氯化鋰對(duì)移植到周圍神經(jīng)內(nèi)神經(jīng)干細(xì)胞的影響

張立群， 張文明， 劉志峰， 藍(lán)文彬， 林建華

氯化鋰對(duì)移植到周圍神經(jīng)內(nèi)神經(jīng)干細(xì)胞的影響

張立群， 張文明， 劉志峰， 藍(lán)文彬， 林建華

目的 研究氯化鋰對(duì)移植到脛神經(jīng)內(nèi)的神經(jīng)干細(xì)胞的存活、分化的影響；研究神經(jīng)干細(xì)胞移植和氯化鋰處理對(duì)宿主神經(jīng)軸突潰變、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)的影響。 方法 結(jié)扎成年大鼠右側(cè)脛神經(jīng)，將培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞注射到結(jié)扎部位遠(yuǎn)端，腹腔注射氯化鋰或生理鹽水，1周后用免疫熒光染色方法檢測(cè)神經(jīng)干細(xì)胞的巢蛋白(Nestin)、神經(jīng)核抗原(NeuN)、膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(ChAT)、膠質(zhì)細(xì)胞原纖維酸性蛋白質(zhì)(GFAP)、神經(jīng)纖絲蛋白200(NF200)、巨噬細(xì)胞抗原(ED1)的表達(dá)情況。 結(jié)果 移植到脛神經(jīng)內(nèi)的神經(jīng)干細(xì)胞存活良好，并沿神經(jīng)軸索間隙向周圍擴(kuò)散。移植后的神經(jīng)干細(xì)胞未見Nestin陽性表達(dá)，大部分移植細(xì)胞呈GFAP陽性表達(dá)，無NeuN或ChAT陽性表達(dá)。腹腔注射氯化鋰能顯著減少移植細(xì)胞的GFAP陽性表達(dá)比例。脛神經(jīng)結(jié)扎后，神經(jīng)內(nèi)軸突潰變明顯。與未移植神經(jīng)干細(xì)胞組比較，移植組脛神經(jīng)內(nèi)NF200陽性表達(dá)明顯增多，聯(lián)合應(yīng)用氯化鋰能進(jìn)一步增加NF200的表達(dá)。應(yīng)用氯化鋰能顯著減少神經(jīng)干細(xì)胞移植后脛神經(jīng)內(nèi)的ED1表達(dá)。 結(jié)論 氯化鋰能減少移植后的神經(jīng)干細(xì)胞向膠質(zhì)細(xì)胞方向的分化，神經(jīng)干細(xì)胞移植聯(lián)合應(yīng)用氯化鋰可以減少宿主神經(jīng)軸突的潰變程度，同時(shí)能抑制神經(jīng)干細(xì)胞移植后的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。

氯化鋰； 神經(jīng)系統(tǒng)/*細(xì)胞學(xué)； 干細(xì)胞； 移植； 周圍神經(jīng)系統(tǒng)疾病

神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cell, NSC)具有多項(xiàng)分化潛能，已經(jīng)成為中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病或損傷時(shí)細(xì)胞替代治療的重要組成部分。在脊髓損傷后，移植NSC也是脊髓損傷研究的重要方向[1]。由于脊髓損傷后局部環(huán)境不適合NSC生存，需要采用合適的方法保護(hù)NSC，增加移植后NSC的存活率，提高治療效果。在周圍神經(jīng)損傷研究中，采用NSC移植修復(fù)周圍神經(jīng)損傷已取得較好的研究結(jié)果[2-4]。以周圍神經(jīng)作為NSC的載體，在脊髓損傷后移植攜帶有NSC的周圍神經(jīng)，有可能提高NSC的存活率，體現(xiàn)NSC的治療作用。

