外源水楊酸誘導(dǎo)對(duì)番茄幼苗抗冷性的影響

張帆++李景富++姜景彬++張賀++陳秀玲++許向陽

摘要：水楊酸是植物體內(nèi)的內(nèi)源激素之一，它的調(diào)節(jié)作用對(duì)于抵御植物生長(zhǎng)發(fā)育過程中遇到的非生物脅迫起重要作用。在低溫條件下，對(duì)植物體噴施適宜濃度的外源水楊酸，能有效減輕低溫對(duì)植物的傷害，使植物在低溫環(huán)境中也能繼續(xù)生長(zhǎng)。為了研究不同濃度的水楊酸對(duì)番茄幼苗抗寒性的影響，測(cè)定相關(guān)生理指標(biāo)和相關(guān)基因表達(dá)量變化，為今后番茄的合理化生產(chǎn)提供理論依據(jù)，用不同濃度的外源水楊酸噴灑在葉片上以誘導(dǎo)番茄4葉1心期幼苗，對(duì)水楊酸誘導(dǎo)后的番茄幼苗進(jìn)行低溫處理。結(jié)果表明，水楊酸能有效提高番茄幼苗的抗低溫能力，使其葉綠素、脯氨酸含量、SOD、POD、CAT活性升高，相對(duì)電導(dǎo)率、可溶性蛋白含量、MDA含量降低；對(duì)低溫敏感的CBF1、ICE1、COR15a基因表達(dá)量增加。其中，以350 mg/L濃度的SA處理6 d效果最佳。

關(guān)鍵詞：水楊酸；番茄；抗冷性；實(shí)時(shí)熒光定量

中圖分類號(hào)： S641.201文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2017）03-0091-04

收稿日期：2015-12-23

基金項(xiàng)目：現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專項(xiàng)資金（編號(hào)：CARS-25-A-15）；國家自然科學(xué)基金（編號(hào)：31272171）；黑龍江省杰出青年科學(xué)基金（編號(hào)：JC201204）。

作者簡(jiǎn)介：張帆（1990—），女，黑龍江佳木斯人，碩士研究生，研究方向?yàn)槭卟擞N。E-mail：424076961@qq.com。

通信作者：許向陽，研究員，博士生導(dǎo)師，主要從事番茄育種研究。E-mail：xxy709@126.com。

植物的抗逆化學(xué)誘導(dǎo)是指利用外源物質(zhì)模擬逆境信號(hào)或作為植物逆境信號(hào)傳導(dǎo)的中間信號(hào)物質(zhì)，誘發(fā)植物啟動(dòng)抗性機(jī)制，形成致敏[1]。通過大量的試驗(yàn)人們發(fā)現(xiàn)，水楊酸（SA）在植物體內(nèi)對(duì)生長(zhǎng)、發(fā)育、成熟、衰老等生理過程有一定的調(diào)控作用，在植物抗鹽、抗旱、抗低溫、抗紫外線、抗重金屬等抗逆反應(yīng)的誘導(dǎo)過程中得到廣泛的應(yīng)用[2]。因此，水楊酸被認(rèn)為是植物對(duì)逆境反應(yīng)的信號(hào)傳導(dǎo)分子，能夠誘導(dǎo)病程相關(guān)蛋白的基因表達(dá)，引發(fā)及產(chǎn)生系統(tǒng)獲得性抗性[3]。

康國章等在水楊酸對(duì)低溫脅迫香蕉幼苗呼吸作用的影響中指出SA對(duì)香蕉的抗環(huán)境脅迫能力有顯著的增強(qiáng)[4]。孫艷等在水楊酸對(duì)黃瓜幼苗壯苗的形成及抗低溫脅迫研究中發(fā)現(xiàn)外源SA可顯著提高系統(tǒng)的穩(wěn)定性，提高黃瓜幼苗的抗冷脅迫能力[5]。這都表明SA與植物逆境條件下對(duì)低溫的抵抗能力密切相關(guān)。在水楊酸對(duì)番茄在低溫條件下的影響中，于錫宏等噴施一定濃度的外源SA，降低了番茄植株體內(nèi)的相對(duì)電導(dǎo)率和丙二醛含量，延緩了葉綠素的降解，增加了脯氨酸的積累，進(jìn)而有效地降低了冷害指數(shù)，提高番茄幼苗的抗冷性[6]。劉思宇發(fā)現(xiàn)外源物質(zhì)SA能降低番茄的相對(duì)電導(dǎo)率，緩解低溫脅迫后葉綠素含量下降的情況，保持相對(duì)較高的POD活性，削弱MDA積累，保持細(xì)胞膜的完整性；外源物質(zhì)使番茄幼苗滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)（脯氨酸）含量極顯著高于對(duì)照，提高了幼苗的抗冷性[7]。阮舒潔等發(fā)現(xiàn)不同濃度的水楊酸噴施番茄幼苗，均可使番茄幼苗葉片中的相對(duì)電導(dǎo)率和丙二醛含量降低，POD活性提高，脯氨酸含量升高，冷害指數(shù)降低[8]。李艷軍發(fā)現(xiàn)外源SA誘導(dǎo)能明顯提高番茄幼苗的抗冷性，經(jīng)SA誘導(dǎo)的番茄幼苗葉片的相對(duì)電導(dǎo)率顯著降低，POD活性、葉綠素和可溶性蛋白含量顯著提高[9]。

