質譜技術在抗體藥物分析中的應用

摘要：質譜技術是抗體藥物分析最重要的技術手段之一。本文簡述了抗體藥物的發(fā)展和質譜技術的原理。對于質譜技術在抗體藥物的分析中應用進行了歸類整理，主要分為在一級結構和高級結構分析中的應用。

關鍵詞：抗體藥物 質譜 一級結構 高級結構

單克隆抗體藥物的發(fā)展起源于1975年，Kohler 和Milstein 創(chuàng)立雜交瘤技術，為大量制備鼠源單克隆抗體提供了技術條件，開創(chuàng)了大規(guī)模制備單克隆抗體時代?？贵w類藥物是指含有抗體片段的蛋白類藥物，所以在惡性腫瘤、自身免疫性疾病、心血管疾病、感染和器官移植排斥等重大疾病上得到了快速的發(fā)展，是當前生物藥物領域增長最快的一類藥物。[1]

1.抗體藥物發(fā)展新趨勢

在生物藥物領域，抗體藥物占據著越來越重要的地位，2015年全球銷售排名前10 位的藥物中有6 個為抗體藥物，分別是humira、enbrel、remicade、rituxan、avastin和Herceptin?？贵w藥物按來源分類可以分為：鼠源單克隆抗體、人鼠嵌合抗體、人源化抗體和全人源抗體。目前，F(xiàn)DA 批準的單克隆抗體藥物中，人源化單抗和全人源單抗數(shù)量已占據72%[2]

1.1抗體藥物偶聯(lián)物（ADC）

抗體藥物偶聯(lián)物（ADC）由單克隆抗體和小分子化合物兩部分組成。通過抗體的靶向作用，ADC 的抗體部分和腫瘤細胞表面抗原特異性識別并結合，通過細胞內吞作用，將抗體和小分子化合物一起帶進腫瘤細胞內部，釋放出小分子化合物。[3]這樣既可以降低小分子藥物的毒性，同時具有靶向結合的作用。已經上市的兩個ADC是Kadyla和Adcetris。

1.2雙特異性抗體（BsAb）

雙特異性抗體（BsAb）是含有兩種特異性抗原結合位點的人工抗體，能在靶細胞和功能分子（細胞）之間架起橋梁，。由于基因工程的發(fā)展，目前雙特異性抗體已經研發(fā)出多種類型[4]，主要類型有三功能雙特異性抗體、IgG-scFv、三價雙特異性分子、串聯(lián)單鏈抗體（串聯(lián)scFv）、DVD-Ig 等多種形式。

2.質譜技術

近年來質譜儀性能的顯著改進主要基于開發(fā)出的兩種離子化技術：一種是介質輔助的激光解吸/離子化[5]技術。另一種是電噴霧離子化[6]技術。由于這兩種電離技術的出現(xiàn)，使原本只能檢測小分支的質譜技術，可以運用于檢測生物大分子。

在過去質譜技術主要運用于對一級結構和序列的表征，而現(xiàn)在質譜技術越來越多地運用于高級結構的分析，而高級結構對于抗體藥物的生物活性至關重要。

3.質譜技術在抗體藥物一級結構分析中的應用

3.1完整抗體藥物精確分子量測定

當?shù)玫娇贵w藥物時，可以直接通過高分辨率的MALDI-TOF或者ESI-MS進行分子量的檢測。通過對于脫糖后分子量的檢測，可以對于抗體藥物進行初步定性分析，并將可以作為藥物常規(guī)放行的分析方法[7]。對于脫糖前的抗體藥物進行分析，可以得到抗體藥物的糖基化類型的信息及糖基化水平的分布[8]，對于快速了解生產工藝與藥物質量的關系具有十分重要的意義。

3.2藥物抗體偶聯(lián)比（DAR）

對于賴氨酸鏈接的抗體偶聯(lián)藥物，采用C4 色譜柱及聯(lián)用的質譜對去糖基化樣品進行分析，根據偶聯(lián)不同數(shù)目藥物分子的質量數(shù)增加判斷偶聯(lián)數(shù)目[9]。對于質譜測定的結果，不僅可以給出確切的藥物抗體偶聯(lián)比值，更能夠給出鏈接不同個小分子藥物的分布情況，及反應過程副產物空鏈接頭的分布情況。[10]

3.3肽指紋圖譜

蛋白被特異酶切微店的蛋白酶水解后得到的肽片段質量圖譜。由于不同的抗體藥物具有不同的氨基酸序列，蛋白質被酶水解后，產生的肽片段也各不相同，肽混合物的質量數(shù)醫(yī)具有指紋特征。可以通過LC-ESI-MS進行肽片段的一級質量數(shù)的鑒定，也可以通過LC-ESI-MS/MS對于每個肽片段進行進一步確證，提高肽指紋圖譜的準確性。

3.4翻譯后修飾研究

蛋白質的翻譯后修飾（PTM）對于抗體藥物的生物學功能十分重要。常見的翻譯后修飾有：磷酸化、脫酰胺、甲硫氨酸氧化、糖基化修飾、N 端焦谷氨酸環(huán)化，C 端賴氨酸切除等。質譜分析儀檢測蛋白和肽片段的分子量偏差，可以實現(xiàn)高靈敏、高通量和高精確地鑒別蛋白質的翻譯后修飾的種類。[11]

