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    氟苯尼考對三種豬呼吸道病原菌標(biāo)準(zhǔn)株的體外抗菌類型研究

    2017-04-26 03:09:35李先強(qiáng)趙麗劉俊峰郭雪峰江春雨劉永宏
    新疆農(nóng)業(yè)科學(xué) 2017年3期
    關(guān)鍵詞:殺性氟苯尼豬鏈球菌

    李先強(qiáng),趙麗,劉俊峰,郭雪峰,江春雨,劉永宏

    (塔里木大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院/新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木畜禽科技重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,新疆阿拉爾 843300)

    氟苯尼考對三種豬呼吸道病原菌標(biāo)準(zhǔn)株的體外抗菌類型研究

    李先強(qiáng),趙麗,劉俊峰,郭雪峰,江春雨,劉永宏

    (塔里木大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院/新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木畜禽科技重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,新疆阿拉爾 843300)

    【目的】研究氟苯尼考對常見豬呼吸道病原菌的抗菌類型。【方法】對豬鏈球菌、豬胸膜肺炎桿菌及多殺性巴氏桿菌標(biāo)準(zhǔn)株進(jìn)行最低抑菌濃度(MIC)、最小殺菌濃度(MBC)、抗菌后效應(yīng)(PAE)的測定和體外殺菌曲線的繪制?!窘Y(jié)果】氟苯尼考對上述病原菌的MIC和MBC依次為0.25~0.5 μg/mL和2~4 μg/mL,PAE結(jié)果顯示,氟苯尼考對3株病原菌均隨暴露濃度的增大和時(shí)間的延長其抗菌后效應(yīng)明顯延長;體外殺菌曲線表明,氟苯尼考對上述三株病原菌均有很好的抗菌能力,且抗菌效應(yīng)隨藥物濃度的增大而明顯增強(qiáng)。【結(jié)論】氟苯尼考對常見豬呼吸道病原菌的抗菌類型為濃度依賴型。

    氟苯尼考;豬呼吸道病原菌;抗菌類型;抗菌后效應(yīng);殺菌曲線;濃度依賴型

    0 引 言

    【研究意義】豬細(xì)菌性呼吸道疾病是造成養(yǎng)豬業(yè)經(jīng)濟(jì)損失最大的一類傳染性疾病,臨床發(fā)病率為10%~45%,死亡率更是高達(dá)2%~20%[1]。氟苯尼考因其抗菌譜廣、抗菌活性強(qiáng)、肺部組織濃度高等特點(diǎn)而廣泛的應(yīng)用于臨床豬呼吸道疾病的防治[2]?!厩叭搜芯窟M(jìn)展】近年來,伴隨著臨床獸藥的不合理使用導(dǎo)致耐氟苯尼考菌株的大量滋生,為輔助改善這一不良局面,提出了藥動(dòng)學(xué)-藥效學(xué)(PK-PD)同步模型以制定科學(xué)合理的給藥方案[3]。PK-PD同步模型可以結(jié)合抗菌藥物的藥動(dòng)學(xué)和藥效學(xué)特征進(jìn)行綜合研究,將藥物不同形式的體內(nèi)外過程進(jìn)行整合并全面地分析藥物、菌株和宿主三者間的相互關(guān)系,為抗菌藥物臨床使用的安全性和有效性提供了重要的理論依據(jù)[4, 5]?!颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】根據(jù)抗菌藥物與細(xì)菌作用類型的不同可將藥物抗菌分為濃度依賴型和時(shí)間依賴型兩大類,而時(shí)間依賴型又可具體分為長PAE和短PAE[6]。不同類型所對應(yīng)的PK-PD參數(shù)也不同,常用的PK-PD結(jié)合參數(shù)主要有:Cmax/MIC、AUC/MIC和T>MIC[7, 8]。根據(jù)已有研究表明抗菌藥物的抗菌特點(diǎn)與PK-PD參數(shù)密切有關(guān)[9],且準(zhǔn)確的PK-PD參數(shù)在PK-PD模型擬合科學(xué)合理的給藥方案中占據(jù)著重要作用,這就需要準(zhǔn)確的判斷抗菌藥物的抗菌類型,目前藥物抗菌類型的判別主要通過體內(nèi)和半體內(nèi)殺菌曲線特征[4, 5, 10]?!緮M解決的關(guān)鍵問題】對三種豬呼吸道病原菌的標(biāo)準(zhǔn)株進(jìn)行最低抑菌濃度(MIC)、最小殺菌濃度(MBC)、抗菌后效應(yīng)(PAE)的測定,以及體外殺菌曲線的繪制,準(zhǔn)確判斷氟苯尼考對常見豬細(xì)菌性呼吸道病原菌的抗菌類型,為PK-PD研究提供準(zhǔn)確的PK-PD參數(shù)。