在處于逆境脅迫條件下時(shí)，植物體內(nèi)的水楊酸含量高于正常環(huán)境中生長(zhǎng)時(shí)的含量，外源水楊酸通過誘導(dǎo)增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)各保護(hù)酶活性，提高植物體內(nèi)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量，從而使植物在逆境條件下也能繼續(xù)生長(zhǎng)。水楊酸在植物逆境生理過程中的作用具有雙重性，適宜濃度的水楊酸可以提高植物對(duì)逆境的抵抗能力，改善植物在水分脅迫下的不良生長(zhǎng)；濃度較低時(shí)，幾乎不顯示任何作用，但是高濃度的水楊酸卻會(huì)誘導(dǎo)活性氧自由基水平的上升，使植物遭受更為嚴(yán)重的脅迫傷害[10-12]。因此，適宜濃度的外源SA處理，提高保護(hù)酶活性，降低膜質(zhì)過氧化傷害，提高葉片光合及呼吸性能，提高體內(nèi)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量，能有效減輕低溫對(duì)植物的傷害。

植物的耐寒性是指植物對(duì)低溫環(huán)境的適應(yīng)及通過自身遺傳改變而獲得的抗寒能力，具有相對(duì)的遺傳穩(wěn)定性，在經(jīng)過低溫馴化（前期低溫鍛煉而形成的明顯的低溫適應(yīng)能力）后，可以明顯提高植物的耐寒性[13-14]?？购允芏嗷蚩刂?，且是一種誘發(fā)基因，只有在特定的條件下多個(gè)基因共同表達(dá)才能提高植物的抗寒能力[15]。根據(jù)抗寒基因產(chǎn)物的功能可簡(jiǎn)單地將其歸為兩大類：功能基因和調(diào)控基因[15]。功能基因是提高植物抗寒性直接相關(guān)的基因，如冷誘導(dǎo)基因、脂肪酸去飽和酶基因和抗氧化酶基因等對(duì)細(xì)胞膜起保護(hù)作用的基因；而調(diào)控基因主要通過調(diào)控抗寒基因的表達(dá)、寒冷信號(hào)傳導(dǎo)等過程來提高植物的耐寒性[16]。本試驗(yàn)旨在研究不同濃度的水楊酸對(duì)番茄幼苗耐寒性的影響，測(cè)定與低溫相關(guān)的生理指標(biāo)，分析后得到抵抗低溫效果最好的濃度，設(shè)定為最佳處理濃度。之后用RT-PCR法測(cè)定經(jīng)過最佳處理濃度誘導(dǎo)的番茄葉片低溫相關(guān)基因（冷響應(yīng)轉(zhuǎn)錄激活因子基因CBF1、CBFs基因的轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)因子ICE1、冷誘導(dǎo)基因COR15a）的相對(duì)表達(dá)量，為今后番茄的合理化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料的處理

試驗(yàn)于2014年9月9日在東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝站番茄課題組試驗(yàn)溫室進(jìn)行。試驗(yàn)材料為東北農(nóng)業(yè)大學(xué)番茄課題組東農(nóng)11537種子。當(dāng)番茄幼苗長(zhǎng)至4葉1心期時(shí)，選擇生長(zhǎng)勢(shì)相同的幼苗，分別用200、250、300、350、400、450 mg/L的SA溶液均勻噴灑在葉片上，以噴灑蒸餾水作為對(duì)照（CK1為低溫對(duì)照，CK2為常溫對(duì)照）。連續(xù)噴施3 d，以便提高外源物質(zhì)的吸收效果。將噴施SA溶液植株放在光照培養(yǎng)箱（LRH-250-G型）中進(jìn)行低溫脅迫，晝夜溫度設(shè)定為白天（10±05） ℃，夜晚（5±0.5） ℃，光照時(shí)間為16 h，光強(qiáng)為 4 000 lx，低溫脅迫10 d。

