膀胱尿路上皮癌組織Livin和BCL-2的表達及其相關(guān)性研究

楊立軍 鄭文武 周安傳 蘇曉哲 吳亞東 李珅

·論著·

膀胱尿路上皮癌組織Livin和BCL-2的表達及其相關(guān)性研究

楊立軍 鄭文武 周安傳 蘇曉哲 吳亞東 李珅

目的 探討Livin與BCL-2在膀胱尿路上皮癌及癌旁組織中的蛋白表達水平及二者在膀胱尿路上皮癌中的相關(guān)關(guān)系，分析其致癌機制，為膀胱尿路上皮癌的診斷及臨床治療提供理論依據(jù)。方法 用流式細胞分析技術(shù)檢測90例膀胱尿路上皮癌及對應(yīng)的90例癌旁組織，及20例正常膀胱粘膜移行上皮組織中的Livin、BCL-2蛋白的表達。90例膀胱尿路上皮癌中,男66例,女24例,年齡26～68(平均50.24±9.87)歲。按照WHO病理分級：G124例，G240例，G326例;TNM臨床分期診斷標(biāo)準(zhǔn)：非浸潤性癌(Ta-1期)38例，浸潤性癌(T2-4期)52例;單發(fā)48例，多發(fā)42例；初發(fā)54例，復(fù)發(fā)36例；20例正常對照為前列腺增生癥、膀胱結(jié)石患者經(jīng)膀胱手術(shù)所取膀胱黏膜組織，均經(jīng)病理檢查證實為正常膀胱黏膜組織。將表達結(jié)果進行分析。結(jié)果 Livin在正常膀胱組織中不表達。于癌旁組織中亦無表達。Livin在膀胱尿路上皮癌組織中陽性率為71.11%，其中陽性64例，陰性26例。Livin的蛋白表達與細胞的凋亡率呈負相關(guān)。BCL-2陽性表達結(jié)果 膀胱癌癌組織(51.11%)與癌旁組織(73.33)BCL-2的表達差異有顯著性 (P<0.05)。90例膀胱尿路上皮癌中46例BCL-2蛋白表達陽性，陽性率為51.11%，與正常膀胱粘膜陽性表達率10%比較，陽性率明顯上升(P<0.05)。Bcl-2的蛋白表達與細胞的凋亡率呈負相關(guān)。在膀胱尿路上皮癌中Livin與BCL-2表達有密切關(guān)系 ,在膀胱癌BCL-2的表達隨著膀胱腫瘤的分化程度越差陽性表達就增加 ,而Livin蛋白的表達亦明顯增加 ,呈現(xiàn)正相關(guān) (P<0.05)。結(jié)論 細胞凋亡抑制因子Livin在膀胱尿路上皮癌組織中表達上調(diào)，并且與凋亡率呈負相關(guān)，提示Livin可能通過抑制細胞凋亡，對膀胱尿路上皮癌的發(fā)生、發(fā)展起重要作用，有望成為一種有效、敏感的腫腫瘤標(biāo)志物志物，并為膀胱尿路上皮癌的基因治療提供新的靶點。Livin與BCL-2在膀胱尿路上皮癌細胞凋亡的調(diào)控方面可能起著協(xié)同作用。

Livin：BCL-2:膀胱尿路上皮癌：癌旁：蛋白表達：流式細胞分析技術(shù)

膀胱癌正式名稱為膀胱尿路上皮細胞癌(TCC)，是泌尿生殖 系腫瘤中最常見的腫瘤，近年發(fā)病有增加趨勢。男性發(fā)病率約為女性的3～4倍，發(fā)病年齡以51～70歲為多，臨床最常見的首發(fā)癥狀是血尿，而且表現(xiàn)為間隙性、無痛性血尿為主。目前研究表明，腫瘤發(fā)生是細胞增殖因子與細胞凋亡因子失衡所致，受多種因素控制。凋亡抑制蛋白(IAP)是一類內(nèi)源性抑制因子，其高表達引起凋亡不足，與腫瘤發(fā)生關(guān)系密切。Livin是一種新近發(fā)現(xiàn)的IAP成員,其作用機制主要通過直接抑制procaspase或caspase來抑制細胞凋亡。BCL-2通過對線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、死亡受體通路的調(diào)控，來抑制細胞凋亡。本文用流式細胞分析技術(shù)研究Livin與BCL-2在膀胱尿路上皮癌、癌旁組織中的蛋白表達水平及二者在膀胱尿路上皮癌中的相關(guān)關(guān)系，為膀胱尿路上皮癌的診斷及臨床治療提供理論方向。

