肺癌組織環(huán)指蛋白RNF38的表達(dá)及其臨床意義

李繼軍， 金 淳， 熊 點(diǎn)， 蔣家好， 丁建勇*

1.復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院胸外科，上海 200032 2.新疆維吾爾自治區(qū)喀什第二人民醫(yī)院心胸外科，喀什 844000 3.南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院心胸外科，南昌 330006

·短篇論著·

肺癌組織環(huán)指蛋白RNF38的表達(dá)及其臨床意義

李繼軍1,2， 金 淳1， 熊 點(diǎn)3， 蔣家好1， 丁建勇1*

1.復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院胸外科，上海 200032 2.新疆維吾爾自治區(qū)喀什第二人民醫(yī)院心胸外科，喀什 844000 3.南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院心胸外科，南昌 330006

目的： 探討肺癌組織環(huán)指蛋白RNF38的表達(dá)及其與肺癌臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系。方法： 采用組織芯片檢測208例肺癌組織中RNF38蛋白表達(dá)，分析其與肺癌患者臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果： 肺癌組織RNF38表達(dá)高于癌旁正常肺組織。不同腫瘤大小 (P=0.000 2)、不同腫瘤分期(P=0.011)、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.000 04)及不同腫瘤類型(P=0.030)患者肺癌組織RNF38蛋白表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。RNF38高表達(dá)預(yù)示肺癌患者總生存率低。單因素分析顯示RNF38表達(dá)與肺癌患者預(yù)后相關(guān)。結(jié)論： RNF38高表達(dá)與肺癌的惡性表型及不良預(yù)后相關(guān)。

RNF38；肺癌；預(yù)后

我國肺癌的發(fā)病率和死亡率均呈上升態(tài)勢[1-2]。因其起病隱匿，癥狀和其他呼吸道疾病類似，且大部分患者無自覺癥狀者，一般確診已是晚期[3-4]。肺癌的侵襲轉(zhuǎn)移與復(fù)發(fā)是患者死亡的主要原因。因此，尋求有效的抗肺癌轉(zhuǎn)移與復(fù)發(fā)治療措施，對改善肺癌患者的預(yù)后具有重要意義[5]。

研究證實(shí)泛素化系統(tǒng)的異常與腫瘤發(fā)生、神經(jīng)退行性疾病、免疫及炎癥反應(yīng)等緊密相關(guān)[6]。作為

E3-泛素連接酶，RNF38通過蛋白-蛋白、蛋白-DNA相互作用，參與調(diào)節(jié)多種生理功能[7]。其功能異常與腫瘤的發(fā)生、細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及凋亡等相關(guān)[7]。既往研究[8]表明，抑癌基因p53是RNF38的泛素化底物，RNF38參與了p53的亞細(xì)胞定位。因此，本研究擬在肺癌組織中檢測RNF38表達(dá)，明確其與肺癌患者臨床病理特征以及預(yù)后的相關(guān)性，為肺癌的臨床診治提供參考。

1 材料與方法

1.1 組織標(biāo)本的獲取 選取2005年1月至2005年12月，在復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院胸外科行肺癌切除術(shù)的208例患者的肺癌組織石蠟標(biāo)本。組織芯片的制作由上海芯超生物科技有限公司完成。肺癌的診斷標(biāo)準(zhǔn)按照世界衛(wèi)生組織(WHO)標(biāo)準(zhǔn)，所有病例均有完整隨訪資料。隨訪截止至2010年3月。本研究通過醫(yī)院倫理委員會審核批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑 兔抗人RNF38多克隆抗體購自Proteintech公司；SP試劑盒、DAB試劑、二甲苯、3%過氧化氫、中性樹膠、蘇木精溶液、無水乙醇與1%鹽酸乙醇購自上海翊圣生物科技有限公司。

1.3 免疫組化染色及結(jié)果判定 組織芯片60℃高溫烤片2 h；二甲苯脫蠟、梯度乙醇后水化及磷酸緩沖液洗片3次；芯片完全浸入pH 6.0的檸檬酸液中，放入高壓鍋抗原修復(fù)，磷酸緩沖液洗片3次；3%過氧化氫室溫孵育除去內(nèi)源性過氧化物酶活性，磷酸緩沖液洗片；室溫BSA封閉30 min；甩去血清，滴加抗RNF38抗體 (1∶200)，4℃冰箱孵育24 h；磷酸緩沖液浸洗，滴加辣根過氧化物酶二抗，室溫孵育60 min，磷酸緩沖液浸洗；滴加新鮮配制的DAB顯色液，顯微鏡觀察，控制顯色時(shí)間，自來水浸洗中止顯色，蘇木精復(fù)染30 s，水洗返藍(lán)20 min；梯度乙醇脫水，二甲苯透明；中性樹膠封片。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：RNF38的判定以胞質(zhì)與核中出現(xiàn)棕黃色顆粒為顯色，使用IPP檢驗(yàn)來判斷RNF38的高低表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件，組間差異比較采用方差檢驗(yàn)。繪制Kaplan-Meier總體生存曲線，Cox模型分析預(yù)后因素。檢驗(yàn)水準(zhǔn)(α)為0.05。