在低溫脅迫0、2、4、6、8、10 d時(shí)取樣，每次從各濃度中隨機(jī)選取10株，剪取功能葉，混合后測(cè)定生理指標(biāo)；在低溫脅迫0、6、12、24、48、72 h時(shí)取樣，用液氮冷凍，存于-80 ℃條件下，用于基因表達(dá)量的測(cè)定[17]。試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2生理指標(biāo)的測(cè)定與實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析

脯氨酸含量采用脯氨酸試劑盒測(cè)定，試劑盒購于南京建成生物工程研究所。

相對(duì)電導(dǎo)率、葉綠素含量、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）活性以及丙二醛（MDA）含量和可溶性蛋白含量均參照李合生的方法[18]測(cè)定，有所改動(dòng)。

用Trizol法提取總RNA。總RNA的濃度和質(zhì)量由Nanodrop 2000微體積分光光度計(jì)（Thermo Scientific，USA）采用吸光度進(jìn)行測(cè)量。RNA的完整性通過1%瓊脂糖凝膠電泳和溴化乙錠染色進(jìn)行分析。選用番茄a(bǔ)ctin內(nèi)源基因（登錄號(hào)：EU408340.1）作為內(nèi)參基因，利用全式金試劑盒將提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，應(yīng)用SYBR Green熒光染料嵌合法，使用iQ5 Real Time PCR Detection System（BioRad，USA）對(duì)內(nèi)參基因和目的基因進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，每個(gè)反應(yīng)設(shè)3個(gè)重復(fù)，采用2-ΔΔCT法進(jìn)行目的基因相對(duì)表達(dá)量分析。

1.3數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)用Microsoft Excel和SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2結(jié)果分析

2.1葉片各項(xiàng)生理指標(biāo)

2.1.1低溫處理下外源水楊酸誘導(dǎo)對(duì)番茄葉綠素含量的影響

由圖1-a可知，在未進(jìn)行低溫處理時(shí)，經(jīng)過不同濃度SA誘導(dǎo)的葉片葉綠素含量基本相同；在低溫處理進(jìn)行的最初 48 h 里，絕大部分葉片的葉綠素含量在原有基礎(chǔ)上有不同程度的降低；48 h后葉片葉綠素含量回升，其中350 mg/L處理與對(duì)照組和其他處理相比優(yōu)勢(shì)顯著，在低溫脅迫的6 d后，350 mg/L 處理的葉片葉綠素含量達(dá)到最高值。

2.1.2低溫處理下外源水楊酸誘導(dǎo)后對(duì)番茄葉片相對(duì)電導(dǎo)率的影響

由圖1-b可知，在低溫處理進(jìn)行的最初48 h里，大部分葉片的相對(duì)電導(dǎo)率在原有基礎(chǔ)上均有不同程度的降低；在低溫脅迫4 d時(shí)，常溫對(duì)照的葉片相對(duì)電導(dǎo)率達(dá)到了峰值，此時(shí)相對(duì)電導(dǎo)率最低的是300 mg/L的處理；之后，300 mg/L 處理的相對(duì)電導(dǎo)率值一直低于其他濃度處理并遠(yuǎn)低于對(duì)照組。如此認(rèn)為，300 mg/L的處理為最佳濃度。

2.1.3低溫處理下外源水楊酸誘導(dǎo)后對(duì)番茄脯氨酸含量的影響

由圖1-c可知，從低溫處理開始的48 h內(nèi)，除常溫對(duì)照組以外，其他葉片的脯氨酸含量在原有基礎(chǔ)上均有不同程度的降低；2 d后葉片脯氨酸含量呈現(xiàn)回升的趨勢(shì)，在低溫脅迫的4 d后，大部分葉片脯氨酸含量再次降低，大多數(shù)濃度的處理在脅迫6 d后達(dá)到了自身脯氨酸含量的最低值；脅迫6 d后脯氨酸含量升高，其中350 mg/L處理的葉片脯氨酸含量明顯高于其他處理。

2.1.4低溫處理下外源水楊酸誘導(dǎo)后對(duì)番茄超氧化物歧化酶含量的影響

由圖1-d可知，在低溫處理進(jìn)行的最初48 h里，葉片的SOD含量在原有基礎(chǔ)上均有不同程度的升高；48 h 后葉片SOD含量開始下降，在低溫脅迫的4 d后，多數(shù)處理葉片SOD含量再次升高，大多數(shù)濃度的處理在脅迫8 d后達(dá)到了自身SOD含量的最高值；其中350 mg/L處理相對(duì)于其他處理有明顯優(yōu)勢(shì)。

