雙水相萃取系統(tǒng)相圖制作新方法

高向陽， 穆洪濤, 方 穎

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，廣州 510642； 2.廣東第二師范學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院，廣州 510303； 3.華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 公共基礎(chǔ)課實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心,廣州 510510)

雙水相萃取系統(tǒng)相圖制作新方法

高向陽1， 穆洪濤2, 方 穎3

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，廣州 510642； 2.廣東第二師范學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院，廣州 510303； 3.華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 公共基礎(chǔ)課實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心,廣州 510510)

相圖是研究雙水相萃取分離過程的重要前提步驟，提出了清-濁點(diǎn)輔助相圖制作方法，采用移液器微量滴定的方法繪制了PEGs/(NH4)2SO4的雙水相相圖，經(jīng)準(zhǔn)確度驗(yàn)證，此方法準(zhǔn)確可靠。清-濁點(diǎn)輔助相圖制作法具有操作簡便、快速、準(zhǔn)確和適用范圍廣等特點(diǎn)，為雙水相系統(tǒng)相圖制作提供了新的方法，可以用于雙水相萃取的實(shí)驗(yàn)教學(xué)、科研及生產(chǎn)等領(lǐng)域。關(guān)鍵詞：清-濁點(diǎn)輔助相圖制作方法； 雙節(jié)線； 微量滴定； PEG/(NH4)2SO4雙水相系統(tǒng)

0 引 言

雙水相萃取系統(tǒng)(Aqueous Two-phase Extraction，ATPS)是由兩種化學(xué)結(jié)構(gòu)不同的親水性聚合物，或者一種親水性聚合物和無機(jī)鹽在水中以適當(dāng)?shù)臐舛榷纬苫ゲ幌嗳艿膬伤嘞到y(tǒng)。由于其條件溫和、容易放大、可連續(xù)操作，目前已廣泛地應(yīng)用于生物大分子的分離和純化[1]。

目前，常用于雙水相系統(tǒng)相圖制作的方法大致有濁點(diǎn)法[2]和系線法[3]。濁點(diǎn)法制作相圖操作簡便，但由于在臨界點(diǎn)判斷上往往存在誤差，故不同研究者制作的相圖差異較大，降低了參考性[4-6]。系線法需要分析上、下相的組分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，操作繁瑣，而且精確地做出相圖要許多組數(shù)據(jù),工作量大，增加了相圖制作的困難。基于此，本文提出了清-濁點(diǎn)輔助相圖制作法，此方法不僅對所有的雙水相體系相圖制作具有普遍適用性，而且其操作過程更加簡易快捷，相圖的精確度方面也較傳統(tǒng)濁點(diǎn)法有較大程度的提高。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

材料：PEG400(聚乙二醇400)，PEG1000，PEG2000，PEG6000購自阿拉丁試劑(上海)有限公司；硫酸銨購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，去離子水產(chǎn)自Milli-Q Academic A10。

儀器：1/1000天平(METTLER TOLEDO PB203-N)，20～200 μL、100～1 000 μL移液器(Eppendorf Research plus)，漩渦振蕩器(Essenscien v7)，玻璃刻度離心管10 mL。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 溶液配制

將成相物質(zhì)PEG配制成50%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的濃溶液，(NH4)2SO4配制成40%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的濃溶液，備用。

1.2.2 清-濁點(diǎn)的測定

濃溶液質(zhì)量的標(biāo)定：用微量移液器量取一定體積(1 mL 或100 μL)的50%PEG濃溶液或40%的(NH4)2SO4濃溶液，于電子天平上稱量液體質(zhì)量，每種濃溶液反復(fù)稱量10次。

在刻度離心管中加入1 mL 50%PEG濃溶液，然后用移液器每次加入100 μL (NH4)2SO4濃溶液，振蕩，至體系剛剛渾濁(濁點(diǎn))，記錄加入(NH4)2SO4濃溶液的體積；再每次加入100 μL水，至體系剛剛澄清(清點(diǎn))，記錄加入水的體積；同理依次交替加入(NH4)2SO4濃溶和水，記錄加入體積并計(jì)算每個(gè)測試點(diǎn)含(NH4)2SO4和PEG的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.2.3 PEG/(NH4)2SO4雙水相體系相圖的建立

