透明質(zhì)酸接枝普魯蘭糖的制備與表征

楊文智，王樹根，劉嬌艷，賈蓓，李海鷹

(河北大學(xué) 藥學(xué)院，河北 保定 071002)

?

透明質(zhì)酸接枝普魯蘭糖的制備與表征

楊文智，王樹根，劉嬌艷，賈蓓，李海鷹

(河北大學(xué) 藥學(xué)院，河北 保定 071002)

采用化學(xué)交聯(lián)法，以1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(EDC)為脫水劑、4-二甲基氨基吡啶(DMAP)為催化劑，將透明質(zhì)酸(Hyaluronicacid，HA)接枝到普魯蘭(Pullulan，Pu)糖長鏈上，制備透明質(zhì)酸-普魯蘭糖(HA-Pu)新型材料．傅里葉變換紅外和氫核磁表征顯示，成功合成HA-Pu材料，并用1HNMR法確定HA-Pu的透明質(zhì)酸取代度．合成新材料凍干后可壓制獲得HA-Pu膜，掃描電鏡下觀察，HA-Pu膜為層狀結(jié)構(gòu)，具備很多微小孔洞．體外酶降解實(shí)驗(yàn)表明，新型HA-Pu膜較透明質(zhì)酸具有更好的抵抗酶降解性能．HA-Pu新材料合成有望拓展透明質(zhì)酸在醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用．

透明質(zhì)酸；普魯蘭糖；化學(xué)接枝；體外酶降解

透明質(zhì)酸(hyaluronic acid，HA)俗名玻尿酸，是一種線性陰離子多糖，由D-葡萄糖醛酸和N-乙酰氨基葡萄糖雙糖重復(fù)單元組成，1934年首次從牛眼中分離獲得．HA廣泛分布于動物和人體結(jié)締組織細(xì)胞外基質(zhì)中，在眼玻璃體、皮膚、軟骨和滑液中含量較高．HA具備良好的生物相容性，廣泛用于醫(yī)藥與化妝品行業(yè)[1-2]．普魯蘭多糖(pullulan，Pu)是出芽短梗霉菌分泌的次級代謝產(chǎn)物，由3個葡萄糖單元通過α-(1-4)和α-(1-6)糖苷鍵連接而成[3]．Pu具備良好生物安全性而廣泛應(yīng)用于食品及醫(yī)藥行業(yè)．近年，為了擴(kuò)展天然普魯蘭多糖在醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用，化學(xué)修飾普魯蘭糖成為熱點(diǎn)研究領(lǐng)域[4,5]．為解決HA易被體內(nèi)酶分解導(dǎo)致體內(nèi)存留時間短的問題[6,7]，專利[8]采用1,4-丁二醇二縮水甘油醚(BDDE)為交聯(lián)劑，化學(xué)接枝透明質(zhì)酸與普魯蘭糖，制備其用于皮下注射的顆粒劑，可延緩體內(nèi)降解時間．但BDDE交聯(lián)劑有毒，痕量殘留會導(dǎo)致機(jī)體毒性反應(yīng)，故嚴(yán)控產(chǎn)品BDDE殘留量尤為重要[9]．本研究針對BDDE交聯(lián)劑有毒的突出問題，嘗試催化透明質(zhì)酸與普魯蘭糖自身交聯(lián)反應(yīng)，避免引入第3種化學(xué)交聯(lián)劑，對HA進(jìn)行化學(xué)改性，希望制備具備較好生物安全性的HA-Pu接枝材料以減緩其在體內(nèi)的降解速度．

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器

FA2104N型電子天平(上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司)；FTIR-8400S傅里葉變換紅外光譜儀(日本，島津儀器有限公司)；AVANCEⅢ型600MHz核磁共振波普儀(美國，Bruker儀器公司)；UV-8500型紫外可見分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限公司)；TM3000型掃描電鏡儀(日本，日立儀器有限公司)；KQ-250B型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司，250W)；THZ-82型氣浴恒溫振蕩箱(金壇市醫(yī)療儀器廠)；HJ-6型磁力加熱攪拌器(金壇市城東鑫瑞儀器廠)．