1 資料與方法

1.1 一般資料 標(biāo)本取自2012至2013年我院泌尿外科手術(shù)治療的住院患者，檢測90例膀胱尿路上皮癌及對應(yīng)的90例癌旁組織，20例正常膀胱粘膜組織中的Livin、Bcl-2蛋白的表達水平。90例膀胱尿路上皮癌患者中，術(shù)后均經(jīng)病理證實為膀胱尿路上皮癌，其中男66例,女24例；年齡26～68歲，平均(50.24±9.87)歲。按照WHO病理分級：G124例，G240例，G326例;TNM臨床分期診斷標(biāo)準(zhǔn)：非浸潤性癌(Ta-1期)38例，浸潤性癌(T2-4期)52例;單發(fā)48例，多發(fā)42例；初發(fā)58例，復(fù)發(fā)32例；20例正常對照為經(jīng)膀胱手術(shù)所取的前列腺增生癥、膀胱結(jié)石的膀胱黏膜組織，均經(jīng)病理證實為正常膀胱黏膜組織。標(biāo)本經(jīng)4%多聚甲醛固定。

1.2 試劑與儀器

1.2.1 試劑：鼠抗人Livin單克隆抗體(工作濃度1∶700)，美國NEOMARKERS公司；兔抗人Bcl-2多克隆抗體，SantaCruz公司；hanks(緩沖液)，百浩生物科技有限公司；AlexaFiuor488(異硫氰酸熒光素)，Proteintech公司；胃蛋白酶工作液，上海易欣生物科技有限公司。

1.2.2 儀器:BDFACSEALIBUR流式細胞儀BDBioscience公司(U.S.A)。

1.3 試驗方法 應(yīng)用流式細胞分析技術(shù)檢測。

1.4 試驗步驟 在檢測蛋白免疫熒光標(biāo)記物時，設(shè)hanks(緩沖液)為陰性對照，二抗AlexaFiuor488(異硫氰酸熒光素)為陽性對照。具體操作步驟如下：

1.4.1 標(biāo)本蠟塊的處理：在切片機上將蠟塊包埋的組織切取3～5片40～50μm厚的組織片。

1.4.2 脫蠟：將切取的組織片用二甲苯5～8ml(室溫)浸泡2～3d，脫凈石蠟。

1.4.3 水化：依次用100%、95%、70%、50%濃度的乙醇6～8ml對組織進行水化，每次水化10～15min，棄掉乙醇后加入0.9%氯化鈉溶液5～8ml浸泡30min后棄掉0.9%氯化鈉溶液。

1.4.4 消化：經(jīng)水化的組織加入0.5%胃蛋白酶(pH值1.5～2)2ml，置37℃恒溫水浴中，每10分鐘振蕩1次。至30min，立即加入0.9%氯化鈉溶液終止消化。

1.4.5 過濾：將消化好的組織放在120目不銹鋼網(wǎng)上，下置一平皿，將組織剪碎并輕輕搓組織，邊搓邊用生理鹽水沖洗，直至將組織搓完。將平皿中的混懸液用300目銅網(wǎng)過濾去掉細胞團塊。

1.4.6 離心：將收集的細胞懸液依次離心沉淀1 500r/min、1 000r/min，4min，均去掉多余懸清液，以0.9%氯化鈉溶液漂洗1次，再離心沉淀800r/min，4min，去掉多余懸清液，剩約0.5ml。

1.4.7 標(biāo)抗：將Livin和Bcl-2一抗均按1∶50進行稀釋。離心后的組織分二等份，分別加入Livin和Bcl-2抗體工作液0.1ml，靜置1h，加入hanks(0.01mol/L)5～8ml，離心沉淀800r/min，4min，棄懸清液，每個試管內(nèi)再加入二抗(AlexaFiuor488)100μl，2h后，加入hanks5～8ml，離心同上，除去未結(jié)合的熒光二抗，上機檢測。

1.5 結(jié)果評定標(biāo)準(zhǔn)Livin和Bcl-2蛋白表達含量以細胞的平均熒光強度表示，為了使免疫熒光定量分析更加完備，將平均熒光強度換算成熒光指數(shù)(FI)，用FI來表示Livin和Bcl-2在組織中的相對表達含量，按照組織細胞表達熒光指數(shù)大小對其進行統(tǒng)計分類，F(xiàn)I≤1判定表達量為陰性，F(xiàn)I>1判定為陽性。應(yīng)用流式細胞儀檢測Livin,Bcl-2陽性和陰性表達細胞的凋亡率。