研究表明，氯化鋰能促進(jìn)體外培養(yǎng)NSC的增殖，并抑制其分化[5]。同時(shí)也發(fā)現(xiàn)氯化鋰能促進(jìn)移植到脊髓內(nèi)的NSC的增殖[6]，但氯化鋰對(duì)移植到周圍神經(jīng)內(nèi)的NSC的影響尚不明確。本研究擬將NSC移植到結(jié)扎后的脛神經(jīng)內(nèi)，觀察移植后NSC的存活、分化情況，研究氯化鋰對(duì)NSC和移植神經(jīng)的影響，為下一步將攜帶有NSC的脛神經(jīng)移植治療脊髓損傷打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)轉(zhuǎn)基因雄性SD大鼠由香港大學(xué)醫(yī)學(xué)院吳武田教授贈(zèng)送。健康雌性SD大鼠48只，體質(zhì)量(250±20)g[上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司中心提供，許可證號(hào)：SCXK(滬)2007-0005]。

1.1.2 試劑 堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)、表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor，EGF,美國(guó)PeproTech公司)；DMEM/F12，B-27，N-2及Accutase消化酶(美國(guó)Invitrogen公司);小鼠抗Nestin抗體、小鼠抗NeuN抗體、小鼠抗膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(cholin acetyltransferase，ChAT)抗體(美國(guó)Millipore公司);氯化鋰、兔抗GFAP、小鼠抗NF200抗體(美國(guó)Sigma公司)；小鼠抗ED1抗體(美國(guó)Serotec公司)。

1.2 方法

1.2.1 GFP轉(zhuǎn)基因大鼠胚胎脊髓來源NSC的獲取和培養(yǎng) 在清潔飼養(yǎng)環(huán)境下，將GFP轉(zhuǎn)基因雄性SD大鼠與普通雌性SD大鼠同籠飼養(yǎng)，取懷孕13.5 d雌鼠，用10%水合氯醛(0.4 mL/100 g)腹腔注射麻醉后消毒腹部，在無菌條件下取出子宮和胚胎，在熒光解剖顯微鏡下挑選攜帶GFP基因的胚胎。在解剖顯微鏡下取出胚胎脊髓，剝除脊膜和神經(jīng)根，剪成1 mm2大小碎塊，用Accutase消化酶將脊髓分解成單細(xì)胞懸液，植入多聚賴氨酸包被的培養(yǎng)皿，用含有bFGF,EGF，B-27及N-2的DMEM/F12培養(yǎng)液培養(yǎng)。當(dāng)原代NSC生長(zhǎng)到80%匯合時(shí)，消化后傳代培養(yǎng)。收獲傳代后的細(xì)胞，根據(jù)細(xì)胞計(jì)數(shù)加入適量培養(yǎng)液，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105μL-1用于神經(jīng)內(nèi)注射。

1.2.2 脛神經(jīng)內(nèi)注射NSC 將大鼠用10%水合氯醛(0.3 mL/100 g)腹腔注射麻醉后固定于手術(shù)臺(tái)上，右側(cè)臀部及大腿后側(cè)皮膚脫毛消毒。于右側(cè)臀部及大腿后側(cè)作2.5 cm長(zhǎng)斜切口，切開皮膚，沿肌肉間隙分離，顯露坐骨神經(jīng)，在手術(shù)顯微鏡下分離脛神經(jīng)和腓總神經(jīng)。在坐骨神經(jīng)分叉處稍遠(yuǎn)端，用顯微鑷垂直于脛神經(jīng)干壓榨脛神經(jīng)10 s，在手術(shù)顯微鏡下見脛神經(jīng)軸索完全中斷，僅保留一層完整透明的神經(jīng)外膜，壓榨處用11-0顯微縫線結(jié)扎。在脛神經(jīng)結(jié)扎處遠(yuǎn)端約7 mm，將顯微注射器針頭逆行刺入脛神經(jīng)約4 mm，緩慢注入NSC 1 μL，留針2 min后再緩慢注入NSC 1 μL，留針2 min，將針頭緩緩?fù)顺?，針眼再壓? min。用11-0顯微縫線縫合神經(jīng)穿刺口，逐層縫合關(guān)閉切口。