1.2 試劑

透明質(zhì)酸(5 400u，山東福瑞達(dá)醫(yī)藥有限公司)；普魯蘭多糖(10ku，鄭州明鑫化工有限公司)；1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺、4-二甲基氨基吡啶(國藥集團(tuán)上海試劑有限公司)；葡萄糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)品、透明質(zhì)酸酶(300U/mg，Sigma)；其他試劑均為分析純(天津科密歐化學(xué)試劑有限公司)．

1.3 新型HA-Pu材料的制備

按照圖1所示合成路線，稱取EDC(200mg，0.001mmol)、DMAP(150mg，0.0015mmol)，分別投料按HA(100mg，0.002mmol)、普魯蘭糖(100mg，0.001mmol)以及HA(400mg，0.008mmol)、普魯蘭糖(100mg，0.001mmol)制備材料HA-Pu-Ⅰ、HA-Pu-Ⅱ．首先將HA溶于25mL二甲基亞砜中， 1mol/L鹽酸調(diào)pH至3.5～4.0，將EDC和DMAP依次加入到透明質(zhì)酸液中，室溫磁力攪拌2h．將普魯蘭多糖溶于適量的二甲基亞砜中，將其溶液緩慢滴加至已活化的透明質(zhì)酸液中，50 ℃磁力攪拌48h，將反應(yīng)液轉(zhuǎn)移至透析袋(8 000～14 000u)去離子水中透析48h，透析液冷凍干燥，得到海綿狀樣品．

圖1 HA-Pu接枝材料合成路線Fig.1 Synthetic route of Hyaluronic acid grafted pullulan

1.4 樣品紅外光譜分析

將待測樣品放在紅外燈下照射烘干，取適量樣品與KBr充分研磨至細(xì)粉末狀，壓片后采用FTIR-8400S傅里葉變換紅外光譜儀檢測，掃描波數(shù)400～4 000 cm-1，分辨率2 cm-1．

1.5 樣品1H NMR波譜檢測

測定HA、Pu以及HA-Pu氫核磁波譜，取樣品20 mg溶于0.5 mL D2O中，以四甲基硅烷為內(nèi)標(biāo)，置于AVANCE Ⅲ 600 MHz核磁共振儀中，測定樣品的氫核磁圖譜．采用1H NMR法測定透明質(zhì)酸接枝取代度，計(jì)算每個葡萄糖殘基上偶聯(lián)透明質(zhì)酸個數(shù)．

1.6 HA-Pu材料體外酶降解實(shí)驗(yàn)

1.6.1 葡萄糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

精密稱取葡萄糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)品，配成40 μg/mL儲備液，分別量取儲備液0，1.25，2.50，5.00和7.50 mL加至10 mL容量瓶中，加水定容，移取上述溶液1 mL加至25 mL具塞試管中，冰浴中冷卻，緩慢滴加0.025 mol/L硫酸硼砂液5.0 mL，加塞密閉，沸水浴加熱10 min后冷卻，移取質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.125%咔唑試劑0.2 mL，搖勻，沸水浴15 min后冷卻至室溫．采用紫外-可見光光度法，于530 nm處測定吸光度[7]．以吸光度A對藥物質(zhì)量濃度ρ(μg/mL)作圖，得到葡萄糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)曲線為A=1.34×10-2ρ+9.44×10-2(R2=0.998 4；n=5)，線性范圍為5～40 μg/mL．

0.025mol/L的硫酸硼砂溶液：稱取四硼酸鈉4.77g，溶于濃硫酸500mL中即得．

質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.125%的咔唑試劑：稱取咔唑0.125g，溶于100mL無水乙醇，即得．

