ABO血型基因變異體引起正反定型不合1例

趙領(lǐng)軍

ABO血型基因變異體引起正反定型不合1例

趙領(lǐng)軍

目的 采用分子生物學(xué)技術(shù)分析ABO血型鑒定正反定型不合1例，為保障患者的輸血安全提供依據(jù)。方法ABO血型血清學(xué)鑒定采用微柱凝膠法。提取全血DNA，用序列特異性引物聚合酶鏈反應(yīng)（PCR-SSP）進(jìn)行ABO基因分型；用PCR法擴(kuò)增ABO基因1～7號外顯子進(jìn)行直接測序，測序結(jié)果與A101序列進(jìn)行比較。結(jié)果 患者血型表現(xiàn)為正反定型不符，正向鑒定為O型，反向鑒定僅發(fā)現(xiàn)有抗-B凝集素，結(jié)果為A型?；颊呒t細(xì)胞和抗-AB單克隆抗體有微弱的凝集。ABO PCRSSP基因分型表明患者為雜合O1/A基因型，進(jìn)一步對外顯子擴(kuò)增測序發(fā)現(xiàn)ABO第6外顯子存在248A＞G誤義突變，導(dǎo)致糖基轉(zhuǎn)移酶83位天冬氨酸被甘氨酸替代（Asp83Gly）。用自行設(shè)計(jì)的引物采用PCR-SSP法對350例獻(xiàn)血者進(jìn)行248A＞G突變頻率調(diào)查，未發(fā)現(xiàn)陽性。結(jié)論 ABO基因248A＞G變異體和缺乏抗-A 凝集素以及A抗原極低水平表達(dá)相關(guān)。

ABO血型 基因分型 序列特異性引物聚合酶鏈反應(yīng) DNA測序 基因變異體

【Key words】 ABO blood group Genotyping PCR-SSP DNA sequencing Gene variant

ABO血型的正確鑒定對于臨床安全輸血具有極其重要的意義，錯(cuò)誤的血型鑒定可導(dǎo)致受血者發(fā)生溶血性輸血反應(yīng)，嚴(yán)重者可能危及生命。研究表明，ABO血型基因型和表型直接相關(guān)[1，2]，多數(shù)基因變異體表現(xiàn)為一個(gè)或多個(gè)單核苷酸突變，導(dǎo)致編碼的氨基酸改變或提前引入終止密碼子。這些基因水平的改變分布在ABO基因的整個(gè)編碼區(qū)，可導(dǎo)致A抗原或B抗原的表達(dá)減弱，甚至完全沒有表達(dá)。血型抗原表達(dá)的差異會(huì)導(dǎo)致臨床血型鑒定正反定型不符，干擾血型鑒定，從而影響臨床輸血安全?，F(xiàn)對1例血型正反向鑒定不符病例進(jìn)行ABO基因型分析，報(bào)告如下。

對象與方法

1 研究對象 患者，58歲，女性，因外周動(dòng)脈阻塞性疾病來本院治療。對其血型鑒定時(shí)發(fā)現(xiàn)正反向定型不符，正向鑒定為O型，反向鑒定為A型?；颊邿o大量輸血史和血液干細(xì)胞移植記錄，對其ABO基因型進(jìn)行了分析。

2 方法

2.1 標(biāo)本采集：采集患者靜脈血標(biāo)本，EDTA抗凝，用于血型鑒定和抽提基因組DNA。

2.2 血型血清學(xué)實(shí)驗(yàn)：應(yīng)用微柱凝膠法進(jìn)行ABO血型鑒定，實(shí)驗(yàn)方法參照文獻(xiàn)[3]。

2.3 試劑和儀器：血型鑒定抗體和人ABO血型反向定型應(yīng)用上海血液生物醫(yī)藥有限責(zé)任公司產(chǎn)紅細(xì)胞試劑盒?？焖俪樘嵫夯蚪M試劑盒為上海生工生物有限公司產(chǎn)品。引物序列設(shè)計(jì)參照文獻(xiàn)[4]，由華大基因公司合成（表1）。聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增試劑為C-TaKaRa （大連寶生物）公司產(chǎn)品。應(yīng)用Bio-rad C1000 Thermal Cycle PCR擴(kuò)增儀。ABO PCR-SSP基因分型試劑盒（Inno-Train）購自阿爾沃科技有限公司。

