LC-MS/MS法測定布洛芬顆粒劑的人體生物等效性研究

董曉茜，吳 怡，張世良，楊 瑞，唐 思，夏素霞

·藥學(xué)研究·

LC-MS/MS法測定布洛芬顆粒劑的人體生物等效性研究

董曉茜，吳 怡，張世良，楊 瑞，唐 思，夏素霞*

目的 研究布洛芬顆粒在健康人體內(nèi)的藥動學(xué)及其生物利用度，以評價(jià)其與布洛芬混懸液的生物等效性。方法 23例健康男性志愿受試者，采用隨機(jī)、開放、單劑量、雙周期自身交叉試驗(yàn)設(shè)計(jì)。分別口服布洛芬顆粒(受試制劑)與布洛芬混懸液(參比制劑)后，采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)法測定血漿中布洛芬的藥物濃度。結(jié)果 受試制劑與參比制劑的Cmax分別為(17.438 6±5.304 0)、(18.557 7±4.641 7) mg/L，AUC0-24分別為(59.000 3±13.935 3)、(58.506 4±16.720 2) mg/(h·L)，AUC0-∞分別為(59.718 0±14.020 0)、(59.227 8±16.815 8) mg/(h·L)，Tmax分別為(1.478 3±0.922 9)、(1.021 7±0.822 0) h。結(jié)論 空腹口服布洛芬顆粒受試制劑與參比制劑具有生物等效性。

布洛芬；血藥濃度；LC-MS/MS；生物利用度；藥代動力學(xué)

0 引言

布洛芬是一種非甾體抗炎藥，通過抑制環(huán)氧化酶(COX)進(jìn)而抑制前列腺素合成，緩解因前列腺素聚集引起的炎癥反應(yīng)、發(fā)熱和疼痛。用于減輕中度疼痛，如關(guān)節(jié)痛、神經(jīng)痛、肌肉疼、偏頭疼、頭痛、牙痛，也可減輕普通感冒或流行性感冒引起的發(fā)熱[1-2]。既往研究多采用HPLC方法檢測體內(nèi)藥物濃度，重復(fù)性好，但靈敏度低。本試驗(yàn)采用靈敏度較高的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)法測定血漿中布洛芬的藥物濃度。

1 材料

1.1 儀器 G6410A QQQ LC-MS/MS聯(lián)用儀(美國Aglient公司)，ESI離子源，數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)：Aglient MassHunter Quantitative Analysis軟件。XW-80A微型旋渦混合儀(上海滬西分析儀器廠)，XS105分析天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)，SIGMA 3-18K低溫冷凍離心機(jī)(德國SIGMA公司)。

1.2 試藥 布洛芬標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(純度：99.5%，中國食品藥品檢定研究院提供，批號：100179-201406)；吲哚美辛標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(純度：99.9%，購自中國食品藥品檢定研究院，批號：100258-200904)；甲醇、醋酸銨均為色譜純，冰醋酸為分析純，空白血漿由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院提供。

2 方法

2.1 研究對象 臨床試驗(yàn)方案經(jīng)倫理委員會討論通過后，試驗(yàn)入選23例健康男性受試者，年齡18～40歲，體重不低于50 kg，且體重指數(shù)(BMI)為19～24 kg/m2，健康情況良好，對藥物無過敏史，對布洛芬及輔料中任何成分不過敏[3]。實(shí)驗(yàn)前簽署知情同意書和協(xié)議書。

2.2 給藥方案 采用隨機(jī)、開放、單劑量、雙周期自身交叉試驗(yàn)設(shè)計(jì)。受試者禁食過夜至少10 h后，于試驗(yàn)第1天早晨空腹以250 mL溫開水沖服受試制劑布洛芬顆粒1袋或參比制劑布洛芬混懸液10 mL。第1周期服藥后的1周為清洗期，清洗期后交叉服藥。第2周期的服藥劑量及方法與第1周期一致。