1.6.2HA和HA-Pu新型材料的體外酶降解實(shí)驗(yàn)

分別剪取尺寸為0.5cm×0.5cm,質(zhì)量約為7mgHA和HA-Pu(Ⅰ～Ⅱ)樣品至10mLEP管中，加入2mL100U/mL新鮮透明質(zhì)酸酶溶液，樣品置于37 ℃ 150r/min恒溫氣浴搖床中，在設(shè)定時間從EP管中移取200μL樣品，立即補(bǔ)充同體積的新鮮酶液．200μL樣品液稀釋50倍，取1mL置于25mL具塞試管，冰浴冷卻，振搖下緩慢滴加0.025mol/L硫酸硼砂液5.0mL，加塞密閉，按照1.6.1項(xiàng)下操作，測定樣品吸光度，計(jì)算累積釋放量[7]．

2 結(jié)果與討論

2.1 紅外圖譜分析

樣品紅外圖譜見圖2，由于普魯蘭多糖、透明質(zhì)酸、物理混合物樣品和透明質(zhì)酸接枝普魯蘭糖分子中存在大量游離-OH與-CH2-，故3 200～3 600 cm-1顯示出強(qiáng)的-OH的伸縮振動峰和2 925 cm-1較強(qiáng)C—H伸縮振動峰[10]；由于透明質(zhì)酸、物理混合物樣品、接枝普魯蘭糖樣品中存在-NHCOCH3取代基團(tuán)，故1 655 cm-1處出現(xiàn)較強(qiáng)的酰胺帶吸收峰，而普魯蘭多糖分子中沒有-NHCOCH3基團(tuán)，在此波數(shù)處未見強(qiáng)吸收[11]．透明質(zhì)酸接枝普魯蘭糖樣品與物理混合物樣品相比，在1 720 cm-1處出現(xiàn)酯羰基伸縮振動吸收峰[12]，此重要特征峰出現(xiàn)，證明透明質(zhì)酸接枝普魯蘭糖樣品非簡單的普魯蘭糖與透明質(zhì)酸的物理混合，而是透明質(zhì)酸的羧基與普魯蘭糖的羥基經(jīng)酯化反應(yīng)接枝到多糖分子長鏈上．

a.透明質(zhì)酸；b.普魯蘭糖；c.透明質(zhì)酸普魯蘭糖混合物；d.透明質(zhì)酸-普魯蘭材料.圖2 紅外光譜圖Fig.2 FTIR spectra for the simple

2．21H NMR 譜圖分析

樣品1H NMR譜圖見圖3，透明質(zhì)酸和透明質(zhì)酸接枝普魯蘭糖樣品中存在-NHCOCH3基團(tuán)，故在1.8～2.0出現(xiàn)較強(qiáng)的-CH3峰；透明質(zhì)酸在4.36和4.45分別出現(xiàn)dd峰，分屬透明質(zhì)酸中葡萄糖醛酸和N-乙酰氨基葡萄糖單元H-1質(zhì)子峰[13]，而透明質(zhì)酸接枝普魯蘭糖對應(yīng)透明質(zhì)酸H-1質(zhì)子峰出現(xiàn)在4.35和4.44，由于接枝后H-1化學(xué)環(huán)境發(fā)生變化，導(dǎo)致透明質(zhì)酸H-1質(zhì)子峰化學(xué)位移遷移0.01．而酯化反應(yīng)對普魯蘭糖H-1影響較小，故普魯蘭糖與透明質(zhì)酸接枝普魯蘭糖樣品中普魯蘭糖分子鏈α-(1-4)糖苷鍵連接的H-1位dd峰出現(xiàn)在5.25～5.29[14]．由于反應(yīng)過程采用酸化步驟，此過程可催化乙酰氨基水解，脫除乙?；坞x部分氨基，故透明質(zhì)酸接枝普魯蘭糖樣品圖譜在2.7～2.8出現(xiàn)糖單元游離氨基后的H-2吸收峰．

a.透明質(zhì)酸；b.普魯蘭糖；c.透明質(zhì)酸-普魯蘭糖材料.圖3 核磁波譜圖Fig.3 Spectra of 1H NMR

按照公式以特征峰峰面積比值計(jì)算取代度[15](見表 2)

