半乳糖酞菁光動(dòng)力治療結(jié)腸癌的實(shí)驗(yàn)研究

葛偉穎，趙占娟，洪閣，趙建喜

(1.河北大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，河北 保定 071002； 2.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 生物醫(yī)學(xué)工程研究所，天津 300192；3.河北大學(xué)附屬醫(yī)院 放射科，河北 保定 071002)

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半乳糖酞菁光動(dòng)力治療結(jié)腸癌的實(shí)驗(yàn)研究

葛偉穎1，趙占娟1，洪閣2，趙建喜3

(1.河北大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，河北 保定 071002； 2.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 生物醫(yī)學(xué)工程研究所，天津 300192；3.河北大學(xué)附屬醫(yī)院 放射科，河北 保定 071002)

為了探討新型光敏劑半乳糖酞菁(T1—T4)對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞CT-26增殖的影響及其相關(guān)機(jī)制，通過檢測(cè)T1—T4的水溶性，利用熒光分光光度計(jì)檢測(cè)T1—T4的濃度和孵育時(shí)間對(duì)CT-26細(xì)胞吸收量的影響.MTT(四甲基偶氮唑鹽)法檢測(cè)T1—T4對(duì)CT-26的細(xì)胞毒作用,利用MDC(單丹磺酰尸胺)染色法和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)腸癌細(xì)胞的自噬、凋亡和壞死情況.結(jié)果發(fā)現(xiàn)T1—T4的水溶性隨半乳糖取代基個(gè)數(shù)的增加而增強(qiáng)，對(duì)CT-26細(xì)胞的光動(dòng)力殺傷作用與其濃度呈正相關(guān)并且細(xì)胞CT-26對(duì)T1—T3的吸收量隨著孵育濃度的升高和孵育時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，對(duì)T4幾乎無吸收.T2可誘導(dǎo)CT-26細(xì)胞出現(xiàn)自噬、晚期凋亡和壞死，且有較明顯的劑量依賴性.通過以上數(shù)據(jù)了解到 CT-26對(duì)T1—T3的吸收隨藥物濃度和孵育時(shí)間的增加而升高,T2介導(dǎo)的光動(dòng)力療法對(duì)CT-26有明顯抑制作用，其機(jī)制可能與誘導(dǎo)細(xì)胞自噬有關(guān).

酞菁；光動(dòng)力療法；自噬；凋亡

結(jié)腸癌是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一.近年來,受飲食結(jié)構(gòu)和生活習(xí)慣的影響,中國(guó)結(jié)腸癌的發(fā)病率和死亡率呈明顯的上升趨勢(shì),引起了醫(yī)藥學(xué)家的廣泛關(guān)注[1].目前臨床上治療結(jié)腸癌的主要方法依然是傳統(tǒng)的手術(shù)、化療、放療等,但是這些治療手段均會(huì)對(duì)正常組織造成一定的損傷,甚至引起嚴(yán)重的并發(fā)癥,給患者的生活質(zhì)量造成不良影響,因此尋找新的結(jié)腸癌治療方法仍將是科學(xué)家們未來的一項(xiàng)長(zhǎng)期而艱巨的任務(wù)[2-3].