3.5 N端氨基酸序列檢測

常規(guī)N端氨基酸檢測用Edman 降解法進行檢測，但是抗體藥物有時候會出現(xiàn)N端環(huán)化的現(xiàn)象，在這種情況下用Edman 降解法需要先對抗體進行去封閉處理，而直接使用質譜可以直接測出N端的氨基酸序列，同時可以檢測出N端環(huán)化的相對比例。[12]

4.質譜技術在抗體藥物高級結構分析中的應用

4.1氫/氘交換質譜（HDX-MS）

常規(guī)的質譜只能獲得蛋白的一級結構信息。氫/氘交換質譜（HDX-MS）可以進行蛋白質構象，溶液動力學和表位映射進行分析。在能夠調查的蛋白質的高階結構和動態(tài)結構技術中，HDX-MS已經證明適合單克隆抗體和單克隆抗體 - 抗原復合物的構象分析。

4.2離子淌度質譜法（IM-MS）。

離子淌度是根據蛋白的電荷和形狀選擇性分離的方法，可以區(qū)分相同分子量的蛋白和肽段，可用于檢測蛋白的簡單高級結構。

4.3高分辨率傅立葉變換離子回旋共振質譜（FTICR-MS）

高分辨率傅立葉變換離子回旋共振質譜（FTICR-MS）能夠檢測最高質量數(shù)的質譜儀器，并且有著很高的分辨率。FTICR-MS是目前被公認為是蛋白質組學研究的有力工具，特別是和完整的蛋白質鑒定和上/下調翻譯后修飾（PTM）蛋白質的鑒定。

4.小結

隨著抗體藥物的不斷發(fā)展，需要對于抗體藥物的結構信息不斷進行深入的分析，質譜技術也隨著這一要求不斷進步。在現(xiàn)階段，由于生物質譜分析的成本很高，并且對于人員的要求比較高，所以使其應用受到了限制。當然隨著技術的進步，可以預見質譜分析會越來越多地運用于抗體分析中，特別是在高級結構分析的領域，通過質譜分析，可以讓我們更多獲得高級結構的信息，這對于抗體藥物的分析是極為重要的。

參考文獻：

[1]王蘭，朱磊，徐剛領，等.單克隆抗體類生物治療藥物研究進展[J].中國藥學雜志，2014，49（23）：2058-2064.

[2]李壯林，姚雪靜. 單克隆抗體藥物研究進展[J].藥物生物技術，2014，21（5）：456-461.

[3]Austin CD，Wen X，Gazzard L，et al. Oxidizing potential of endosomes and lyosomes limits intracellular cleavage of disulfidebased antibody-drug conjugates[J]. Proc Natl Acad Sci，2005，102（50）：17987-17992.

[4]Kontenrmann，R. Dual targeting strategies with bispecific antibodies[J]. Mabs，2012，4（2）：182-197.

[5]Vestal M L，Juhasz P. Delayed extraction matrix-assisted laser desorption time-of-flight mass spectrometry.[J].Rapid Commun Mass Spectrom，1995，9：1044-1050

[6]Tisato F，Bolzati C，Porchia M.Contribution of electrospray mass spectrometry for characterization，design，and development of nitride technetium and rhenium heterocomplexes as potential radiopharmaceuticals[J]. Mass Spectrometry Reviews，Published Online，2004，23（5）：309-332.

[7]李萌，于傳飛，王馨，等. 相對分子質量測定作為單抗藥物常規(guī)放行分析方法的可行性商榷[J]. 藥物分析雜志，2015，12：2076-2082.

[8]Zhu L，Guo Q，Guo H，et al.Versatile characterization of glycosylation modification in CTLA4-Ig fusion proteins by liquid chromatography-mass spectrometry. [J]. MAbs. 2014；6（6）：1474-1485.

[9]于傳飛，李萌，郭瑋，等. 一種抗體藥物偶聯(lián)物中藥物抗體偶聯(lián)比的測定[J]. 藥學學報，2014，03：363-367.

[10]Wakankar A Chen Y，Gokarn Y，et al. Analytical methods for physicochemical characterization of antibody drug conjugates. [J]. MAbs. 2011；3（2）：161-172.

[11]Duan X T，Dai L P，Chen S C，et al. Nano-scale liquid chromatography/mass spectrometry and on-the-fly orthogonal array optimization for quantification of therapeutic monoclonal antibodies and the application in preclinical analysis. [J]. J Chromatogr A，2012，1251（17）：63-73.

[12]Stackhouse N，Miller AK，Gadgil HS. A high-throughput UPLC method for the characterization of chemical modifications in monoclonal antibody molecules. [J].J Pharm Sci. 2011；100（12）：5115-5125.

作者簡介：高燕波（1990～），女，研究方向為抗體藥物研發(fā)。正在攻讀上海交通大學生物工程專業(yè)碩士；Email：gaoyanbo_1990@163.com