公式中，DS代表HA-Pu材料中透明質(zhì)酸的取代度；I4.34和I4.45分別代表透明質(zhì)酸中葡萄糖醛酸和N-乙酰氨基葡萄糖單元H-1對應(yīng)氫核磁峰面積；I5.25 ～ 5.29代表普魯蘭糖分子α-(1-4)糖苷鍵連接的H-1對應(yīng)氫核磁峰面積．

表2 HA-Pu材料中透明質(zhì)酸取代度

2.3 掃描電鏡顯微觀察

取膜樣品于掃描電鏡下觀察，由圖4可知，天然透明質(zhì)酸膜表面呈層狀疊放且分布較大孔洞；普魯蘭多糖膜呈致密層疊狀，表面平整光滑，少見孔洞；透明質(zhì)酸-普魯蘭糖膜表面呈疏松層狀疊放，具有10～20 μm較小孔洞．膜結(jié)構(gòu)差異，一方面可改變材料的吸水率，作為傷口膜敷料可吸收更多組織滲液，利于創(chuàng)面修復(fù)；此外，疏松多孔層狀疊放的HA-Pu膜材料，可獲得柔軟膜材料，利于與傷口緊密貼合，膜材料的多孔結(jié)構(gòu)利于傷口與外界空氣接觸，可有效促進(jìn)傷口愈合．

a.透明質(zhì)酸;b.普魯蘭糖;c.透明質(zhì)酸-普魯蘭糖材料.圖4 掃描電鏡圖Fig.4 SEM photographs of sumple

2.4 體外酶降解實(shí)驗(yàn)

合成的HA-Pu材料酶降解實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖5，合成的HA-Pu-Ⅰ與HA-Pu-Ⅱ材料相比透明質(zhì)酸，顯示出較好的抵抗透明質(zhì)酸酶降解特性．制備的2種HA-Pu材料和透明質(zhì)酸降解速度明顯不同，考慮到5 400 u的透明質(zhì)酸屬長鏈有機(jī)高分子，此時的透明質(zhì)酸酶可以充分接觸到透明質(zhì)酸分子鏈，有效降解透明質(zhì)酸．HA-Pu材料上殘存短鏈透明質(zhì)酸分子段，由于接枝，殘留透明質(zhì)酸分子段可被普魯蘭糖分子長鏈纏繞或包裹，增大透明質(zhì)酸酶與殘留透明質(zhì)酸分子段接觸的難度，減緩殘留透明質(zhì)酸分子的酶降解，故透明質(zhì)酸3d接近完全降解，而HA-Pu-Ⅰ和HA-Pu-Ⅱ材料分別降解約20%和30%，HA-Pu-Ⅰ和HA-Pu-Ⅱ材料完全降解時間分別延長到12 d和14 d．研究結(jié)果顯示：隨著HA-Pu材料中透明質(zhì)酸取代度增大，制備獲得的HA-Pu材料對抗酶降解能力增強(qiáng)，HA-Pu新材料較純透明質(zhì)酸抵抗透明質(zhì)酸酶降解能力顯著．

圖5 體外酶降解釋放圖(n=5，P<0.02)Fig.5 Enzyme degradation in vitro(n=5,P<0.02)