光動(dòng)力療法(photodynamic therapy,PDT)是通過激發(fā)光照射腫瘤組織內(nèi)聚集的光敏劑,使之在分子氧的參與下發(fā)生光化學(xué)反應(yīng),生成單態(tài)氧和自由基等ROS(reactive oxygen species)成分,通過氧化作用破壞腫瘤細(xì)胞,達(dá)到治療目的.PDT具有創(chuàng)傷小、副作用少、選擇性高、無耐藥性等特點(diǎn),自20世紀(jì)70年代進(jìn)入臨床研究以來,隨著其在技術(shù)上的日趨成熟已廣泛應(yīng)用于膀胱癌、胃癌、肺癌、食管癌、宮頸癌等惡性腫瘤的治療[4-5].光敏劑是光動(dòng)力治療中至關(guān)重要的因素.酞菁類光敏劑以其明確的化學(xué)組成、穩(wěn)定的理化性質(zhì)、適宜的長(zhǎng)波吸收和高效的光敏活性,成為腫瘤治療中頗具希望的新一代光敏劑.但是由于酞菁的母體骨架具有較強(qiáng)的疏水性,不利于光敏劑在體內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn),也給藥物制劑帶來了許多的困難.本實(shí)驗(yàn)室前期通過在單核酞菁外圍的苯環(huán)上引入半乳糖基團(tuán)增加酞菁的溶解性和靶向性[6],合成了4個(gè)半乳糖酞菁(T1—T4)光敏劑.Lv等[7]的研究表明半乳糖酞菁(T3/T4)不僅具有良好的水溶性,而且表現(xiàn)出一定的肝癌靶向性.李艷周等[8]初步研究了半乳糖酞菁(T1—T4)對(duì)人胃癌細(xì)胞HGC-27、人惡性黑色素瘤細(xì)胞A-375、人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549的光毒性和暗毒性,證明半乳糖酞菁介導(dǎo)的光動(dòng)力療法可以有效抑制多種腫瘤細(xì)胞的體外增殖,且暗毒性較小,但對(duì)其導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡的機(jī)制還不甚清楚.據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，光動(dòng)力療法引起細(xì)胞死亡的主要途徑為凋亡或壞死,以何種途徑主要取決于光敏劑的特性、光敏劑定位的細(xì)胞器、細(xì)胞系類型、細(xì)胞密度以及實(shí)驗(yàn)方法(包括光敏劑濃度、光劑量、培養(yǎng)時(shí)間)等因素[9-10].本文在以往研究的基礎(chǔ)上,采用小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞CT-26為模型,評(píng)價(jià)半乳糖酞菁(T1—T4)的光敏活性、細(xì)胞吸收量、吸收速度以及光動(dòng)力治療后腫瘤細(xì)胞的凋亡情況和自噬規(guī)律,探討4種光敏劑光動(dòng)力抗腫瘤活性產(chǎn)生的化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)及其作用機(jī)制.

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 細(xì)胞株

結(jié)腸癌細(xì)胞CT-26,由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程研究所提供.

1.2 主要試劑與儀器

光敏劑T1—T4,由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程研究所提供，體外實(shí)驗(yàn)時(shí)用DMSO均配制成104μmol/L的原液備用；RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)由Gibco公司提供；丙酮酸鈉溶液、PBS緩沖液為Solarbio公司產(chǎn)品；四甲基偶氮唑鹽(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)、聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)、100 g/L葡萄糖溶液均為Sigma公司產(chǎn)品；胰蛋白酶(Tripsin)為Hyclone 公司產(chǎn)品；凋亡流式細(xì)胞檢測(cè)試劑盒購(gòu)自碧云天公司;單丹磺酰尸胺(MDC)由Sigma公司提供.半導(dǎo)體激光器，美國(guó)Intense公司;流式細(xì)胞儀(Accuri C6)，美國(guó)BD公司.

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 對(duì)TI—T4光敏劑的脂水分布系數(shù)的測(cè)定[11-13]

通過分析光敏劑在薄層色譜上的比移值Rf與其在該系統(tǒng)的分配系數(shù)logP的關(guān)系來測(cè)定T1—T4的脂水分布系數(shù).利用反相C18熒光薄層板，以甲醇+水(體積比2∶1)為展開劑展開，測(cè)得Rf值，利用下面的公式計(jì)算logP值.參考化合物是水楊醛(logP=1.70).

(1)

(2)

Rf為斑點(diǎn)中心距原點(diǎn)的距離與溶劑展開前沿距原點(diǎn)距離的比值，K為常數(shù).