    1 材料與方法

    1.1 材 料

    1.1.1 藥品與試劑

    氟苯尼考標(biāo)準(zhǔn)品購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所,含二甲基甲酰胺的無菌去離子水配成128 μg/mL的藥液置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆?;MH肉湯、TSA瓊脂、TSB肉湯培養(yǎng)基和NAD均由青島新希望生物科技有限公司生產(chǎn),按說明書配置;胎牛血清(四季青)購自廣州瑞特生物技術(shù)有限公司。

    1.1.2 菌種

    豬鏈球菌cvcc 3928、豬胸膜肺炎桿菌cvcc 268以及多殺性巴氏桿菌cvcc 388購自中國獸醫(yī)藥品檢查所并由實(shí)驗(yàn)室保存。

    1.2 方 法

    1.2.1 生長曲線的繪制

    分別將三種菌液培養(yǎng)所得的種子液100 μL接種于100 mL含有5%胎牛血清及10 μg/mL NAD的TSB培養(yǎng)基錐形瓶中,同時(shí)將5%胎牛血清及10 μg/mL NAD的TSB培養(yǎng)基設(shè)有空白對照組,置恒溫培養(yǎng)箱(37℃,5%CO2)中培養(yǎng)。每隔2 h抽取1 mL的培養(yǎng)物,用紫外分光光度計(jì)在600 nm條件下測定其OD值。以時(shí)間為橫坐標(biāo),細(xì)菌培養(yǎng)物的OD值為縱坐標(biāo),繪制三種菌株在TSB培養(yǎng)基中的生長曲線。

    1.2.2 MIC、MBC、MPC和PAE的測定

    參考CLSI標(biāo)準(zhǔn)(CLSI-M07A8-2010)中的微量肉湯稀釋法分別測定氟苯尼考對豬鏈球菌、豬胸膜肺炎桿菌以及多殺性巴氏桿菌的MIC[2]。在此基礎(chǔ)上根據(jù)CLSI標(biāo)準(zhǔn)(M26-AE)中推薦的方法進(jìn)行MBC的測定。

    根據(jù)耐藥選擇窗(MSW)理論,按照文獻(xiàn)報(bào)道方法進(jìn)行MPC的測定[4]。配制含氟苯尼考濃度為1、2、4、8、16、32、64 MIC的TSA瓊脂,接種1010CFU/mL菌液100 μL于培養(yǎng)箱(37 ℃,5%CO2)中培養(yǎng)。72 h后無菌落生長的最低氟苯尼考濃度成為MPCpr,根據(jù)MPCpr依次線性遞減20%氟苯尼考濃度,配制TSA瓊脂并重復(fù)培養(yǎng),不出現(xiàn)菌落生長的最低藥物濃度即為MPC。

    將含氟苯尼考10、20、40 MIC濃度0.2 mL與107CFU/mL菌液1.8 mL混合培養(yǎng)1和2 h,同時(shí)進(jìn)行不含藥物的空白對照。然后將培養(yǎng)液稀釋100倍去除藥物后的菌液和對照菌液各0.5 mL,加入4.5 mL無菌處理的TSB中培養(yǎng),此為重建后零時(shí)。分別于0、1、2、4、6、8、12 h取細(xì)菌培養(yǎng)液100 μL進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)以建立不同濃度處理后各菌液恢復(fù)生長的動(dòng)力學(xué)曲線。按照PAE=T-C計(jì)算不同濃度的氟苯尼考與豬鏈球菌、豬胸膜肺炎桿菌以及多殺性巴氏桿菌接觸1和2 h后的PAE,其中T和C分別為誘導(dǎo)PAE 的實(shí)驗(yàn)組細(xì)菌數(shù)目高于重建后零時(shí)10倍和對照組細(xì)菌的數(shù)目高于重建后10倍所需要的時(shí)間。