2.1.5低溫處理下外源水楊酸誘導(dǎo)后對(duì)番茄過氧化氫酶含量的影響

由圖1-e可知，在低溫處理進(jìn)行的最初48 h里，葉片的CAT含量在原有基礎(chǔ)上均有不同程度的降低，在低溫處理48 h后，除200 mg/L、CK常溫、250 mg/L的處理以外，其他處理的CAT含量達(dá)到最低值；并且除200 mg/L的處理以外，其他處理的CAT含量均在2 d后升高，其中，350 mg/L處理上升幅度最大。整體變化中350 mg/L處理明顯較其他濃度處理有明顯優(yōu)勢(shì)。

2.1.6低溫處理下外源水楊酸誘導(dǎo)后對(duì)番茄過氧化物酶含量的影響

由圖1-f可知，在低溫處理進(jìn)行的最初48 h里，番茄葉片的POD含量在原有基礎(chǔ)上均有不同程度的降低，且絕大多數(shù)濃度達(dá)到了自身最低值；48 h后多數(shù)處理葉片POD含量回升且持續(xù)升高，直至試驗(yàn)結(jié)束。其中以350 mg/L處理POD含量上升幅度較大，其含量明顯高于其他處理。

2.1.7低溫處理下外源水楊酸誘導(dǎo)后對(duì)番茄可溶性蛋白含量的影響

由圖1-g可知，在低溫處理開始至處理的4 d內(nèi)，低溫使葉片組織遭到破壞，大部分處理的可溶性蛋白含量直線上升；脅迫4 d后，大多數(shù)處理葉片可溶性蛋白含量均達(dá)到了自身含量的最高值；之后又呈現(xiàn)了明顯的下降趨勢(shì)。其中，300 mg/L的處理為最佳濃度。

2.1.8低溫處理下外源水楊酸誘導(dǎo)后對(duì)番茄丙二醛含量的影響

由圖1-h可知，低溫脅迫開始后，各濃度處理番茄葉片MDA含量降低趨勢(shì)顯著，在低溫脅迫的4 d后，大部分葉片MDA含量達(dá)到了自身含量的最低值；隨低溫脅迫的進(jìn)行，MDA含量有所回升，但變化幅度較小，且逐漸趨于平衡。整體變化中350 mg/L處理明顯較其他濃度處理有明顯優(yōu)勢(shì)。

2.2低溫脅迫下番茄葉片低溫相關(guān)基因相對(duì)表達(dá)量的變化

由圖2可知，在低溫環(huán)境下，外源水楊酸誘導(dǎo)后的番茄葉片中低溫相關(guān)基因CBF1、ICE1、COR15a表達(dá)量均高于相同環(huán)境下的對(duì)照組。大部分處理的CBF1基因表達(dá)量呈現(xiàn)了先下降后上升之后一直下降的趨勢(shì)，在低溫脅迫24 h時(shí)，CBF1基因表達(dá)量達(dá)到了最高值。ICE1、COR15a基因的表達(dá)量變化趨勢(shì)為先上升后下降，且在脅迫12 h時(shí)表達(dá)量達(dá)到最高值。水楊酸誘導(dǎo)過的番茄葉片低溫相關(guān)基因表達(dá)量相對(duì)于對(duì)照組有明顯優(yōu)勢(shì)。