以硫酸銨的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為橫坐標(biāo)，PEG的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為縱坐標(biāo)，繪制清點(diǎn)散點(diǎn)圖和濁點(diǎn)散點(diǎn)圖。由于理論上相圖的雙節(jié)線位于濁點(diǎn)散點(diǎn)圖和清點(diǎn)散點(diǎn)圖之間，故取相鄰濁點(diǎn)坐標(biāo)和清點(diǎn)坐標(biāo)的中點(diǎn)所組成的系列散點(diǎn)制作雙節(jié)線圖，并對中點(diǎn)散點(diǎn)圖進(jìn)行曲線擬合。

1.2.4 相圖精準(zhǔn)度驗(yàn)證

根據(jù)對雙節(jié)線的擬合結(jié)果，在雙節(jié)線附近均勻選取驗(yàn)證點(diǎn)，根據(jù)所選的驗(yàn)證點(diǎn)坐標(biāo)配制相應(yīng)濃度的溶液體系，驗(yàn)證分相結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 PEG1000/(NH4)2SO4雙水相體系清-濁點(diǎn)的測定

PEG是雙水相萃取分離中最常用的一種有機(jī)試劑，本研究著重以PEG1000/(NH4)2SO4雙水相體系相圖的制作為例，介紹清-濁點(diǎn)相圖制作方法。由于備用硫酸銨濃溶液比重較大，需要對一定體積的濃溶液的質(zhì)量(密度)進(jìn)行標(biāo)定,以便計(jì)算每個(gè)清-濁點(diǎn)的PEG和硫酸銨的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。濃溶液質(zhì)量標(biāo)定參照移液器標(biāo)定方法[7]。由表1可知，一定體積濃溶液質(zhì)量標(biāo)定結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)差及變異系數(shù)(CV<5%)為可接受范圍。即可以用微量移液器來量取溶液進(jìn)行清-濁點(diǎn)的制作。

向1 mL 50%的PEG1000溶液中以100 μL為單位滴加(NH4)2SO4或去離子水，記錄達(dá)到每個(gè)濁點(diǎn)或清點(diǎn)所用的(NH4)2SO4和去離子水的份數(shù)(25 ℃)。在PEG1000/(NH4)2SO4雙水相體系中共測定54個(gè)測試點(diǎn)，其中清點(diǎn)和濁點(diǎn)的個(gè)數(shù)均為27個(gè)。在54個(gè)測試點(diǎn)中，絕大數(shù)測試點(diǎn)(90.7%)只需滴加1份(100 μL)；只有少數(shù)(7.4%)需滴加2份，僅有一個(gè)點(diǎn)需滴加4份。由此可見，此方法大大簡化了傳統(tǒng)相圖的制作步驟。

計(jì)算每個(gè)濁點(diǎn)和清點(diǎn)處PEG1000和(NH4)2SO4的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，并以(NH4)2SO4的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為橫坐標(biāo)，PEG1000的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為縱坐標(biāo)繪制散點(diǎn)圖(見圖1)。圖1中濁點(diǎn)散點(diǎn)和清點(diǎn)散點(diǎn)圖大致平行，且距離緊密。

圖1 PEG1000/(NH4)2SO4雙水相體系測試點(diǎn)分布圖

2.2 PEG1000/(NH4)2SO4雙水相體系的相圖制作及驗(yàn)證

由于每次加入(NH4)2SO4和H2O的體積大體相當(dāng)，且每次加入的溶液相對整個(gè)體系來說較小，故選取相鄰清點(diǎn)和濁點(diǎn)坐標(biāo)的中點(diǎn)散點(diǎn)作為雙節(jié)線的制作依據(jù)，所作的相圖更加精確。依據(jù)中點(diǎn)散點(diǎn)圖描出的平滑曲線即為PEG1000/(NH4)2SO4雙水相體系的相圖(見圖2)。經(jīng)回歸分析獲得中點(diǎn)散點(diǎn)圖的擬合曲線公式:

y=9.971 2x2-4.708 1x+0.594 3

回歸系數(shù)R2=0.996 5。

圖2 PEG1000/(NH4)2SO4雙水相體系相圖

根據(jù)擬合的方程，在雙節(jié)線上下均勻選取驗(yàn)證點(diǎn)各7個(gè)，并配制相應(yīng)濃度的溶液體系，震蕩后靜止觀察是否出現(xiàn)兩相。各驗(yàn)證點(diǎn)的結(jié)果(見圖3)顯示，雖然雙節(jié)線上下的驗(yàn)證點(diǎn)距離較近，但是上方的7個(gè)點(diǎn)均出現(xiàn)兩相分層，下方的7個(gè)點(diǎn)均未出現(xiàn)兩相分層(均相)。此結(jié)果表明,清-濁點(diǎn)輔助相圖制作方法制作的相圖精確。