2.2 MTT法測(cè)定不同濃度光敏劑在光反應(yīng)和暗反應(yīng)時(shí)對(duì)結(jié)腸癌CT-26細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期結(jié)腸癌CT-26細(xì)胞,接種于96孔板中,2×104/孔,培養(yǎng)24 h使其貼壁,24 h后棄去培養(yǎng)基,分為空白對(duì)照組和給藥組(光反應(yīng)組和暗反應(yīng)組),給藥組分別加入濃度為20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.312、0.156、0.078、0.039、0.019 μmol/L的藥物培養(yǎng)液100 μL,每個(gè)濃度設(shè)置4個(gè)副孔,結(jié)果取平均值;空白對(duì)照組給予等體積的空白培養(yǎng)基,置于培養(yǎng)箱孵育24 h后,光照組給予 650 nm 的激光照射,功率0.2 W,照射強(qiáng)度6 J/cm2,照射時(shí)間20 min,繼續(xù)孵育 24 h,每孔加入質(zhì)量濃度為1 mg/mL的MTT 50 μL培養(yǎng)4 h后棄去上清液,每孔加入150 μL DMSO溶解15 min終止反應(yīng),酶標(biāo)儀上檢測(cè)各孔在490 nm波長(zhǎng)處的OD值,用以下公式計(jì)算細(xì)胞存活率:

細(xì)胞存活率=給藥組OD值/對(duì)照組OD值×100%.

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

用PBS緩沖液稀釋光敏劑,使化合物T1—T4溶液的終濃度依次為0.32、0.63、1.25、2.5、5、10、20 μmol/L,每個(gè)濃度吸取200 μL加入96孔板,設(shè)4個(gè)副孔,用酶標(biāo)儀在激發(fā)波長(zhǎng)640 nm、發(fā)射波長(zhǎng)690 nm條件下檢測(cè)各孔的OD值.將光敏劑的OD值與濃度關(guān)系制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,并做相關(guān)回歸分析.

2.4 結(jié)腸癌細(xì)胞對(duì)半乳糖酞菁T1—T4吸收量的測(cè)定

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期CT-26細(xì)胞用胰酶消化,懸浮于完全培養(yǎng)基中,制成單細(xì)胞懸液,接種于96孔板中,2×104/孔,孵育24 h使其完全貼壁后,傾去培養(yǎng)基,給藥組分別加入濃度為1.25、2.5、5、10、20 μmol/L的T1—T4,每個(gè)濃度4個(gè)副孔,繼續(xù)孵育24 h,PBS沖洗2次,每孔加入100 μL Triton X-100(體積分?jǐn)?shù)為0.25%)裂解細(xì)胞10 min，酶標(biāo)儀檢測(cè)每孔OD值,并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出每孔的藥物含量，以μmol/L表示.

2.5 結(jié)腸癌細(xì)胞對(duì)T1—T4吞噬速度的測(cè)定

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期CT-26細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液,接種于96孔板中,2×104/孔，給藥濃度T1—T4均為20 μmol/L.孵育時(shí)間分別為2、4、8、12、16、20、24 h,PBS沖洗2遍,加入100 μL Triton X-100(體積分?jǐn)?shù)為0.25%)裂解細(xì)胞10 min.上機(jī)檢測(cè)每孔的OD值,并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出每孔的藥物含量，以μmol/L表示.

2.6MDC染色法檢測(cè)半乳糖酞菁光動(dòng)力誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞CT-26自噬

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期CT-26細(xì)胞,鋪于六孔板中,105/孔，孵育24h使其貼壁,棄去培養(yǎng)基,加入2mL不含血清的化合物T2溶液,濃度依次為0.625、1.25、2.5μmol/L,孵育24h，以650nm的激光照射,功率0.2W,照射強(qiáng)度6J/cm2,照射時(shí)間20min.空白對(duì)照組避光培養(yǎng)6h后,棄去培養(yǎng)基,加入PBS洗2遍,加入濃度為50μmol/L的MDC溶液,37 ℃孵育60min,加入PBS清洗2遍,倒置熒光顯微鏡下觀察并拍攝,酸性自噬泡呈藍(lán)綠色亮點(diǎn).