在脛神經(jīng)結(jié)扎后，將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為生理鹽水注射組(normal saline, NS組)，氯化鋰注射組(Li組)，NSC移植+生理鹽水注射組(NSC+NS組)，NSC移植+氯化鋰注射組(NSC+Li組)。每組10只，分別于手術(shù)次日開始腹腔注射氯化鋰(85 mg/kg)或生理鹽水(2 mL/100 g)，持續(xù)1周。

注射NSC后1周，將大鼠用10%水合氯醛(0.5 mL/100 g)深度麻醉，打開胸腔，自心尖部向主動(dòng)脈方向插入針頭達(dá)升主動(dòng)脈，灌注150 mL 0.01 mmol/L PBS后再灌注300 mL 4%多聚甲醛(0.1 mol/L，pH=7.4)，隨后在解剖顯微鏡下取出移植有NSC的脛神經(jīng)段，4%多聚甲醛固定24 h后移入30%蔗糖溶液保存。

1.2.3 脛神經(jīng)標(biāo)本的包埋和冰凍切片 每組2例標(biāo)本以注射部位為中心取3 mm長(zhǎng)的脛神經(jīng)段，包埋冷凍后按20 μm厚度進(jìn)行連續(xù)橫斷冰凍切片；其余標(biāo)本以注射部位為中心取6 mm長(zhǎng)的脛神經(jīng)段，包埋冷凍后按20 μm厚度沿脛神經(jīng)長(zhǎng)軸進(jìn)行連續(xù)縱行切片。

1.2.4 免疫熒光染色和圖像分析 標(biāo)本取材切片后，將切片漂洗、10%山羊血清封閉，加入一抗4 ℃孵育過夜。次日根據(jù)一抗類型加入相應(yīng)的熒光二抗，室溫下避光孵育1 h。封片后，每例標(biāo)本選取5張切片，在熒光顯微鏡下拍攝各組染色照片。用Image J軟件測(cè)量每幅圖像內(nèi)各組陽性染色面積，計(jì)算染色范圍的比例。

2 結(jié) 果

2.1 GFP轉(zhuǎn)基因大鼠胚胎脊髓來源NSC的培養(yǎng)與鑒定 培養(yǎng)的NSC在多聚賴氨酸包被的培養(yǎng)皿上呈單層貼壁生長(zhǎng)。培養(yǎng)第4～5天時(shí)細(xì)胞密度進(jìn)一步增加，NSC發(fā)出的軸突相互交織呈網(wǎng)狀。傳代培養(yǎng)后，在倒置熒光顯微鏡下觀察，可見所有的細(xì)胞都呈綠色，說明培養(yǎng)的細(xì)胞均攜帶GFP基因，經(jīng)過免疫熒光染色，表達(dá)Nestin蛋白的細(xì)胞在熒光顯微鏡下顯示為紅色，經(jīng)過圖片融合處理后，見絕大多數(shù)細(xì)胞呈黃色，說明培養(yǎng)的細(xì)胞大多為NSC(圖1)。經(jīng)計(jì)數(shù)，Nestin陽性細(xì)胞的比例為(81.0±9.8)%。

2.2 脛神經(jīng)內(nèi)移植的NSC的遷移情況 脛神經(jīng)內(nèi)注射1周后，NS組和Li組移植的NSC在脛神經(jīng)內(nèi)均存活良好。在脛神經(jīng)縱切片上，NSC沿注射方向在脛神經(jīng)內(nèi)縱行排列，并沿著軸突間隙向兩端擴(kuò)散。在橫切片上，NSC在注射部位聚集成團(tuán)，部分細(xì)胞沿軸索間隙向周圍呈蟹爪樣擴(kuò)散蔓延(圖2)。

2.3 脛神經(jīng)內(nèi)移植的NSC的分化情況

2.3.1 脛神經(jīng)內(nèi)NSC的Nestin表達(dá)情況 NSC移植到脛神經(jīng)內(nèi)1周后，移植的細(xì)胞有明顯的GFP陽性表達(dá)，但對(duì)照組和Li組均未見明顯的Nestin陽性染色(圖3A)，提示移植后的NSC可能已分化為Nestin表達(dá)陰性的細(xì)胞。