2.4 DNA提取和ABO基因分型：從患者全血中提取基因組DNA及ABO PCR–SSP基因分型，實(shí)驗(yàn)操作均按照試劑盒說明書進(jìn)行。擴(kuò)增ABO 1～7號外顯子、內(nèi)含子區(qū)序列，總反應(yīng)體系為25 μl，其中Taq High Fidelity DNA 聚合酶（5 U/μl） 0.2 μl，10×reaction buffer 2.5 μl，dNTP mix （10 mmol/μl） 2 μl，上下游引物（10 mmol/μl）各1 μl，DNA模板 1 μl以及ddH2O 17.3 μl。擴(kuò)增條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 變性30 s，62℃退火30 s，72 ℃延伸 45 s，35個(gè)循環(huán)； 72 ℃ 5 min。反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)2.0% 瓊脂糖凝膠電泳分析，溴乙錠染色照相。純化的PCR反應(yīng)產(chǎn)物由華大基因公司測序，測序結(jié)果與血型基因變異位點(diǎn)數(shù)據(jù)庫（Blood Group Antigen Gene Mutation Database）[5]比對，以A101為標(biāo)準(zhǔn)序列判斷其血型基因型。

表1 PCR擴(kuò)增引物序列

結(jié) 果

1 血型血清學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果 患者紅細(xì)胞在常規(guī)微柱凝膠法正向血型抗原鑒定中，A抗原和B抗原均為陰性，血型鑒定為O型（圖1A）。但反向血型鑒定中，患者血清只與B診斷紅細(xì)胞凝集呈強(qiáng)陽性（抗-B凝集素），不凝集A1、A2和O診斷紅細(xì)胞，血型鑒定為A型（圖1B）。進(jìn)一步用單克隆血型抗體對其紅細(xì)胞進(jìn)行抗原鑒定，觀察到患者紅細(xì)胞只和抗-AB單克隆抗體有微弱的凝集（圖1C）。該患者缺失抗-A凝集素，且有極低水平的A抗原表達(dá)，提示有ABO等位基因變異。

2 ABO血型基因分型結(jié)果 應(yīng)用PCR-SSP試劑盒對患者進(jìn)行ABO基因分型，可觀察到患者表現(xiàn)為雜合O1/A基因型[4]（圖2）。此外，發(fā)現(xiàn)O1和nonO1等位基因特異引物PCR擴(kuò)增產(chǎn)物量之間有明顯差別，nonO1電泳帶（泳道1）的亮度顯著低于O1（泳道2），提示可能有A等位基因變異體的存在。然而，用PCR-SSP法分析了幾種常見的ABO等位基因變異體，結(jié)果均為陰性。

圖1 微柱凝膠法ABO血型鑒定結(jié)果

圖2 ABO PCR-SSP基因分型結(jié)果

為確定患者的ABO基因序列變異，本研究采用PCR法對ABO基因外顯子進(jìn)行擴(kuò)增和測序，并將結(jié)果和A101標(biāo)準(zhǔn)序列比對。序列分析顯示患者ABO基因第6外顯子存在雜合261delG（O1等位基因），進(jìn)一步證實(shí)為雜合O1/A（圖3）；此外還發(fā)現(xiàn)第6外顯子存在一個(gè)新的248A＞G突變，且該突變有雜合現(xiàn)象（圖3）。248A＞G突變在序列上靠近261G，位于特異引物結(jié)合靶位區(qū)內(nèi)，因此可影響引物結(jié)合DNA模板。上述PCR-SSP分析后觀察到nonO1特異引物產(chǎn)物顯著低于O1特異引物，說明該突變會(huì)影響261G特異引物和模板結(jié)合（A/G mismatch），但是不影響261delG特異引物與模板結(jié)合。據(jù)此，248A＞G突變應(yīng)和O1等位基因的261delG呈反式構(gòu)型（in trans），而和nonO1等位基因的261G呈順式構(gòu)型（cis）。進(jìn)一步推測248A＞G突變位于A等位基因上，導(dǎo)致其編碼的糖基轉(zhuǎn)移酶83位天冬氨酸被甘氨酸替代（Asp83Gly）。

為研究ABO基因第6外顯子248A＞G基因變異體在人群中的頻率，隨機(jī)選擇了邢臺市350名獻(xiàn)血者，自行設(shè)計(jì)引物（表1）進(jìn)行ABO PCR-SSP分析，但是未發(fā)現(xiàn)一例陽性（圖4）。

討 論

人類ABO血型基因定位于第9號染色體，由7個(gè)外顯子組成。其中第6號和第7號外顯子編碼糖基轉(zhuǎn)移酶的主要部分，包括催化區(qū)域，因而直接影響A抗原和B抗原的表達(dá)[6]。以往研究表明正反向血型鑒定不合往往提示有ABO等位基因變異，常導(dǎo)致發(fā)現(xiàn)新的基因變異體[7，8]。在本例患者血型鑒定中我們發(fā)現(xiàn)正反向定型不合，正向結(jié)果為O型，但在反向鑒定中僅發(fā)現(xiàn)抗-B凝集素，結(jié)果為A型；進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)其紅細(xì)胞和單克隆抗-AB抗體有微弱的凝集，表明有極低水平的A抗原表達(dá)。因此，進(jìn)一步分析ABO基因型。