2.7 流式細(xì)胞儀檢測(cè)半乳糖酞菁光動(dòng)力療法對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡的影響

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期CT-26細(xì)胞,鋪于六孔板中,5×105/孔，孵育24h使其貼壁,分為空白對(duì)照組和光動(dòng)力治療組.空白對(duì)照組加入不含血清的培養(yǎng)基,光動(dòng)力治療組加入不含血清的化合物T2溶液,濃度依次為0.625、1.25、2.5μmol/L,孵育24h后以650nm的激光照射,功率0.2W,照射強(qiáng)度6J/cm2,照射時(shí)間20min,空白對(duì)照組避光;繼續(xù)孵育6h,收集細(xì)胞,加入5μLAnnexinV-FITC和10μLPropidiumIodide,室溫、避光條件下孵育15min后,上機(jī)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率.

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS16.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,結(jié)果以(均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)表示,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 光敏劑T1—T4的脂水分布系數(shù)

如圖1所示，T1的logP最大，T4的logP最小，logP值越大越易溶于脂，相反越易溶于水.

圖1 T1—T4的脂水分布系數(shù)Fig.1 Octanol-water partition coefficient of T1—T4

3.2 光敏劑T1—T4對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞CT-26的抑制作用

實(shí)驗(yàn)研究了在有光照和無光照的條件下半乳糖酞菁的濃度變化對(duì)CT-26細(xì)胞存活率的影響.經(jīng)PDT處理后通過光學(xué)顯微鏡觀察到CT-26細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生明顯改變,細(xì)胞的生長(zhǎng)明顯受到抑制,細(xì)胞出現(xiàn)皺縮,折光性下降.嚴(yán)重的可觀察到細(xì)胞完全壞死、裂解.T1—T4對(duì)細(xì)胞的抑制作用如圖2a所示，在無光照的條件下CT-26細(xì)胞的存活率與光照條件下的細(xì)胞存活率有很大差異.在無光照條件下,T1—T4在最大濃度時(shí)的細(xì)胞存活率分別為(47±0.25)%、(67±5.57)%、(91.8±1.16)%、(92.33±4.33)%,可以看出T1、T2對(duì)細(xì)胞有一定的暗毒性，并且隨著濃度的增加暗毒性增大;如圖2b所示,在有光照的條件下,其細(xì)胞毒性更加明顯,在給藥濃度為10 μmol/L時(shí)細(xì)胞存活率T1—T4分別為(7.95±0.24)%、(9.09±0.47)%、(11.85±2.25)%、(89.15±5.15)%,由此看出在同一濃度下,T1的細(xì)胞毒性最強(qiáng),T2、T3、T4依次減弱,T4幾乎無細(xì)胞毒性.T1、T2、T3的細(xì)胞毒性隨著濃度的增加而逐漸增大.

a.無光照；b.有光照，照射強(qiáng)度6 J/cm2.圖2 T1—T4對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞CT-26的暗毒性和光毒性Fig.2 Phototoxicity and dark toxicity of T1—T4 for colon cancer cells CT-26

圖3 T1—T4的藥物吸收量標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 Standard curve of drug uptake of T1—T4

3.3 半乳糖酞菁T1—T4的標(biāo)準(zhǔn)吸收曲線

首先繪制出化合物的標(biāo)準(zhǔn)吸收曲線(圖3)，由圖3可看出,光敏劑的熒光強(qiáng)度與濃度呈線性關(guān)系且R2值均大于0.99,可用于光敏劑細(xì)胞吸收量和吸收速度的測(cè)定.

3.4 光敏劑T1—T4的濃度和孵育時(shí)間與細(xì)胞吸收量的關(guān)系

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得出光敏劑的孵育濃度-細(xì)胞吸收含量關(guān)系曲線,如圖4a所示.在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi),結(jié)腸癌細(xì)胞對(duì)T1、T2、T3的吸收隨著濃度的上升而增加,基本成線性關(guān)系,且未出現(xiàn)飽和現(xiàn)象,而對(duì)T4的吸收不明顯.在同一濃度下,CT-26對(duì)光敏劑的吸收量為T1最高,T2、T3次之,T4最低.