2.3 血樣采集與處理 分別于試驗(yàn)第1天服藥前(0 h)及服藥后0.25、0.50、0.75、1.00、1.50、2.00、3.00、4.00、6.00、8.00、10.00、12.00、16.00、24.00 h采集靜脈血，總計(jì)15個(gè)采血點(diǎn)(每個(gè)點(diǎn)采血5 mL)。置預(yù)先標(biāo)記好的肝素化試管中，3 000 r/min離心10 min，并于2 h內(nèi)置超低溫冰箱(≤ -70 ℃)中冷凍保存。

2.4 血漿樣品分析方法的建立

2.4.1 血漿樣品處理 精密量取血漿樣品100 μL于1.5 mL空白離心管中，精密加入10 μL內(nèi)標(biāo)(吲哚美辛)溶液，渦旋混勻30 s，加入300 μL甲醇，渦旋混勻2 min，離心10 min (14 000 r/min)，取上清液10 μL進(jìn)樣分析。

2.4.2 色譜條件 采用Aglient Poroshell 120 SB-C18(4.6 mm×75 mm，2.7 μm)色譜柱；流動相：10 mmol/L醋酸銨(含0.1%冰醋酸)-甲醇(24∶76)；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：10 μL；流速：0.6 mL/min。

2.4.3 質(zhì)譜條件 ESI離子源；負(fù)離子模式檢測；掃描方式為選擇反應(yīng)監(jiān)測(MRM)；Gas流速9 L/min，Gas溫度350 ℃，Nebulizer 40 psi，Capillary 4 000 V；用于定量的離子分別為布洛芬m/z205.1 →m/z161.0，F(xiàn)ragmentor 110，Collision Energy 0 V；內(nèi)標(biāo)吲哚美辛m/z356.1 →m/z312.1，F(xiàn)ragmentor 120，Collision Energy 1 V；掃描時(shí)間為200 ms[4-5]。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)溶液與內(nèi)標(biāo)系列標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

2.5.1 標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的配制 精密稱取布洛芬標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)34.57 mg，置25 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，制成1.376 mg/mL的布洛芬儲備液；用甲醇稀釋儲備液，制成濃度為1.101、5.504、11.01、22.02、88.06、110.1、275.2 μg/mL的布洛芬標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。

2.5.2 內(nèi)標(biāo)溶液的配制 精密稱取吲哚美辛標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)13.27 mg，置于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，得濃度為1.326 mg/mL吲哚美辛儲備液，再用甲醇稀釋至26.52 μg/mL作為內(nèi)標(biāo)工作溶液。

2.6 分析方法的確證

2.6.1 方法的選擇性 精密量取6份不同來源的空白血漿各100 μL，按“血漿樣品處理方法”進(jìn)行操作(不加內(nèi)標(biāo))，得色譜圖1A；取220.2 μg/mL的布洛芬標(biāo)準(zhǔn)溶液10 μL，N2下吹干，加入100 μL空白血漿，按“2.4.1”項(xiàng)下方法進(jìn)行操作，得色譜圖1B；取1號受試者口服受試制劑1 h后收集的血漿樣品，按“血漿樣品處理方法” 進(jìn)行操作，得色譜圖1C。結(jié)果顯示，布洛芬的保留時(shí)間為3.6 min左右，內(nèi)標(biāo)吲哚美辛的保留時(shí)間為2.8 min左右，表明血漿中內(nèi)源性物質(zhì)不干擾布洛芬和內(nèi)標(biāo)的測定。

圖1 專屬性色譜圖 注：1.布洛芬，2.吲哚美辛；A.空白血漿色譜圖，B.空白血漿加 入布洛芬和吲哚美辛的色譜圖，C.1號健康受試者口服受試制劑 1 h后血漿樣品色譜圖