2 結(jié)果

2.1 Livin蛋白在膀胱組織中的表達特征 Livin在正常膀胱組織及癌旁組織中不表達。Livin在膀胱尿路上皮癌組織中陽性表達率為71.11%。Livin在膀胱尿路上皮癌組織中表達上調(diào)。見表1。

表1 Livin蛋白在膀胱組織中的表達 例

注: 與TCC比較，*P<0.05

2.2Bcl-2蛋白在膀胱組織中的表達特征Bcl-2在癌旁組織與膀胱癌組織的陽性表達率分別為73.33%和51.11%，膀胱癌組織與癌旁組織Bcl-2的表達差異顯著 (P<0.05)。45例膀胱尿路上皮癌中Bcl-2蛋白陽性率為51.11%(46/90)，與正常膀胱黏膜陽性表達率10%相比較，陽性率明顯上升(P<0.05)。癌旁組織Bcl-2的陽性表達率與正常膀胱黏膜陽性表達率差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (P<0.05)。見表2。

表2 Bcl-2蛋白在膀胱組織中的表達 例

注: 與正常膀胱比較，*P<0.05；與TCC比較，#P<0.05

2.3Livin蛋白與Bcl-2蛋白表達與凋亡率的關(guān)系 膀胱尿路上皮癌組織中Livin蛋白表達陽性的凋亡率明顯低于陰性表達。同樣，Bcl-2蛋白表達陽性的凋亡率明顯低于陰性表達。均呈負相關(guān)。見表3、4。

組別凋亡率t值P值陽性(n=64)4.23±0.6816.8030.000陰性(n=26)8.79±1.10

組別凋亡率t值P值陽性(n=46)4.29±0.6716.3410.000陰性(n=44)8.85±1.15

2.4 膀胱尿路上皮癌組織中Livin蛋白與Bcl-2蛋白表達的相關(guān)性Bcl-2在膀胱尿路上皮癌組織中陽性表達中的Livin陽性表達率為91.30%，Bcl-2在膀胱尿路上皮癌組織中陰性表達中的Livin陽性表達率為50.00%，兩者表達呈正相關(guān)(P<0.01)。見表5。

表5 膀胱尿路上皮癌組織中Livin蛋白與 Bcl-2蛋白表達的相關(guān)性 例(%)

3 討論

Livin(又稱KIAP.MLIAP)是新發(fā)現(xiàn)的一個IAP家族成員，Ashhab等[1]明確了Livin基因位于人染色體20q13.3,全長4.6kb,包含7個外顯子?；蜣D(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA長1.4kb。Livin蛋白N端僅包含一個BIR結(jié)構(gòu),C端含一個RING環(huán)指結(jié)構(gòu)。編碼的Livin蛋白Livinα和Livinβ分別由298和280個氨基酸組成，Livin氨基酸殘基C124,C127,H44及C151與鋅原子結(jié)合，以穩(wěn)定整個重疊結(jié)構(gòu)。Livinα和Livinβ蛋白分子量分別為39 000和37 000。Kasof等[2]認為Livin同時成絲狀表達于胞質(zhì)和胞核。其抗細胞凋亡機制為:(1)抑制Caspase途徑:Livin可與介導(dǎo)細胞凋亡的下游效應(yīng)Caspase,即激活形式的Caspase-3和Caspase-7結(jié)合,并抑制其活性。Livin還可與未加工的或斷裂形式的Caspase-9結(jié)合,可抑制由Apaf-1(apoptosisprotein-activatingfactor-1),細胞色素C及dATP誘導(dǎo)的Caspase-9激活作用。Livin與Caspase的結(jié)合抑制作用具有高度的特異性和親和性,這有賴于其BIR結(jié)構(gòu)域的完整,BIR結(jié)構(gòu)域內(nèi)單個氨基酸的突變即可導(dǎo)致Livin與Caspase的結(jié)合作用及Livin抗細胞凋亡作用的明顯降低甚至完全喪失。抑制Caspase途徑:Livin可與介導(dǎo)細胞凋亡的下游效應(yīng)Caspase,即激活形式的Caspase3和Caspase7結(jié)合,抑制其活性，從而阻斷各種刺激因素誘導(dǎo)的細胞凋亡過程。(2)激活TAK1/JNK1信號傳導(dǎo)途徑:Livin可激活MAP(mitogenactivatedprotein)激酶JNK1和JNK2,從而抑制細胞凋亡。TAK1是一上游MAP3激酶,在TGFβ1的刺激下可激活JNK1。TAB1是TAK1的共反應(yīng)子(coactivator),TAB1本身對于JNK1無激活作用,但可促進TAK1介導(dǎo)的JNK1激活作用。而抑制細胞凋亡。鑒于Livin具有明顯的抗凋亡作用,人們開始日益關(guān)注其與腫瘤發(fā)生及發(fā)展的關(guān)系。