2.3.2 脛神經(jīng)內(nèi)NSC分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞的情況 NSC移植到脛神經(jīng)內(nèi)1周后， 對(duì)照組和Li組移植的NSC均未見明顯的NeuN(圖3B)或ChAT(圖3C)陽性染色，提示移植后的NSC未分化為NeuN或ChAT陽性的神經(jīng)元。

2.3.3 脛神經(jīng)內(nèi)NSC分化為膠質(zhì)細(xì)胞的情況 移植NSC到脛神經(jīng)內(nèi)1周后，經(jīng)過GFAP染色，可見對(duì)照組和Li組均有大量的GFAP陽性染色。GFAP陽性染色區(qū)域基本在GFP著色范圍內(nèi)。對(duì)照組絕大多數(shù)的GFAP染色區(qū)域與GFP染色區(qū)域重疊;Li組GFAP陽性表達(dá)區(qū)域范圍較小，與GFP染色區(qū)域重疊部分也較少(圖4)。

分別測(cè)量GFAP和GFP染色區(qū)域的面積，計(jì)算GFAP染色面積占GFP染色面積的比例，對(duì)照組和Li組分別為(86.7±13.8)%和(69.8±8.2)%。Li組GFAP陽性面積比例小于對(duì)照組,差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖4)。

2.3.4 脛神經(jīng)軸突潰變情況 脛神經(jīng)結(jié)扎后1周，各組均有明顯的軸突潰變。NS組NF200染色陽性的殘留軸突呈顆粒狀，散在分布；Li組殘留軸突情況與前者相似；NSC+NS組的殘留軸突呈顆粒狀或短棒狀，數(shù)量較多；NSC+Li組的殘留軸突數(shù)量最多(圖5)。

GFP：綠色熒光蛋白；Nestin：巢蛋白. A：傳代培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞；B：Nestin陽性的細(xì)胞呈紅色；C：融合后的圖片.圖1 神經(jīng)干細(xì)胞的體外培養(yǎng)和鑒定( ×20)Fig 1 The growth and identification of cultured neural stem cells( ×20)

A, B：對(duì)照組脛神經(jīng)縱向和橫斷切片；C, D：氯化鋰組脛神經(jīng)縱向和橫斷切片.圖2 移植到脛神經(jīng)內(nèi)的神經(jīng)干細(xì)胞的存活和遷移情況( ×10)Fig 2 The survival and migration of transplanted NSCs in tibial nerve( ×10)

A：巢蛋白；B：神經(jīng)核抗原；C：膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶.圖3 脛神經(jīng)內(nèi)移植的神經(jīng)干細(xì)胞Nestin，NeuN和ChAT的表達(dá)情況( ×10)Fig 3 The expression of Nestin, NeuN and ChAT of transplanted NSCs in tibial nerve( ×10)

用Image J軟件測(cè)量NF 200陽性染色占每個(gè)拍照視野的比例，各組的NF200陽性染色的覆蓋率分別為：NS組(2.46±0.60)%，Li組(2.64±0.85)%，NSC+NS組(3.94±0.79)%，NSC+Li組(5.83±0.95)%。經(jīng)過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，NS組和Li組的NF200覆蓋率比較，差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；NSC+NS組和NSC+Li組的NF200陽性覆蓋率顯著高于前兩組(P<0.01)，NSC+Li組的殘留軸突覆蓋率也高于NSC+NS組(P<0.05，圖5C)。