2.6.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備和定量下限 分別精密量取布洛芬系列標(biāo)準(zhǔn)溶液10 μL于1.5 mL空白離心管中，N2下吹干，加入100 μL空白血漿，渦旋混勻，配制成布洛芬濃度分別為0.110 1、0.550 4、1.101、2.202、8.806、11.01、27.52 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)含藥血漿，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行LC-MS/MS分析。計(jì)算布洛芬的峰面積As和內(nèi)標(biāo)峰面積Ai的比值f(f=As/Ai)，以待測物和內(nèi)標(biāo)濃度比為橫坐標(biāo)，以f值為縱坐標(biāo)，用加權(quán)(權(quán)重系數(shù)：1/x2)最小二乘法進(jìn)行線性回歸運(yùn)算，得回歸方程線性范圍為0.110 1～27.520 0 μg/mL，定量下限為0.110 1 μg/mL (S/N>10)。

2.6.3 方法精密度試驗(yàn) 分別精密量取不同濃度的布洛芬質(zhì)控溶液，配制成布洛芬血漿低、中、高濃度分別為0.220 2、5.504、22.02 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)含藥血漿，每個(gè)濃度各配制6份樣品，按“血漿樣品處理方法”進(jìn)行操作。每天1批，連續(xù)3 d，共3批，計(jì)算批內(nèi)和批間精密度。結(jié)果表明，低、中、高3個(gè)濃度(0.220 2、5.504、22.02 μg/mL)批內(nèi)和批間質(zhì)控樣品的RSD均<15%，精密度和準(zhǔn)確度結(jié)果均符合要求。

2.6.4 方法回收率試驗(yàn) 分別精密量取不同濃度的布洛芬溶液各10 μL于1.5 mL空白離心管中，N2下吹干，加入100 μL空白血漿(3份不同來源的)，配制成布洛芬血漿低、中、高3個(gè)濃度分別為0.220 2、5.504、22.02 μg/mL的血漿樣品各3份，再按“血漿樣品處理方法”進(jìn)行操作，10 μL進(jìn)樣分析；另取不同濃度的布洛芬溶液和內(nèi)標(biāo)溶液各10 μL于1.5 mL空白離心管中，N2下吹干，加入100 μL水，再加入300 μL甲醇，渦旋混勻，配制成低、中、高3個(gè)濃度分別為0.220 2、5.504、22.02 μg/mL，10 μL進(jìn)樣，每個(gè)濃度進(jìn)行3個(gè)樣本分析。結(jié)果表明，布洛芬的低、中、高3個(gè)濃度的提取回收率為88.56%～96.57%。

2.6.5 穩(wěn)定性考察 分別精密量取布洛芬低、高質(zhì)控溶液各10 μL于1.5 mL空白離心管中，N2下吹干，加入100 μL空白血漿，渦旋混勻，配制成布洛芬血藥低、高2個(gè)濃度分別為0.220 2和22.02 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)含藥血漿，制備5份(每份各濃度分別為3個(gè)樣本)。其中一份于-70 ℃冰箱冷凍，待血漿融化后6 h，考察血漿樣品的血漿融化后6 h穩(wěn)定性；另一份血漿樣品處理液在自動進(jìn)樣器中放置12 h后進(jìn)樣分析，考察血漿樣品處理液在自動進(jìn)樣器中放置穩(wěn)定性；另取其中2份血漿樣品處理液，分別在室溫下放置7 h和24 h后進(jìn)樣分析，考察血漿樣品處理液在室溫下放置穩(wěn)定性；另一份血漿樣品經(jīng)歷3次冷凍-解凍循環(huán)后，考察血漿樣品凍融3次的穩(wěn)定性；另取出冰箱中冷凍保存45 d的布洛芬長期冷凍血漿樣品(血藥濃度分別為0.219 6、21.97 μg/mL)，考察血漿樣品的長期冷凍穩(wěn)定性。

結(jié)果表明，血漿樣品室溫放置6 h穩(wěn)定，血漿樣品處理液在自動進(jìn)樣器中放置12 h穩(wěn)定，血漿樣品處理液室溫放置24 h穩(wěn)定，血漿樣品經(jīng)過3次反復(fù)凍融穩(wěn)定，血漿樣品-70 ℃放置45 d穩(wěn)定，以上穩(wěn)定性考察數(shù)據(jù)，其RSD均<15 %。