    1.2.3 體外殺菌曲線的繪制

    TSB肉湯稀釋的1/2、1、2、4、8、16、32 MIC濃度的氟苯尼考標(biāo)準(zhǔn)液稀1.5 mL與106CFU/mL的1.5 mL菌液混合于細(xì)菌瓶中,無菌TSB培養(yǎng)液中的細(xì)菌計(jì)數(shù)為初始細(xì)菌濃度。分別于0、1、2、4、6、8、12、18、24 h抽取培養(yǎng)液0.1 mL稀釋后進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)三次取平均值。以時(shí)間點(diǎn)為橫坐標(biāo),不同時(shí)間點(diǎn)活菌落數(shù)的對數(shù)值為縱坐標(biāo)繪制氟苯尼考對豬鏈球菌、豬胸膜肺炎桿菌以及多殺性巴氏桿菌的殺菌曲線。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 生長曲線

    研究表明,豬鏈球菌、豬胸膜肺炎桿菌以及多殺性巴氏桿菌在TSB肉湯培養(yǎng)基中的生長曲線為,豬鏈球菌和豬胸膜肺炎桿菌在0~3 h為遲緩期,3~10 h處于對數(shù)期,10~24 h處于生長穩(wěn)定期。多殺性巴氏桿菌在0~4 h處于遲緩期,4~12 h為遲緩期,12~24 h為生長穩(wěn)定期。圖1

    圖1 豬鏈球菌、豬胸膜肺炎桿菌以及多殺性巴氏桿菌生長曲線(n=3)
    Fig.1 The growth curve ofStreptococcussuis,ActinobacilluspleuropneumoniaeandPasteurellamultocida (n=3)

    2.2MIC、MBC、MPC和PAE

    氟苯尼考對豬鏈球菌、豬胸膜肺炎桿菌及多殺性巴氏桿菌標(biāo)準(zhǔn)株的MIC、MBC、MPC和PAE測定結(jié)果顯示,MIC≤0.5表明氟苯尼考對所選3種豬呼吸道病原菌均較敏感,MBC和MPC依次介于2~4和4~8μg/mL,氟苯尼考對豬鏈球菌、豬胸膜肺炎桿菌及多殺性巴氏桿菌的耐藥突變窗可依次定為0.25~4、0.5~8和0.25~8μg/mL。表1

    氟苯尼考對3種豬呼吸道病原菌的PAE結(jié)果相似,均表現(xiàn)出隨暴露氟苯尼考藥物濃度的增大和時(shí)間的延長其PAE均明顯延長。相比較于時(shí)間的延長,暴露1和2h后PAE的長短與氟苯尼考藥物濃度呈現(xiàn)一定的正相關(guān),隨藥物濃度的增大PAE有逐漸增加的趨勢。PAE試驗(yàn)表明氟苯尼考對豬鏈球菌、豬胸膜肺炎桿菌及多殺性巴氏桿菌有著明顯的濃度依賴性。表1

    表1 氟苯尼考對豬鏈球菌、豬胸膜肺炎桿菌及多殺性巴氏桿菌的體外藥敏
    Table 1 In vitro antimicrobial susceptibility of florfenicol againstStreptococcussuis,ActinobacilluspleuropneumoniaeandPasteurellamultocida

    菌株MIC(μg/mL)MBC(μg/mL)MPC(μg/mL)PAE濃度(μg/mL)Expose(h)Expose(h)豬鏈球菌cvcc39280.2524MIC(0.25)0.20.42MIC(0.5)0.71.04MIC(1)1.21.4豬胸膜肺炎桿菌cvcc2680.528MIC(0.5)0.20.82MIC(1)1.41.84MIC(2)2.02.6多殺性巴氏桿菌cvcc3880.2548MIC(0.25)0.20.62MIC(0.5)0.81.84MIC(1)1.82.4

    2.3 氟苯尼考對豬鏈球菌的殺菌曲線

    研究表明,32MIC 2 h可將細(xì)菌全部殺滅,8MIC 4 h可將細(xì)菌全部殺滅,4 MIC 16 h可將細(xì)菌全部殺滅,2MIC 24 h可將細(xì)菌全部殺滅;而在1/4MIC、1/2MIC、1MIC和2MIC濃度時(shí),24 h內(nèi)仍不能將細(xì)菌全部殺滅。對比0MIC可知不同濃度氟苯尼考對豬鏈球菌均有一定殺滅作用,且殺菌能力隨著濃度的增加抗菌效果逐漸增強(qiáng),表現(xiàn)出較為明顯的濃度依賴性。圖2