2 結(jié) 果

2.1 肺癌組織中RNF38的表達(dá) 結(jié)果(圖 1)表明：RNF38蛋白陽性染色主要定位于癌細(xì)胞胞質(zhì)與核；肺癌組織RNF38表達(dá)高于相應(yīng)癌旁正常肺組織；208例肺癌組織中RNF38陽性表達(dá)占48.8% (102/208)。

2.2 RNF38蛋白表達(dá)與肺癌患者臨床病理特征的關(guān)系 結(jié)果(表 1)表明：不同病理類型(P= 0.030)、不同腫瘤分級(P= 0.011)、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P= 0.000 04)、不同腫瘤大小 (P= 0.000 2)的肺癌組織RNF38蛋白表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。不同年齡 (P=0.553)、不同性別 (P= 0.278)、不同吸煙情況 (P=1.000)、不同腫瘤分化(P=0.403)情況下肺癌組織RNF38蛋白表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 H-E及免疫組化染色測定肺癌組織RNF38的表達(dá)

變量病例數(shù)RNF38表達(dá)低表達(dá)高表達(dá)P年齡0.553 <60歲1025250 ≥60歲1065452性別0.278 男1487375 女603327吸煙情況1.000 有844341 無1246361病理類型0.030 鱗狀細(xì)胞癌853451 腺癌1106545 其他1376腫瘤分級0.011 Ⅰ-Ⅱ1448262 Ⅲ-Ⅳ642440淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移0.00004 有903159 無1187543腫瘤直徑0.0002 <3cm694821 ≥3cm1395881分化0.403 高中分化1156253 低分化934449

2.3 RNF38水平與肺癌患者預(yù)后的關(guān)系 208例患者隨訪過程中共有109例死于肺癌的轉(zhuǎn)移與復(fù)發(fā)，總體5年生存率為47.6%，RNF38高表達(dá)患者(n=102)相比RNF38低表達(dá)患者(n=106)總生存率較低(P=0.012，圖 2)。

2.4 Cox模型分析 單因素分析(表2)表明影響肺癌生存預(yù)后的因素包括：腫瘤大小(P=9.76×10-6)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=3.47×10-9)、腫瘤分期(P=4.65×10-8)、腫瘤分化(P=0.050)、RNF38表達(dá)(P=0.013)。

多因素分析結(jié)果(表2)表明：腫瘤大小(P=0.002)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.002)、腫瘤分期(P=0.046)是影響總生存率的獨(dú)立預(yù)后因素。

圖2 Kaplan-Meier分析RNF38表達(dá)與預(yù)后關(guān)系

變 量單因素分析HR95%CIP多因素分析HR95%CIP性別(男vs女)0.7890.526-1.1830.251吸煙情況(無vs有)0.7790.543-1.1180.175腫瘤大小(≥3cmvs<3cm)2.7551.758-4.3189.76×10-62.1131.322-3.3770.002淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(有vs無)3.0422.103-4.3993.47×10-92.0611.302-3.2620.002腫瘤分期(Ⅲ-ⅣvsⅠ-Ⅱ)2.7711.922-3.9934.65×10-81.5621.009-2.4180.046腫瘤分化(中/高分化vs低分化)1.4311.000-2.0490.0501.1930.826-1.7220.346RNF38表達(dá)(低vs高)1.5791.101-2.2650.0131.0140.692-1.4860.944

3 討 論

目前，肺癌是嚴(yán)重威脅人類生命健康[4]。2014年，我國腫瘤登記中心數(shù)據(jù)顯示，全國男性肺癌的發(fā)病率在所有惡性腫瘤中占據(jù)第一位；女性肺癌的發(fā)病率在所有惡性腫瘤中也位居第二。肺癌防治仍然是目前亟待解決的重大難題[1-2]。肺癌的轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)是根治性切除手術(shù)治療失敗的主要原因，然而當(dāng)前對其轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)的分子機(jī)制尚不完全清楚[5]。因此，進(jìn)一步闡釋肺癌侵襲與轉(zhuǎn)移的精確分子機(jī)制，并為肺癌轉(zhuǎn)移的早期診斷、患者的預(yù)后判斷及有效治療提供新的靶點(diǎn)對提高患者生存率及生活質(zhì)量具有重要意義。