3討論與結(jié)論

對(duì)番茄幼苗進(jìn)行適宜濃度的SA預(yù)處理，能夠使其葉片中的SA質(zhì)量分?jǐn)?shù)上升，且上升到一定程度后，便可誘導(dǎo)番茄葉片內(nèi)的膜系統(tǒng)保護(hù)酶（主要指SOD、POD和CAT）的活性增強(qiáng)，SOD可催化 O-2[KG-*2]· [KG-*3]歧化為H2O2，誘導(dǎo)H2O2的適量積累。POD、CAT再將其還原為H2O，對(duì)于清除氧自由基有較大作用，從而上調(diào)植物的抗氧化能力[19]。MDA是膜脂過氧化最重要的產(chǎn)物之一，它的產(chǎn)生還能加劇膜的損傷，因此在植物衰老生理和抗性生理研究中MDA含量是一個(gè)常用指標(biāo)，可通過MDA了解膜脂過氧化的程度，以間接測(cè)定膜系統(tǒng)受損程度以及植物的抗逆性[20]。本試驗(yàn)中，噴施了各濃度SA的番茄葉片MDA含量與對(duì)照相比明顯降低，說明SA能降低番茄葉片膜質(zhì)的過氧化程度，提高其抗性，延緩植株衰老死亡?？扇苄缘鞍资侵匾臐B透調(diào)節(jié)物質(zhì)和營養(yǎng)物質(zhì)，其增加和積累能提高細(xì)胞的保水能力，對(duì)細(xì)胞的生命物質(zhì)及生物膜起到保護(hù)作用，因此經(jīng)常用作篩選抗性的指標(biāo)之一[21]。SA誘導(dǎo)番茄葉片可溶性蛋白含量上升，保護(hù)生物膜，抵御低溫對(duì)葉片組織造成的破壞。其中以350 mg/L處理的效果最好。脯氨酸是植物細(xì)胞的內(nèi)含物質(zhì)，是蛋白質(zhì)的組分之一。脯氨酸可以游離狀態(tài)廣泛存在于植物體中。試驗(yàn)中，脯氨酸含量在低溫脅迫6 d后明顯升高，說明SA可誘導(dǎo)番茄葉片中脯氨酸含量增加，保持植物原生質(zhì)體與外界環(huán)境的滲透平衡，維持細(xì)胞膜流動(dòng)性和膜結(jié)構(gòu)的完整性，提高番茄在低溫環(huán)境下的抗逆性[22]。

葉綠素是一類與光合作用有關(guān)的植物色素，植物葉片中葉綠素的含量與葉片吸光性呈正相關(guān)，在逆境中的含量變化是反映葉片生理活性的重要指標(biāo)之一。本試驗(yàn)中，350 mg/L SA處理的葉綠素含量在脅迫的6 d后達(dá)到了最高值，且明顯高于對(duì)照。這說明，低溫環(huán)境中SA能誘導(dǎo)番茄葉片葉綠素含量升高，維持光合作用的順利進(jìn)行。相對(duì)電導(dǎo)率是衡量細(xì)胞膜透性的重要指標(biāo)，植物體在逆境條件下，電解質(zhì)的滲透量加大，組織相對(duì)電導(dǎo)率升高，細(xì)胞膜受到傷害[23]。噴施不同濃度的SA后，番茄葉片相對(duì)電導(dǎo)率明顯降低。植物葉片組織相對(duì)電導(dǎo)率越高，說明細(xì)胞膜完整性遭到破壞的程度就越大。由此可知，噴施一定濃度的SA能有效降低番茄葉片相對(duì)電導(dǎo)率，保護(hù)細(xì)胞的完整性，其中以350 mg/L的處理降低趨勢(shì)最明顯，為最佳處理濃度。這與于錫宏等[1]、李艷軍等[8]的研究結(jié)果一致。

CBF1轉(zhuǎn)錄因子能調(diào)控1組抗干旱、抗低溫基因的表達(dá)，CBF1通過感受上游傳遞的低溫信號(hào)并將信號(hào)向下游傳遞，更有效地提高植物抗干旱、抗低溫的能力[24]。ICE1是唯一的已鑒定直接作用于CBF啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄因子。ICE1在細(xì)胞核中組成型表達(dá)，但是卻需要經(jīng)過冷誘導(dǎo)的構(gòu)型變化（可能是磷酸化和去磷酸化作用）調(diào)節(jié)活性，從而激活下游基因的表達(dá)[25]。COR15a基因編碼的多肽，富含丙氨酸、天冬氨酸等氨基酸，可形成親水脂性的α-螺旋，這種結(jié)構(gòu)對(duì)于穩(wěn)定細(xì)胞膜，使植物體免受脫水傷害起重要作用，從而提高植物的抗寒性[26]。本研究中葉片CBF1、ICE1、COR15a的表達(dá)情況（圖2）與前人的研究結(jié)果相符合，這表明CBF1、ICE1、COR15a基因均參與番茄的低溫脅迫。在外源水楊酸處理后，上述基因表達(dá)量呈先上升再下降的趨勢(shì)，一定時(shí)間內(nèi)可誘導(dǎo)其抗冷能力在不同程度上增強(qiáng)。根據(jù)本試驗(yàn)測(cè)定的各項(xiàng)生理指標(biāo)和3種低溫相關(guān)基因的表達(dá)量來看，外源水楊酸處理后番茄的抗冷能力均在不同程度上增強(qiáng)，其中以噴施350 mg/L的處理效果最好。

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