2.3 其他型號PEG/(NH4)2SO4的相圖制作

按照同樣方法作出PEG400、PEG2000、PEG6000與(NH4)2SO4的雙水相體系相圖(見圖4)。由此可知，清-濁點(diǎn)輔助相圖制作方法同樣適合其他型號或類型的雙水相系統(tǒng)相圖的制作。

3 討 論

與其他方法相比，清-濁點(diǎn)輔助相圖制作法樣品用量少使體系能夠快速平衡，從而在單位時(shí)間內(nèi)能夠采集更多相分離臨界點(diǎn)，提高了相圖的準(zhǔn)確度，同時(shí)又大大地減少了相圖制作時(shí)間并節(jié)約了測試試劑成本(見表2)。另外，由于本方法無需測定各成相組分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，故具有極高的通用性。由表2可知，傳統(tǒng)濁點(diǎn)法依然是相圖制作的主流方法。此種方法雖然具有操作簡便快捷的優(yōu)點(diǎn)，但在臨界點(diǎn)判斷上往往存在誤差。濁度滴定法[12]是在傳統(tǒng)濁點(diǎn)法的基礎(chǔ)上，用回滴水或回滴有機(jī)相的方法對濁點(diǎn)加以確定。濁度滴定法雖在一定程度內(nèi)提高了濁點(diǎn)的判定的準(zhǔn)確度，但反復(fù)滴加和每管至多測定一個(gè)濁點(diǎn)，也在一定程度上增加了操作步驟的繁瑣度。安建平等[6]用吸光度法和電導(dǎo)率法分別測定PEG和(NH4)2SO4的質(zhì)量分?jǐn)?shù)帶替代傳統(tǒng)的稱重法，在臨界點(diǎn)的判定上并沒有做出改進(jìn)。

圖3 相圖精準(zhǔn)度驗(yàn)證

圖4 PEGs/(NH4)2SO4的雙水相體系相圖

表2 清-濁點(diǎn)輔助相圖制作法與其他相圖制作方法的比較

4 結(jié) 語

本文提出的清-濁點(diǎn)輔助相圖制作方法依據(jù)雙節(jié)線的定義修正了傳統(tǒng)上用濁點(diǎn)來表示臨界點(diǎn)的方法，提高了臨界點(diǎn)確定的準(zhǔn)確度，具有快捷簡便、試劑用量少和適用范圍廣等特點(diǎn)；另外，清-濁點(diǎn)輔助相圖制作方法同時(shí)也傳承了傳統(tǒng)濁點(diǎn)法適用范圍廣的優(yōu)點(diǎn)，即不僅適用于PEGs/(NH4)2SO4的雙水相體系還適用于其他雙水相萃取體系的相圖制作，如高聚物-鹽、高聚物-高聚物、表面活性劑、離子液體等組成的雙水相體系。綜上，清-濁點(diǎn)輔助相圖制作法作為一種新型雙水相系統(tǒng)相圖制作方法，可以用于與雙水相萃取相關(guān)的實(shí)驗(yàn)教學(xué)、科研及生產(chǎn)等領(lǐng)域。

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A Novel Method for Construction Aqueous Two-phase System Phase Diagram: Clear-cloud Points Aid Phase Diagram Establishment

GAOXiangyang1,MUHongtao2,FANGYin3

(1. Food College, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China； 2. College of Biological and Food Engineering, Guangdong Education Institute, Guangzhou 510303, China; 3. Public Basic Course Experimental Teaching Center, South China Agrical Telrel University, Guangzhou 510510, China)

Phase diagrams are essential and important in the application of aqueous two-phase extraction technology. Conventional methods in the determination of phase boundaries are inaccurate, complicated and time consuming. In this paper, we proposed a novel method to overcome these imperfections. Using adjustable-volume pipettes and pipette calibration method, the method proposed could steadily provide accurate phase diagrams in a short time. It was tested in the phase diagram of PEG/(NH4)2SO4, and the result showed extensive reliability. This method can be used in area of experiment teaching, scientific research, and industrial manufacture which related to aqueous two-phase extraction technology.

clear-cloud points aid phase diagram establishment; bimodal; microtitration; PEG/(NH4)2SO4aqueous two-phase extraction system

2016-05-13

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(6130425);華南農(nóng)業(yè)大學(xué)校級教學(xué)改革項(xiàng)目(JG14110)

高向陽(1966-)，女，湖南麻陽人，博士，副教授，研究方向：食品生物化學(xué)。Tel.:13310896601;E-mail:xin-198310@163.com

1006-7167(2017)03-0016-04

TP 212

A