本研究通過免疫組織化學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)，E3-泛素連接酶RNF38在部分肺癌組織中高表達(dá)，且高表達(dá)RNF38與肺癌惡性表型正相關(guān)；重要的是其高表達(dá)患者預(yù)后較低表達(dá)患者差。盡管，影響肺癌患者預(yù)后的因素較多，但結(jié)合RNF38高表達(dá)與肺癌腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與腫瘤分期相關(guān)，提示RNF38與肺癌侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)，值得進(jìn)一步研究。

多種環(huán)指蛋白家族參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展[6,9]。本研究發(fā)現(xiàn)RNF38表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)與核，且在腫瘤中表達(dá)明顯高于癌旁正常組織，提示RNF38是肺癌預(yù)后潛在的預(yù)測指標(biāo)。

[ 1 ] 陳萬青,張思維,鄒小農(nóng).中國肺癌發(fā)病死亡的估計(jì)和流行趨勢研究[J].中國肺癌雜志, 2010, 13(5):488-493.

[ 2 ] 丁一波,傅忠星,王燁菁,等.2004—2011年上海市盧灣區(qū)社區(qū)人群肺癌的發(fā)病和死亡資料分析[J].中國臨床醫(yī)學(xué), 2016,23(5): 602-606.

[ 3 ] 張一秋,石洪成,李蓓蕾,等.肺癌骨轉(zhuǎn)移SPECT/CT融合圖像的影像學(xué)特點(diǎn)分析[J].中國臨床醫(yī)學(xué), 2014,21(6): 633-635.

[ 4 ] 楊拴盈.肺癌早期診斷的現(xiàn)狀、困惑和希望[J].西安交通大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2011,15(1):1-5.

[ 5 ] LIAO Y F, WU Y B, LONG X,et al.High level of BRD4 promotes non-small cell lung cancer progression[J].Oncotarget,2016,7(8):9491-9500.

[ 6 ] HOELLER D, HECKER C M, DIKIC I.Ubiquitin and ubiquitin-like proteins in cancer pathogenesis[J].Nat Rev Cancer, 2006,6(10):776-788.

[ 7 ] EISENBERG I, HOCHNER H, LEVI T, et al.Cloning and characterization of novel human gene RNF38 encoging a conserved putative protein with a RING finger domain[J].Biochem Biophys Res Commun,2002, 294 (5):1169-1176.

[ 8 ] SHEREN J E, KASSENBROCK C K.RNF38 encodes a nuclear ubiquitin protein ligase that modifies p53[J].Biochem Biophys Res Commun, 2013, 440(4):473-478.

[ 9 ] STEINHART Z, PAVLOVIC Z, CHANDRASHEKHAR M, et al.Genome-wide CRISPR screens reveal a Wnt-FZD5 signaling circuit as a druggable vulnerability of RNF43-mutant pancreatic tumors[J].Nat Med, 2017,23(1):60-68.

[本文編輯] 曉 路

Expression of RNF38 in lung cancer and its clinical significance

LI Ji-jun1,2, JIN Chun1, XIONG Dian3, JIANG Jia-hao1, DING Jian-yong1*

1.Department of Chest Surgery, Zhongshan Hospital, Fudan University, Shanghai 200032, China 2.Department of Cardiothoracic Surgery, Second People's Hospital of Kashgar, Kashgar 844000, the Xinjiang Uygur Autonomous Region, China 3.Department of Cardiothoracic Surgery, Second Affiliated Hospital of Nanchang University, Nanchang 330006, Jiangxi, China

Objective： To investigate the expression of RNF38 in lung cancer, and its correlationship with clinicopathologic feature and prognosis.Methods： Tissue microarray was used to detect the level of RNF38 in 208 lung cancer patients, then its correlationship with clinicopathologic feature and prognosis was analyzed.Results： RNF38 expression was higher in lung cancer tissues compared with the corresponding adjacent normal lung tissues.High level of RNF38 was related significantly to tumor size (P=0.0002), tumor stage (P=0.011), lymph node metastasis (P=0.000 04) and histological type (P=0.030).High level of RNF38 indicates low overall survival rate.Single factor analysis showed that RNF38 expression was related to lung cancer patients’ prognosis.Conclusions： The high level of RNF38 could be a new marker in predicting the prognosis of lung cancer.

RNF38;lung cancer; prognosis

2017-01-19 [接受日期] 2017-02-15

國家自然科學(xué)基金(81201834,81502502).Supported by National Natural Science Foundation of China (81201834， 81502502).

李繼軍，碩士，副主任醫(yī)師.E-mail: 1256239505@qq.com

*通信作者(Corresponding author).Tel: 021-64041990, E-mail: ding.jianyong@zs-hospital.sh.cn

10.12025/j.issn.1008-6358.2017.20170053

R 734.2

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