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出每個(gè)時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞的吸收量，繪制出時(shí)間-細(xì)胞吸收量關(guān)系曲線,如圖4b所示.在同一濃度下,每個(gè)時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞對(duì)4個(gè)光敏劑的吸收量為T1>T2>T3>T4,說明細(xì)胞對(duì)T1的吸收速率最快,T2、T3、T4次之;T1、T2、T3的吸收規(guī)律均為先快后慢,前期吸收速率較快,隨后進(jìn)入緩慢吸收期,T4基本無吸收.

圖4 CT-26對(duì)T1—T4的吸收量(a)和吸收速度(b)Fig.4 Absorption of compounds T1—T4 taken up by CT-26 as a factor of(a)concentration and(b)time

3.5 MDC染色法檢測(cè)半乳糖酞菁光動(dòng)力誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞CT-26自噬

如圖5所示,空白對(duì)照組的MDC染色熒光強(qiáng)度很弱,而光動(dòng)力治療組MDC染色熒光強(qiáng)度及點(diǎn)狀結(jié)構(gòu)均較空白對(duì)照組明顯增多,并且隨著光動(dòng)力治療給藥劑量的增加,熒光強(qiáng)度越明顯出現(xiàn)的點(diǎn)狀結(jié)構(gòu)越多.

a.空白對(duì)照組；b.0.625 μmol/L處理組；c.1.25 μmol/L處理組；d.2.5 μmol/L處理組.圖5 MDC熒光染色檢測(cè)不同濃度T2-PDT后CT-26細(xì)胞內(nèi)自噬泡的分布情況Fig.5 Detection of autophagic vacuoles with different dose of T2-PDT treatment stained MDC

3.6 流式細(xì)胞儀檢測(cè)半乳糖酞菁光動(dòng)力療法對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡的影響

流式結(jié)果顯示(圖6),與空白對(duì)照組相比,光動(dòng)力治療后的結(jié)腸癌細(xì)胞死亡以晚期凋亡和壞死為主,早期凋亡的細(xì)胞較少，并且晚期凋亡和壞死率隨著給藥濃度的升高而逐漸增加,呈明顯的劑量依賴性.

a.空白對(duì)照組；b.0.625 μmol/L處理組；c.1.25 μmol/L處理組；d.2.5 μmol/L處理組.圖6 不同治療濃度T2-PDT對(duì)CT-26細(xì)胞凋亡的影響Fig.6 Apoptosis of CT-26 cells with different concentration of T2-PDT