2.4 脛神經(jīng)內(nèi)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)情況 實(shí)驗(yàn)1周后，NSC+NS組和NSC+Li組均可見到ED1陽性染色的巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)。巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)范圍除了見于移植的NSC周圍外，也見于脛神經(jīng)內(nèi)的其他部位。NSC+NS組和NSC+Li組單位視野內(nèi)平均ED1陽性表達(dá)面積分別是(8.97±4.07)%和(6.31±2.78)%，NSC+NS組巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)明顯多于NSC+Li組，二者差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，圖6)，提示氯化鋰對(duì)脛神經(jīng)切斷及NSC移植后引起的炎癥反應(yīng)有抑制作用。

3 討 論

脊髓損傷后應(yīng)用周圍神經(jīng)移植來修復(fù)和促進(jìn)脊髓功能的恢復(fù)在不同的動(dòng)物模型上都取得一定的效果，但也存在再生軸突無法通過遠(yuǎn)端移植物-宿主界面的情況[7]。研究發(fā)現(xiàn),在脊髓損傷后移植預(yù)退變的周圍神經(jīng)(切斷后留在原位7～10 d)比移植新鮮切斷的神經(jīng)有更多的再生軸突長(zhǎng)入[8-9]。此外，在周圍神經(jīng)損傷后移植NSC，能不同程度地促進(jìn)損傷神經(jīng)的再生。Heine在脛神經(jīng)切斷的遠(yuǎn)端神經(jīng)移植轉(zhuǎn)染GDNF的NSC，4月后移植的NSC能促進(jìn)新生軸突的形成[3]。Su的研究發(fā)現(xiàn)，在臂叢神經(jīng)根性損傷后，在肌皮神經(jīng)內(nèi)移植NSC，12周后移植的NSC可以分化為神經(jīng)元，表達(dá)NF200和ChAT，并能發(fā)出軸突與肌肉形成有功能的突觸聯(lián)系[10]。Gu在周圍神經(jīng)損傷后移植攜帶有NSC的神經(jīng)段，4周后NSC可分化為神經(jīng)元和小膠質(zhì)細(xì)胞，并與再生軸突產(chǎn)生突觸聯(lián)系[11]。以上研究提示，在脊髓損傷后移植攜帶NSC的周圍神經(jīng)段可能對(duì)受損脊髓的軸突再生有促進(jìn)作用。研究表明，氯化鋰能促進(jìn)體外培養(yǎng)NSC的增殖，并抑制其分化[5]；保護(hù)小腦神經(jīng)前體細(xì)胞免于凋亡[12]，促進(jìn)大鼠脊髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖和向神經(jīng)元方向分化[13]，也能促進(jìn)移植到脊髓內(nèi)的NSC的增殖[6]。如果氯化鋰對(duì)移植到周圍神經(jīng)內(nèi)的NSC也有類似的作用，則對(duì)脊髓損傷后的修復(fù)和軸突再生則更有意義。

GFP：綠色熒光蛋白; NeuN：神經(jīng)核抗原; ChAT：膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶. A～C：對(duì)照組，D～F：氯化鋰組，箭頭顯示GFAP陰性區(qū)域; G：2組GFAP陽性染色區(qū)域比例比較. 與對(duì)照組比較，☆：P<0.05.圖4 脛神經(jīng)內(nèi)移植的神經(jīng)干細(xì)胞GFAP表達(dá)情況( ×10)Fig 4 The expression of GFAP of NSCs in tibial nerve after transplantation( ×10)

NSC:神經(jīng)干細(xì)胞; GFP：綠色熒光蛋白；NF200：神經(jīng)纖絲蛋白200. NS:生理鹽水注射組； Li：氯化鋰注射組; NSC+NS組：NSC移植+生理鹽水注射組； NSC+Li組：NSC移植+氯化鋰注射組. A：NS組；B：Li組；D～F：NSC +NS組；G～I(xiàn)：NSC+Li組; C：各組NF200陽性染色覆蓋率的比較，與NS組、Li組比較，☆：P<0.01； 與NSC+NS組比較，#：P<0.05.圖5 脛神經(jīng)結(jié)扎后1周各組軸突潰變情況( ×20)Fig 5 The axonal degeneration of tibial nerve in different groups( ×20)