    2.4 氟苯尼考對豬胸膜肺炎桿菌的殺菌曲線

    研究表明,對比0MIC可知不同濃度氟苯尼考對豬胸膜肺炎桿菌均有一定的殺滅作用,在1/4、1/2、1、2、4、8和 32MIC濃度時(shí),24 h內(nèi)也不能將細(xì)菌全部殺滅。殺菌能力在2MIC以下時(shí)隨著暴露時(shí)間的延長其抗菌能力逐漸增強(qiáng),表現(xiàn)出明顯的時(shí)間依賴性,而氟苯尼考濃度在2MIC以上時(shí)隨著藥物濃度的增大抗菌能力逐漸增強(qiáng),這又表現(xiàn)出較弱的濃度依賴性特征。圖3

    圖2 不同濃度氟苯尼考對豬鏈球菌cvcc 3928殺菌曲線
    Fig.2 The killing-curve ofStreptococcussuiscvcc 3928 exposed to various concentration

    of florfenicol

    圖3 不同濃度氟苯尼考對豬胸膜肺炎桿菌cvcc 268殺菌曲線
    Fig.3 The killing-curve ofActinobacilluspleuropneumoniaecvcc 268 exposed to various concentration of florfenicol

    2.5 氟苯尼考對多殺性巴氏桿菌的殺菌曲線

    研究表明,32MIC 1 h可將細(xì)菌全部殺滅,8MIC 2 h可將細(xì)菌全部殺滅,4 MIC 8 h可將細(xì)菌全部殺滅,2MIC 24 h可將細(xì)菌全部殺滅;而在1/4、1/2、1和2MIC濃度時(shí),24 h內(nèi)也不能將細(xì)菌全部殺滅。對比0MIC可知不同濃度氟苯尼考對多殺性巴氏桿菌均有一定殺滅作用,且殺菌能力隨著濃度的增加抗菌效果逐漸增強(qiáng),說明氟苯尼考對多殺性巴氏桿菌的抗菌作用呈現(xiàn)明顯的濃度依賴性。圖4

    圖4 不同濃度氟苯尼考對多殺性巴氏桿菌cvcc388殺菌曲線
    Fig.4 The killing-curve ofPasteurellamultocidacvcc388 exposed to various concentration of florfenicol

    3 討 論

    氟苯尼考對試驗(yàn)所選取的三種常見豬呼吸道病原菌標(biāo)準(zhǔn)株的MIC≤0.5 μg/mL,表明敏感性較好。Ueda等[11]報(bào)道了氟苯尼考對90株臨床分離的豬胸膜肺炎桿菌的MIC50值為0.39 μg/mL,Sung等[12]測定了氟苯尼考對臨床豬源和牛源的胸膜肺炎桿菌MIC90≤1 μg/mL,Saskia等[13]分析了臨床756株多殺性巴氏桿菌等常見呼吸道病原菌對氟苯尼考的MIC均≤2 μg/mL。另外,現(xiàn)有PK-PD模型研究表明抗菌藥對病原菌的敏感折點(diǎn)值(Cutoff)常分布在0.25 μg/mL左右[14-16]。試驗(yàn)雖沒有進(jìn)行氟苯尼考對相關(guān)病原菌的群體藥效學(xué)研究,但從MIC測定值來看研究所選取的標(biāo)準(zhǔn)菌是具有一定合理性的,可用于氟苯尼考對常見豬呼吸道病原菌標(biāo)準(zhǔn)株的抗菌類型分析。

    防止病原菌被選擇性富集和擴(kuò)增所需的最低抗菌藥物濃度可定義為防突變濃度,常用于評價(jià)抗菌藥物抗菌效力和抑制耐藥突變菌株生長能力[17],通常把MIC與MPC 之間的濃度范圍定義為耐藥突變窗(MSW)。研究表明,MPC值介于4~8 μg/mL,可初步將氟苯尼考對豬鏈球菌、豬胸膜肺炎桿菌及多殺性巴氏桿菌的耐藥突變窗可依次定為0.25~4、0.5~8和0.25~8 μg/mL。