4 討論

光動(dòng)力療法(PDT)是利用光敏劑與相應(yīng)波長(zhǎng)的激發(fā)光發(fā)生光化學(xué)反應(yīng)來實(shí)現(xiàn)其抗腫瘤作用的,由于光敏劑和腫瘤組織可特異性結(jié)合而激光照射亦可實(shí)現(xiàn)局部精準(zhǔn)照射,所以光動(dòng)力療法對(duì)腫瘤組織具有選擇性的殺傷作用,而對(duì)周圍正常組織影響甚小.除此之外,光動(dòng)力療法還具有適用范圍廣、可重復(fù)治療等優(yōu)點(diǎn).光敏劑是PDT治療的關(guān)鍵因素,實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用的光敏劑是由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程研究所設(shè)計(jì)合成的酞菁類光敏劑,酞菁屬于第2代光敏劑,具有結(jié)構(gòu)單一、光熱穩(wěn)定性好、吸收波長(zhǎng)正好在組織最佳透射范圍內(nèi)等優(yōu)點(diǎn).半乳糖酞菁是通過向單核無取代酞菁引入半乳糖基團(tuán),從而提高了酞菁的兩親性與靶向性.據(jù)報(bào)道,galectin-3在結(jié)腸癌細(xì)胞中高表達(dá),galectin-3屬于半乳糖凝集素(Gelectin)家族,可誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞分化和血管生長(zhǎng),能夠促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移,被認(rèn)為是一種潛在的腫瘤預(yù)警分子,并且galectin-3可特異性識(shí)別半乳糖殘基[14].因此,通過半乳糖對(duì)酞菁的修飾可提高光敏劑的溶解性、生物相容性及對(duì)結(jié)腸癌的主動(dòng)靶向治療效果.本研究結(jié)果顯示,結(jié)腸癌CT-26細(xì)胞對(duì)此類光敏劑的吸收呈濃度和時(shí)間依賴性.在相同孵育時(shí)間下,孵育濃度越高吸收量越大,且并未出現(xiàn)飽和現(xiàn)象;在同一孵育濃度時(shí),T1的吸收量最高,T2、T3、T4依次遞減,這可能與這幾種光敏劑的分子結(jié)構(gòu)有關(guān).通過檢測(cè)化合物的水溶性發(fā)現(xiàn)T1的logP最大,說明其脂溶性最強(qiáng),T4的logP最小,說明其水溶性最好.T4的細(xì)胞吸收量最少,主要原因可能是細(xì)胞膜為親脂膜,脂溶性強(qiáng)的化合物更易吸收，然而在4種光敏劑中，T4的水溶性最強(qiáng)，脂溶性最弱.另外，T1—T4的分子質(zhì)量逐漸增大,在進(jìn)入細(xì)胞時(shí)其阻力逐漸增大,因此T4不易被細(xì)胞吸收.通過吸收速度的結(jié)果也可以看出,T1可更迅速地進(jìn)入細(xì)胞內(nèi),并且在實(shí)驗(yàn)時(shí)間范圍內(nèi),其吸收速率均是先快后慢,T1后期的吸收速率為負(fù)值,可能與其產(chǎn)生細(xì)胞毒性引起細(xì)胞死亡有關(guān).MTT結(jié)果顯示,在有光照的條件下,T1的細(xì)胞殺傷力最強(qiáng),T2、T3、T4的細(xì)胞殺傷力依次減弱,與細(xì)胞吸收量結(jié)果相對(duì)應(yīng).在相同時(shí)間內(nèi),進(jìn)入細(xì)胞的光敏劑越多,其光動(dòng)力治療效果越明顯.對(duì)于光動(dòng)力療法引起腫瘤細(xì)胞死亡的方式有多種:凋亡、壞死以及細(xì)胞自噬.在本文的研究體系中,這3種細(xì)胞死亡方式均有體現(xiàn).實(shí)驗(yàn)采用AnnexinV-FITC、PI雙染的方法,利用流式細(xì)胞儀分析了PDT后CT-26細(xì)胞的凋亡和壞死比例,正常細(xì)胞不會(huì)被FITC、PI著色,早期凋亡的細(xì)胞僅被FITC染色,而被雙染的細(xì)胞則是晚期凋亡和壞死的細(xì)胞,結(jié)果顯示半乳糖酞菁-PDT可同時(shí)誘導(dǎo)晚期凋亡和壞死,但是壞死的比例居多,且凋亡和壞死的比例均與給藥劑量呈正相關(guān),但是其壞死比例可能更敏感于光敏劑濃度.細(xì)胞自噬是廣泛存在于真核細(xì)胞內(nèi)的依賴溶酶體的降解途徑,生長(zhǎng)因子缺乏、氧自由基、DNA損傷等均可引起細(xì)胞自噬[16]；MDC是一種熒光染料,可用來跟蹤自噬泡,因此在倒置熒光顯微鏡下就可以根據(jù)熒光信號(hào)的強(qiáng)弱變化來判斷自噬的活化.本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,光敏劑半乳糖酞菁可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的自噬,且自噬水平與濃度呈正相關(guān).有研究報(bào)道,如果光敏劑定位于線粒體內(nèi),則PDT主要引起細(xì)胞發(fā)生凋亡;如果定位于溶酶體則主要發(fā)生細(xì)胞自噬[15].據(jù)此可推斷此類光敏劑可能定位于腫瘤細(xì)胞的溶酶體上,通過促進(jìn)細(xì)胞自噬來誘導(dǎo)細(xì)胞死亡.以上研究結(jié)果表明,半乳糖取代基提高了酞菁的水溶性和靶向性,其吸收規(guī)律與光敏劑濃度、取代基個(gè)數(shù)、脂溶性等因素有關(guān).根據(jù)MDC染色結(jié)果和流式結(jié)果可大膽推測(cè)半乳糖酞菁介導(dǎo)的光動(dòng)力治療以引起細(xì)胞的自噬、壞死為主,而且本課題組推測(cè)其殺傷細(xì)胞的機(jī)制是破壞細(xì)胞的溶酶體和線粒體,但以溶酶體破壞為主,當(dāng)然這還需要進(jìn)一步的研究和探討.