GFP：綠色熒光蛋白； ED1：巨噬細(xì)胞抗原. A～C：對(duì)照組； D～E：氯化鋰組. A, D：GFP標(biāo)記的神經(jīng)干細(xì)胞； B, E：脛神經(jīng)內(nèi)ED1的表達(dá)情況； C, F：融合后的圖片； G：脛神經(jīng)內(nèi)ED1的表達(dá)情況比較. 與對(duì)照組比較，☆：P<0.05.圖6 氯化鋰對(duì)移植后神經(jīng)干細(xì)胞的脛神經(jīng)內(nèi)ED1表達(dá)的影響( ×10)Fig 6 The expression of ED1 in tibial nerve after NSC injection( ×10)

本實(shí)驗(yàn)中，移植到脛神經(jīng)內(nèi)的NSC存活良好，并能沿著神經(jīng)軸索間隙向注射部位兩端及周圍遷移擴(kuò)散。經(jīng)過氯化鋰處理后，移植1周后的NSC Nestin表達(dá)陰性，未見分化為NF200,NeuN或ChAT陽性的神經(jīng)元，而大多數(shù)的NSC分化為GFAP陽性的膠質(zhì)細(xì)胞，還有一部分GFAP陰性的細(xì)胞，與上述作者的結(jié)果不完全一致。造成這種結(jié)果的原因可能是：(1)周圍神經(jīng)內(nèi)的環(huán)境更傾向于促進(jìn)NSC向膠質(zhì)細(xì)胞方向分化。周圍神經(jīng)損傷后，神經(jīng)遠(yuǎn)端出現(xiàn)Wallerian變性，軸突潰變，髓鞘崩解，大量雪旺細(xì)胞增殖[14]。雪旺細(xì)胞分泌大量的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子以促進(jìn)損傷神經(jīng)的修復(fù)，包括NGF，NT-3，BDNF，GDNF，CNTF，GGF，LIF等[15]。雖然BDNF對(duì)NSC向神經(jīng)元方向分化有促進(jìn)作用，但周圍神經(jīng)損傷后，損傷神經(jīng)內(nèi)還有大量其他細(xì)胞以及各種因子對(duì)NSC的作用尚不明確，有可能影響NSC向膠質(zhì)細(xì)胞方向分化。(2)本實(shí)驗(yàn)中，氯化鋰干預(yù)的時(shí)間較短，對(duì)促進(jìn)NSC向神經(jīng)元方向分化的影響可能受到時(shí)間的限制，而上述實(shí)驗(yàn)均在移植后數(shù)月觀察結(jié)果。在本實(shí)驗(yàn)條件下，短時(shí)間內(nèi)局部環(huán)境下BDNF含量的提高可能尚不足以扭轉(zhuǎn)其他細(xì)胞或因子對(duì)NSC的影響，如果延長(zhǎng)氯化鋰的干預(yù)時(shí)間，局部微環(huán)境進(jìn)一步改善，氯化鋰有可能促進(jìn)NSC向神經(jīng)元分化。此外，NeuN及ChAT都是成熟神經(jīng)元表達(dá)的蛋白，本實(shí)驗(yàn)中還有一部分GFAP陰性的細(xì)胞，可能有分化為神經(jīng)元的傾向，表達(dá)一些其他早期神經(jīng)元標(biāo)志物。(3)移植的NSC可能分化為其他細(xì)胞。Sekiguchi發(fā)現(xiàn)，將NSC移植到損傷的坐骨神經(jīng)損傷內(nèi)，發(fā)現(xiàn)雌激素可以促進(jìn)NSC分化為內(nèi)皮細(xì)胞[16]。而NSC和肌細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，可分化為肌細(xì)胞，表達(dá)肌球蛋白[17]。本實(shí)驗(yàn)中，GFAP陰性的細(xì)胞有可能分化為其他細(xì)胞。目前NSC在周圍神經(jīng)內(nèi)的分化情況及其機(jī)制仍不明確，需要進(jìn)一步研究。