本研究顯示Livin在膀胱尿路上皮癌中陽性表達率為71.11%,而在正常膀胱黏膜組織及癌旁組織中無表達。細胞凋亡抑制因子Livin在膀胱尿路上皮癌組織中表達增加，提示Livin可能通過抑制細胞凋亡，對膀胱尿路上皮癌的發(fā)生、發(fā)展起重要作用，Livin在膀胱癌中的高表達有望成為一種有效、敏感的瘤標(biāo)，并為膀胱尿路上皮癌的基因治療提供新的方向。本研究結(jié)果也說明Livin表達陽性的凋亡率明顯低于陰性表達，即Livin表達與凋亡率呈負相關(guān)，表明Livin參與膀胱尿路上皮癌的凋亡調(diào)控。Gazzaniga等[3]結(jié)果顯示Livinα和Livinβ在正常膀胱組織中均無表達,Livinβ在膀胱癌組織中也無表達,而Livinα表達陽性率為23%。進一步分析顯示Livinα表達陽性的患者術(shù)后腫瘤平均復(fù)發(fā)時間為3.5個月,而Livinα表達陰性的患者則延長至27.2個月,差異明顯(P<0.01),提示Livinα表達與膀胱癌患者治療預(yù)后關(guān)系密切。有文獻報道以Livin基因為靶點的RNAi技術(shù)可以有效的特異性阻斷內(nèi)源性Livin基因的表達，使得caspase-3活化，明顯增強各種促凋亡因素(如阿霉素、紫外線照射、TNF-α)導(dǎo)致的細胞凋亡率[4]。用Livin基因的反義核酸和Smac肽反向調(diào)節(jié)Livin基因的抗凋亡活性也收到明顯的效果，包括增加化療藥物的促凋亡作用[5]。

Bcl-2是凋亡研究中熱點癌基因之一。Bcl-2蛋白是抗凋亡蛋白，位于線粒體內(nèi)膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和核膜，分子量為26 000。研究表明Bcl-2與惡性腫瘤的惡性程度的強弱明顯相關(guān)[6]。其中抑制凋亡的Bcl-2 與促進凋亡的Bax互相拮抗。Bcl-2 蛋白是一個良好的預(yù)后指標(biāo)[7]。其抑制細胞凋亡的主要機制為:阻止細胞色素C從線粒體釋放，抑制caspase蛋白酶的活化[8]; 抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)Ca2+進入細胞，線粒體基質(zhì)中高濃度的Ca2+促進反向轉(zhuǎn)運載體(anfiporter)-ANT與親環(huán)素D(CypD)結(jié)合，抑制PT孔的開放[9]。Bax蛋白存在于細胞內(nèi)膜、細胞質(zhì)和細胞核上，含有BH1-BH3 三個Bcl-2 家族特征性結(jié)構(gòu)域及疏水C末端的跨膜結(jié)構(gòu)域。其生物學(xué)作用主要是形成Bax同源二聚體時拮抗Bcl-2 促進細胞凋亡。實驗研究表明，Bax和Bcl-2 形成同源或異源二聚體后根據(jù)Bcl-2/Bax的比例調(diào)控細胞的凋亡，Bax蛋白高表達時加速細胞凋亡，Bcl-2 蛋白高表達時抑制細胞凋亡[10]。本試驗Bcl-2在正常膀胱粘膜中低表達,在膀胱尿路上皮癌及癌旁細胞中高表達。本研究結(jié)果也顯示Bcl-2表達陽性的凋亡率明顯低于陰性表達，即Bcl-2表達與凋亡率呈負相關(guān)，表明Bcl-2參與膀胱尿路上皮癌的凋亡機制。本實驗研究了Livin與Bcl-2的表達的相關(guān)性，在膀移行細胞癌中Livin與Bcl-2表達有密切關(guān)系,在膀胱癌Bcl-2的表達隨著膀胱腫瘤的分化程度越差陽性表達就增加,而Livin蛋白的表達亦明顯增加,呈現(xiàn)正相關(guān)(P<0.05)。已有的相關(guān)檢驗表明Livin與Bcl-2表達密切相關(guān)(P<0.05)，Livin與Bcl-2在膀胱尿路上皮癌細胞凋亡的凋控方面起著協(xié)同作用。推測其機制可能是共同抑制Caspase途徑從而抑制細胞的凋亡，促進腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。但相關(guān)課題研究較少，尚需進一步探究。

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2016-12-09)