5 結(jié)論

半乳糖基增強(qiáng)了酞菁的水溶性,并且隨著糖基數(shù)目的增加其水溶性增加,親脂性下降.T1,T2,T3的PDT體外能明顯抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖,但T4的效果很弱,這可能與半糖基取代數(shù)目和化合物的光化學(xué)特性有關(guān).T2-PDT可誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞產(chǎn)生大量的自噬泡,通過自噬途徑誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡,并且通過流式檢測(cè)到T2-PDT也可引起細(xì)胞的壞死.因此，本課題組猜測(cè)半乳糖酞菁光動(dòng)力治療結(jié)腸癌的機(jī)制主要是引起細(xì)胞的自噬、壞死.

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(責(zé)任編輯：趙藏賞)

Experiment research of photodynamic therapy of colon cancer with a novel photosensitizer galactose substituted phthalocyanines

GE Weiying1,ZHAO Zhanjuan1,HONG Ge2,ZHAO Jianxi3

(1.College of Medicine,Hebei University,Baoding 071002,China；2.Institute of Biomedical Engineering,Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College,Tianjin 300192,China ；3.Department of Radiology，Affiliated Hospital of Hebei University,Baoding 071002,China)

To explore the effect and its related mechanism of new photosensitizers galactose substituted phthalocyanines(T1—T4)on the proliferation of colon cancer cell CT-26,consequently to provide experimental basis for the clinical photodynamic therapy of colon cancer,the water distribution coefficient of T1—T4 was detected to understand its water-soluble ability,the concentration and incubation time of T1—T4 were detected by fluorescence spectrophotometer to know their influence on CT-26 cell absorbing capacity,the cytotoxic effect of T1—T4 to CT-26 was detected by MTT the autophagy,apoptosis and necrosis of the colon cancer cells were detected through MDC staining and flow cytometry.It was found that the water-soluble ability of T1—T4 enhanced,with the number of galactose substituents increasing.The photodynamic damage effect of T1—T4 to CT-26 was positively correlated with their concentration.The absorptive amount of CT-26 to T1—T3 increased with the concentration of incubation and with the extension of incubation time,but it can hardly absorb T4.Autophagy,apoptosis and necrosis of CT-26 can be induced by T2,and there is obvious dose-dependent effect.Through the above data, colon cancer cell absorbs more T1—T3 when the incubation concentration and incubation time increase.T2 mediated photodynamic therapy can obviously inhibit CT-26.The mechanism may be due to cell autophagy.

phthalocyanine；photodynamic therapy；autophagy;apoptosis

10.3969/j.issn.1000-1565.2017.02.012

2016-09-25

河北大學(xué)醫(yī)學(xué)學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目(2015A2001);河北省研究生創(chuàng)新項(xiàng)目(S2016019);中西部高校綜合實(shí)力提升工程經(jīng)費(fèi)資助項(xiàng)目

葛偉穎(1991—),女,河北保定人,河北大學(xué)醫(yī)學(xué)部在讀碩士研究生.E-mail:837064531@qq.com

趙建喜(1966—),男,河北保定人,河北大學(xué)教授,主要從事影像診斷研究.E-mail:jianxizhaov@163.com 洪閣(1980—),男,天津人,中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程研究所助理研究員,博士,主要從事抗腫瘤藥物的研究.E-mail:hongge6688@aliyun.com

X835

A

1000-1565(2017)02-0180-07