圖3 患者ABO基因第6外顯子序列分析

圖4 PCR-SSP分析248A＞G突變

分析結(jié)果表明，該患者ABO基因呈現(xiàn)出雜合O1/A基因型，且存在雜合的第6外顯子248A＞G突變，該突變和261G（non O1等位基因）呈順式（cis）構(gòu)型，和261delG（O1等位基因）呈反式（in trans）構(gòu)型。我們推測248A＞G突變導(dǎo)致糖基轉(zhuǎn)移酶的第6外顯子編碼的83位天冬氨酸被甘氨酸替代（Asp83Gly）。由于這兩個(gè)氨基酸性質(zhì)差別極大，因此這個(gè)改變會(huì)對糖基轉(zhuǎn)移酶活性產(chǎn)生重要影響。Yu等[9]曾報(bào)道在國人B3表型個(gè)體中，發(fā)現(xiàn)存在247G＞T突變，導(dǎo)致同一位點(diǎn)83位天冬氨酸被酪氨酸替代（Asp83Tyr）。許先國等[10]報(bào)道的Bw12表型中存在278C＞T突變，導(dǎo)致93位脯氨酸被亮氨酸替代（Pro93Leu）。根據(jù)這些結(jié)果，我們推斷糖基轉(zhuǎn)移酶的83～93位氨基酸對于酶的正常活性至關(guān)重要，這些位置的氨基酸替代可以減弱A抗原或B抗原的表達(dá)，或者導(dǎo)致完全不表達(dá)。

我們的調(diào)查表明新發(fā)現(xiàn)的248A＞G突變在人群中的頻率極低，然而明確該患者的ABO基因型對于輸血和血型診斷有重要意義。盡管沒有抗-A抗體，但因?yàn)椴荒芡耆懦鼳抗原免疫，對于攜帶有248A＞G基因變異體的患者，建議輸入O型成分紅細(xì)胞。另一方面，攜帶有該基因變異體的獻(xiàn)血者應(yīng)該歸類于A型血，因?yàn)闅埓娴腁抗原可能會(huì)和受血者抗-A抗體結(jié)合，引起免疫反應(yīng)。綜上所述，鑒定ABO血型基因變異體可以促進(jìn)了解遺傳因素對血型的影響，對增進(jìn)輸血安全具有重要意義。

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A Case Report of Forward/Reverse Blood Grouping Discrepancy Resulting from ABO Gene Variant

ZHAO Lingjun.
Department of Clinical Laboratory，The Third Hospital of Xingtai City，Xingtai 054000

Objective To analyze a discrepancy in results of forward/reverse ABO blood grouping with molecular analysis and provide knowledge for safe blood transfusion. Methods Column gel testing was used for serological ABO blood grouping. Genomic DNA was extracted from whole blood and PCR-SSP was used for ABO genotyping. PCR was performed to amplify ABO exons 1 to 7 and the amplification products were sequenced directly. The obtained sequences were compared with wild type A101 to identify sequence variation. Results Blood grouping indicated the discrepant results of forward/reverse ABO typing. Forward typing produced blood group O，while reverse typing produced blood group A as only anti-B isoagglutinins were present. A monoclonal anti-AB antibody detection revealed a weak agglutination with patient's RBCs. ABO genotyping with PCR-SSP indicated a heterozygous O1/A type，and further PCR and ABO exons sequencing identified a new 248A＞G missense mutation in exon 6，which led to the replacement of Aspartate at position 83 with glycine. PCR-SSP using newly designed 248A＞G mutation-specific primer was performed to investigate the frequency of this new mutation among regular blood donors but none turned out to be positive. Conclusions This ABO gene 248A＞G mutation is associated with the absence of anti-A isoagglutinins and weak A antigen expression.

R457.1+1 R392.11

A

1671-2587（2017）02-0178-05

2016-12-22 ）

（本文編輯：王敏）

10.3969/j.issn.1671-2587.2017.02.025

054000 河北省邢臺市第三醫(yī)院檢驗(yàn)科

趙領(lǐng)軍（1964–），女，河北邢臺人，副主任檢驗(yàn)技師，學(xué)士，主要從事臨床輸血及相關(guān)研究，（Tel）0319-2206073（E-mail）hbyml@sina.com。