    體內(nèi)外抗菌曲線是目前判定抗菌藥抗菌類型最常用的方法[4, 5, 10, 15],研究表明,氟苯尼考對豬鏈球菌、豬胸膜肺炎桿菌及多殺性巴氏桿菌的抗菌能力均隨著藥物濃度的增大而增強(qiáng),顯示出了氟苯尼考對常見豬呼吸道病原菌具有很強(qiáng)的濃度依賴性。Sidhu等[18]報(bào)道了氟苯尼考對牛源多殺性巴氏桿菌具有明顯的濃度依賴,Potter等[19]也分析出氟苯尼考具有很強(qiáng)的濃度依賴性,均與研究結(jié)果一致。濃度依賴性藥物的抗菌效果與血藥濃度成正比[20],這就提示臨床使用氟苯尼考時(shí)應(yīng)適當(dāng)提高氟苯尼考的血藥濃度,而不宜延長氟苯尼考的給藥時(shí)間,這就提示在臨床上長期使用氟苯尼考防治畜禽呼吸道疾病效果不佳時(shí)可考慮換用其他藥物或應(yīng)用氟苯尼考聯(lián)合用藥。另外,如果氟苯尼考的臨床給藥間隔過小而長時(shí)間給藥導(dǎo)致動(dòng)物機(jī)體內(nèi)長時(shí)間存在亞劑量的氟苯尼考濃度,便會(huì)極大的增加病原菌對氟苯尼考的耐藥風(fēng)險(xiǎn)。

    4 結(jié) 論

    PAE結(jié)果顯示氟苯尼考對豬鏈球菌、豬胸膜肺炎桿菌以及多殺性巴氏桿菌均隨暴露濃度的增大和時(shí)間的延長其抗菌后效應(yīng)明顯延長,體外殺菌曲線表明氟苯尼考對病原菌的抗菌效應(yīng)隨藥物濃度的增大而明顯增強(qiáng)。初步斷定氟苯尼考對常見豬呼吸道病原菌的抗菌類型為濃度依賴型。

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    Supported by: National Natural Science Fundation "Pharmacokinetic and pharmacodynamic integration and modeling of florfenicol in swine for Streptococcus suis" (31660729); Tarim University president's Fund-Youth Innovation Fund Project "Preparation and characterizationof florfenicol inclusion complexes nanosuspension"(TDZKQN201603)

    In Vitro Study on Antimicrobial Type of Florfenicol against Three Standard Porcine Respiratory Pathogens

    LI Xian-qiang, ZHAO Li, LIU Jun-feng, GUO Xun-feng, JIANG Chun-yu, LIU Yong-hong

    (KeyLaboratoryofTarimAnimalHusbandryScienceandTechnology,XinjaingProductionandConstructionCorps/CollegeofAnimalScience,TarimUniversity,AlarXinjiang843300,China)

    【Objective】 The purpose of the present study is to investigate the antimicrobial type of florfenicol against the main primary causative bacteria of pig pneumonia. 【Method】The minimum inhibitory concentration (MIC), minimal bactericidal concentration (MBC) and post-antibiotic effect (PAE) of florfenicol againstStreptococcussuis,PasteurellamultocidaandActinobacilluspleuropneumoniaewere determined. 【Result】The MIC and MBC of florfenicol against the above pathogenic bacterias were 0.25~0.5 μg/mL and 2~4 μg/mL, respectively. The results have shown that the PAE increased with the increasing of drug concentration and extension of expose time, and time-kill curve also demonstrated that the antibacterial ability increased with the increasing of florfenicol concentration. 【Conclusion】According to the results of PAE and time-kill curve in this study, we concluded that the florfenicol is typically concentration dependent against the main primary causative bacteria.

    florfenicol; pig respiratory pathogens; antimicrobial type; post antibiotic effect; time-kill curve; concentration dependent

    10.6048/j.issn.1001-4330.2017.03.021

    2016-11-18

    國家自然科學(xué)基金“氟苯尼考對豬鏈球菌的藥動(dòng)學(xué)-藥效學(xué)同步模型研究”(31660729);塔里木大學(xué)校長基金-青年創(chuàng)新資金項(xiàng)目“氟苯尼考包合物微球納米混懸劑的制備”(TDZKQN201603)

    李先強(qiáng)(1989-),男,安徽馬鞍山人,講師,研究方向?yàn)楂F醫(yī)藥理學(xué)及藥動(dòng)學(xué),(E-mail)lixianqiang89@sina.com

    劉永宏(1981-),男,內(nèi)蒙古武川人,副教授,博士,研究方向?yàn)榧倚蟛±韺W(xué)和臨床疾病診治,(E-mail)lyhdky@126.com

    S855.3

    A

    1001-4330(2017)03-0557-07

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