重灌胃給予上述劑量“十二時(shí)辰”水煎劑，空白對(duì)照組給予等體積的蒸餾水，觀察其毒性癥狀，記錄死亡情況，并計(jì)算小鼠口服“十二時(shí)辰”水煎劑的半數(shù)致死量(LD50)。

2.4 統(tǒng)計(jì)描述及LD50計(jì)算方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以各實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物死亡率表示，LD50采用改良寇氏法計(jì)算，計(jì)算公式如下：

LD50=log-1{Xm-i[∑p-(3-pm-pn)/4]}

其中：Xm為最大劑量組劑量的對(duì)數(shù)；i為相鄰兩組高劑量與低劑量之比的對(duì)數(shù)；p為各組動(dòng)物的死亡率；∑p為各組p值之和；pm為最高劑量組死亡率；pn為最低劑量組死亡率。

LD50的95%可信區(qū)間計(jì)算公式如下：

其中：i為相鄰兩組高劑量與低劑量之比的對(duì)數(shù)；p為各組動(dòng)物的死亡率；n為每組的動(dòng)物數(shù)量。

3 結(jié)果

3.1 一般情況觀察 空白對(duì)照組小鼠精神良好，活動(dòng)正常，無(wú)死亡?！笆r(shí)辰”水煎劑組隨劑量升高，有靜伏不動(dòng)、活動(dòng)減少，死亡前抽搐等毒性現(xiàn)象。

3.2 最大耐受量和最小致死量的測(cè)定 由表1可知，小鼠口服“十二時(shí)辰”水煎劑的最大耐受量(MTD)為27.44g/kg，最小致死量(MLD)為39.2g/kg。

表1 小鼠口服不同劑量“十二時(shí)辰”水煎劑的死亡情況

3.3 “十二時(shí)辰”水煎劑的LD50的測(cè)定 各組死亡情況見(jiàn)表2.根據(jù)改良寇氏法，將表2數(shù)據(jù)代入計(jì)算公式得：LD50=60.08g/kg；LD50的95%可信區(qū)間為54.42～65.73g/kg。

表2 小鼠口服不同劑量“十二時(shí)辰”水煎劑的死亡情況

4 討論

急性毒性試驗(yàn)是藥物安全性評(píng)價(jià)的第一步，為后續(xù)的長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)、特殊毒性試驗(yàn)及藥效學(xué)、藥理學(xué)研究中劑量選擇和指標(biāo)設(shè)計(jì)提供重要的參考依據(jù)，同時(shí)也為臨床安全應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

半數(shù)致死量LD50是藥物的重要特征性參數(shù),準(zhǔn)確測(cè)定LD50是合理用藥、安全用藥的重要前提[6]。本次試驗(yàn)滿足三個(gè)條件：①反應(yīng)量大致呈正態(tài)分布；②給藥濃度按照等比級(jí)數(shù)排列；③各組動(dòng)物數(shù)相等，故采用改良寇氏法(K?rber氏法)作為L(zhǎng)D50的計(jì)算方法。然而單純依靠LD50作為急性毒性指標(biāo)具有一定的缺陷，例如，無(wú)法反映不引發(fā)動(dòng)物死亡的劑量與引發(fā)動(dòng)物死亡的劑量之間的范圍。因此，配合最大耐受量(MTD)及最小致死量(MLD)等相關(guān)數(shù)據(jù)，可以反映藥物毒作用帶的寬度，更全面地表示藥物的毒性。研究中，小鼠口服“十二時(shí)辰”水煎劑的最大耐受量(MTD)為27.44g/kg，最小致死量(MLD)為39.2g/kg，半數(shù)致死量(LD50)為60.08g/kg，其95%可信區(qū)間為54.42～65.73g/kg。按照藥理實(shí)驗(yàn)中動(dòng)物間和動(dòng)物與人體間的等效劑量換算，半數(shù)致死量(LD50)的值相當(dāng)于60kg體重成人服用292.0g生藥[7]，根據(jù)化學(xué)物質(zhì)的急性毒性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，該藥材屬低毒藥材。LD50約為MLD的兩倍，說(shuō)明口服“十二時(shí)辰”水煎劑后，自出現(xiàn)小鼠死亡的最低劑量至半數(shù)小鼠死亡的劑量存在一定距離，毒劑量帶有一定的寬度。此外，小鼠口服“十二時(shí)辰”后的毒性現(xiàn)象可知，在致死劑量下其毒作用較為明顯，但具體的機(jī)制以及靶器官尚需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究加以確認(rèn)，并與同為鐵線蓮屬的其他藥用植物加以對(duì)比。

[1]黃澤豪，張?jiān)铝? 畬藥十二時(shí)辰的本草考證[J]. 中國(guó)民族民間醫(yī)藥，2014,23(1):2-3.

[2]鐘隱芳．福安畬醫(yī)畬藥[M]．福州:海風(fēng)出版社，2010:109-110．

[3]《中華本草》編委會(huì). 中華本草(第三輯) [M]. 上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1999:198．

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[6]周立國(guó). 藥物毒理學(xué)[M]. 北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2009：141-142，131-132.

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福建省屬公益類科研院所基本科研專項(xiàng)(2015R1035-6)；福建省科技廳對(duì)外合作項(xiàng)目(2017I0006)；2016年度福建省“省級(jí)重點(diǎn)扶貧縣及革命老區(qū)蘇區(qū)引智專項(xiàng)計(jì)劃”資助(2016021)。

張繼州(1989-)，男，漢族，碩士，實(shí)習(xí)研究員，研究方向?yàn)橹兴幩幚怼-mail:812939996@qq.com

胡娟(1962-)，女，土家族，碩士，教授，研究方向?yàn)橹兴幩幮镔|(zhì)基礎(chǔ)。E-mail：huj@fjtcm.edu.cn

R285.5

A

1007-8517(2017)08-0027-03

2017-02-17： 編輯：梁志慶)