3 結(jié)果

3.1 血藥濃度-時(shí)間曲線 1號健康受試者單次口服受試制劑布洛芬顆粒0.2 g及參比制劑布洛芬混懸液(美林)0.2 g后，觀察布洛芬血藥濃度隨時(shí)間的變化情況。布洛芬血藥濃度-時(shí)間曲線見圖2。

3.2 藥代動力學(xué)參數(shù) 23例健康受試者分別口服受試制劑布洛芬顆粒0.2 g，布洛芬藥代動力學(xué)參數(shù)見表1。

圖2 布洛芬顆粒單次給藥血漿中布洛芬的濃度-時(shí)間曲線 注：T.受試制劑布洛芬顆粒，R.參比制劑布洛芬混懸劑

表1 23例受試者口服受試制劑布洛芬顆粒0.2 g后布洛芬的藥代動力學(xué)參數(shù)(T)匯總

4 討論

以往研究中多采用HPLC方法檢測體內(nèi)藥物濃度，不僅靈敏度較低，而且樣品處理復(fù)雜，方法較為繁瑣。本文建立LC-MS/MS聯(lián)用法測定血漿中布洛芬濃度，可提高其靈敏度，方法簡便快捷，適用于血漿樣品中布洛芬的含量測定。

流動相的選擇：本實(shí)驗(yàn)曾采用甲醇-水、甲醇-磷酸二氫鉀(含磷酸)和乙腈-乙酸鈉(含乙酸)，均因?yàn)榉蛛x度不好而未選擇，另外，由于血漿具有一定的pH值，對布洛芬的響應(yīng)有一定影響，最終采用醋酸銨(含0.1%冰醋酸)-甲醇系統(tǒng)為最佳流動相，在該條件下，指標(biāo)性成分和內(nèi)標(biāo)峰與內(nèi)源性雜質(zhì)峰均得到良好分離，且藥物峰形好，靈敏度高，能達(dá)到血漿樣品測定的要求。

實(shí)驗(yàn)過程中進(jìn)行負(fù)離子檢測時(shí)，[M-H]-和[M-Cl]-峰同時(shí)存在，后經(jīng)過方法學(xué)考察發(fā)現(xiàn)[M-H]-峰不穩(wěn)定，故選擇[M-Cl]-峰作為定量離子。

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Study on the human bioequivalence of ibuprofen granules by LC-MS/MS

DONG Xiao-qian,WU Yi,ZHANG Shi-liang,YANG Rui,TANG Si,XIA Su-xia*

(Academy of Traditional Chinese Medicine of Liaoning Province,Shenyang 110034,China)

Objective To study the pharmacokinetics and bioavailability of ibuprofen granules in healthy volunteers in order to compare its bioequivalence with ibuprofen suspension.Methods Totally 23 healthy male volunteers were tested by random,open,single dose and double cycle self crossover design.The drug concentrations of plasma were determined by liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) method after oral administration of ibuprofen granules (test preparation) and ibuprofen suspension (reference preparation).Results The Cmaxof test preparation and reference preparation was (17.438 6±5.304 0) and (18.557 7±4.641 7) mg/L respectively;AUC0-24was (59.000 3±13.935 3) and (58.506 4±16.720 2) mg/(h·L);AUC0-∞was (59.718 0±14.020 0) and (59.227 8±16.815 8) mg/(h·L);Tmaxwas (1.478 3±0.922 9) and (1.021 7±0.822 0) h.Conclusion The oral administration of ibuprofen granules has biological equivalence for the test preparation and reference preparation.

Ibuprofen;Blood drug concentration;LC-MS/MS;Bioavailability;Pharmacokinetics

2016-09-06

遼寧省中醫(yī)藥研究院，沈陽 110034

*通信作者

10.14053/j.cnki.ppcr.201704020