3 結(jié)論

本文采用酯化反應(yīng)將透明質(zhì)酸接枝到普魯蘭糖長鏈上，其合成方法簡便易行．獲得HA-Pu樣品經(jīng)紅外和1H NMR表征證明，此合成方法可成功制備HA-Pu新材料．HA-Pu膜材料酶降解實(shí)驗(yàn)表明，合成2種不同透明質(zhì)酸取代度的HA-Pu膜材料較透明質(zhì)酸相比，具備較優(yōu)的對抗透明質(zhì)酸酶降解作用且隨透明質(zhì)酸取代度增大其抗降解能力相應(yīng)提高．HA-Pu膜的掃描電鏡圖顯示，材料表面疏松多孔，利于組織細(xì)胞增殖有望促進(jìn)皮膚傷口愈合．

[1]TEHBM，SHENY，F(xiàn)RIEDLANDPL，etal．Areviewontheuseofhyaluronicacidintympanicmembranewoundhealing[J]．ExpertOpiniononBiologicalTherapy，2012，12(1)：23-36．DOI：10.1517/14712598.2012.634792．

[2]CUIN，QIANJM，XUWJ，etal．Preparationcharacterizationandbiocompatibilityevaluationofpoly(Nε-acryloyl-l-lysine)hyaluronicacidinterpenetratingnetworkhydrogels[J]．CarbohydratePolymers，2016，136：1017-1026．DOI：10.1016/j.carbpol.2015.09.095．

[3]WANGDH，BIANJJ，WEIGY，etal．Simultaneouslyenhancedproductionandmolecularweightofpullulanusingatwo-stageagitationspeedcontrolstrategy[J]．JournalofChemicalTechnologyandBiotechnology，2016，91(2)：467-475．DOI：10.1002/jctb.4600．

[4]ROGERSYE，IION，TAKEMURA，etal．Synthesisandcharacterizationofpullulanalkylesters[J]．EuropeanPolymerJournal，2015，66：470-477．DOI：10.1016/j.eurpolymj.2015.03.007．

[5] 楊文智，王苗苗，李海鷹，等．生物素化膽甾醇基普魯蘭糖合成及其自聚集性質(zhì)[J]．河北大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2014，34(1)：34-39．DOI：10.3969/j.issn.1000-1565.2014.01.007．YANGWZ，WANGMM，LIHY，etal．Synthesisofbiotinmodifiedcholesterylpullulananditsself-aggregatedbehavior[J]．JournalofHebeiUniversity(NaturalScienceEdition)，2014，34(1)：34-39．DOI：10.3969/j.issn.1000-1565.2014.01.007．

[6]BURDICKJA，PRESTWICHGD．HyaluronicAcidhydrogelsforbiomedicalapplications[J]．AdvancedMaterials，2011，23(12)：41-56．DOI：10.1002/adma.201003963．

[7]JEONO，SONGSJ，LEEKJ，etal．Mechanicalpropertiesanddegradationbehaviorsofhyaluronicacidhydrogelscross-linkedatvariouscross-linkingdensities[J]．CarbohydratePolymers，2007，70(3)： 251-257．DOI：10.1016/j.carbpol.2007.04.002．

[8] 李賢．普魯蘭多糖-透明質(zhì)酸水凝膠及其制備方法：中國，CN104861178A[P]．2015-05-26．

[9] 張健，奚宏偉，朱彬，等．熒光分光光度法檢測交聯(lián)透明質(zhì)酸中交聯(lián)劑殘留量[J]．生物學(xué)醫(yī)學(xué)工程學(xué)進(jìn)展，2011,3(4)：198-200．DOI：10.3969/j.issn.1674-1242.2011.04.005．ZHANGJ，XIHW，ZHUB，etal．Fluorescencespectrophotometrydetectioncrosslinkingagentresiduesincrosslinkinghyaluronicacid[J]．ProgressinBiomedicalEngineering，2011,3(4)：198-200．DOI：10.3969/j.issn.1674-1242.2011.04.005．

[10]MANETAC，IONUTM，IONELAO，etal．Studiesongraftcopolymerizationof3-acrylamidopropyltrimethylammoniumchlorideonpullulan[J]．CarbohydratePolymers，2011，84(3)：926-932．DOI：10.1016/j.carbpol.2010.12.043．

[11] 孫漢文，許成燕，趙燕燕，等．枸杞多糖硫酸酯化修飾及其對Hela細(xì)胞的體外抑制作用[J]．河北大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2009，29(6)：591-595．DOI：10.3969/j.issn.1000-1565.2009.06.009．SUNHW，XUCY，ZHAOYY，etal．Sulfationformodificationoflyciumbarbarumpolysaccharideanditsinhibitingeffecttogrowthofhelacellinvitro[J]．JournalofHebeiUniversity(NaturalScienceEdition)，2009，29(6)：591-595．DOI：10.3969/j.issn.1000-1565.2009.06.009．

[12]SHAHNN，VISHWASRAOC，SINGHALRS，etal．n-Octenylsuccinylationofpullulan：Effectonitsphysico-mechanicalandthermalpropertiesandapplicationasanediblecoatingonfruits[J]．FoodHydrocolloids，2016，55：179-188．DOI：10.1016/j.foodhyd.2015.11.026．

[13]WELTID，REESDA，WELSHEJ，etal．Solutionconformationofglycosaminoglycans：assignmentofthe300-MHzH-magneticresonancespectraofchondroitin4-sulphate，chondroitin6-sulphateandhyaluronate，andinvestigationofanalkali-inducedconformationchange[J]．EuropeanJournalofBiochemistry，1979，94(2)：505-514．DOI：10.1111/j.1432-1033.1979.tb12919.x．

[14]DEANEDM，HANSJV．Structuralstudiesofpullulanbynuclearmagneticresonancespectroscopy[J]．Starch-Starke，1993，45(11)：406-410．DOI：10.1002/star.19930451108．

[15]YANGXD，ZHANGQQ，WANGYS，etal．Self-aggregatednanoparticlesfrommethoxypoly(ethyleneglycol)-modifiedchitosan：synthesis；characterization；aggregationandmethotrexatereleaseinvitro[J]．ColloidsandSurfacesB：Biointerfaces，2008，61(2)：125-131．DOI：10.1016/j.colsurfb.2007.07.012．

(責(zé)任編輯：梁俊紅)

Preparation and characterization of a new hyaluronic acid grafted pullulan material

YANG Wenzhi,WANG Shugen,LIU Jiaoyan,JIA Bei,LI Haiying

(College of Pharmacy,Hebei University,Baoding 071002,China)

A series of hyaluronic acid grafted pullulan(HA-Pu)were prepared by esterification reaction,using 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide(EDC)as dehydrating agent and 4-dimethylaminopyridine(DMAP)as catalyst.The structure of HA-Pu was confirmed by the Fourier transform infrared spectrum(FTIR)and proton nuclear magnetic resonance(1H NMR),and the degree of substitution(DS) of hyaluronic acid moiety was determined by1H NMR.The freeze-dried HA-Pu materials could be compressed to obtain a HA-Pu film.The HA-Pu film was observed by scanning electron microscopy(SEM),which obtained the layered microstructure with a lot of small holes.Compared with hyaluronic acid,the HA-Pu materials have better ability to resist enzyme degradationinvitro.Therefore,HA-Pu should be a promising novel material to expand the application of hyaluronic acid in pharmaceatics.

hyaluronic acid；pullulan；chemical grafting；enzyme degradation in vitro

10.3969/j.issn.1000-1565.2017.02.006

2016-08-10

河北省高等學(xué)校科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(ZD2016102)；河北大學(xué)研究生創(chuàng)新項(xiàng)目(X2016071)

楊文智(1972—)，男，內(nèi)蒙古錫林浩特人，河北大學(xué)副教授，從事生物醫(yī)用材料及藥物緩控釋制劑方面研究．E-mail:wenzhi_yang@sina.com

O

A

1000-1565(2017)02-0141-06