此外，移植的NSC和氯化鋰對(duì)供體神經(jīng)的退變也有影響。在周圍神經(jīng)損傷后，神經(jīng)遠(yuǎn)端出現(xiàn)Wallerian變性，軸突潰變，髓鞘崩解，大量巨噬細(xì)胞進(jìn)入神經(jīng)內(nèi)，清除髓鞘和軸突碎片，為神經(jīng)再生提供條件。本實(shí)驗(yàn)中，未移植NSC的脛神經(jīng)遠(yuǎn)端明顯潰變，殘留軸突呈顆粒狀，Li組和NS組的軸突潰變情況沒有顯著差別,說明在脛神經(jīng)損傷后1周，軸突潰變基本完成，氯化鋰可能不影響巨噬細(xì)胞清除髓鞘和軸突碎片的作用。在損傷的周圍神經(jīng)內(nèi)移植NSC以及NSC移植聯(lián)合應(yīng)用氯化鋰后，殘留的軸突呈短棒狀或顆粒狀，明顯多于未移植NSC的對(duì)照組,提示NSC移植對(duì)脛神經(jīng)損傷有明顯的保護(hù)修復(fù)作用，聯(lián)合應(yīng)用氯化鋰后保護(hù)作用更明顯。研究顯示,NSC可以抑制軸突潰變后產(chǎn)生的硫酸軟骨素蛋白聚糖[3]，而鋰也可以通過抑制GSK-3間接抑制硫酸軟骨素蛋白發(fā)揮軸突保護(hù)作用[18]。

氯化鋰減輕軸突損傷的作用可能與抑制炎癥反應(yīng)有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，脊髓內(nèi)移植NSC，氯化鋰能減輕移植后宿主脊髓的炎癥反應(yīng)[6]。本研究中，NSC+Li組的ED1表達(dá)量少于NSC+NS組，提示NSC移植和氯化鋰對(duì)神經(jīng)損傷后的炎癥反應(yīng)有抑制作用。研究發(fā)現(xiàn)，鋰可以通過抑制GSK-3減輕實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎表現(xiàn)[19]，通過抑制脂多糖或肌醇單磷酸酶對(duì)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生抑制作用[20-21]。Ben-Hur發(fā)現(xiàn),大腦內(nèi)移植的NPC可以通過抑制T細(xì)胞而減輕化學(xué)物質(zhì)引起的急慢性腦脊髓炎[22]。Busch也發(fā)現(xiàn)多能干細(xì)胞能顯著減少巨噬細(xì)胞分泌基質(zhì)金屬蛋白酶-9，將巨噬細(xì)胞由致炎狀態(tài)轉(zhuǎn)化為抗炎狀態(tài)來抑制炎癥反應(yīng)，減少軸突頂端壞死[23]。在移植有NSC的周圍神經(jīng)中，氯化鋰有可能通過類似機(jī)制來抑制宿主神經(jīng)的炎癥反應(yīng)。

總之，本實(shí)驗(yàn)初步觀察到氯化鋰對(duì)移植到周圍神經(jīng)內(nèi)NSC分化、以及宿主神經(jīng)軸突的潰變和炎癥反應(yīng)的影響。但由于觀察時(shí)間較短，遠(yuǎn)期影響及其機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

[1] Tetzlaff W,Okon E B,Karimi-Abdolrezaee S,etal. A systematic review of cellular transplantation therapies for spinal cord injury[J].JNeurotrauma,2011,28(8):1611-1682.

[2] Cheng L N,Duan X H,Zhong X M,etal. Transplanted neural stem cells promote nerve regeneration in acute peripheral nerve traction injury: assessment using MRI[J].AmericanJRoentgenology,2011,196(6):1381-1387.

[3] Heine W,Conant K,Griffin J W,etal. Transplanted neural stem cells promote axonal regeneration through chronically denervated peripheral nerves[J].ExpNeurol,2004,189(2):231-240.

[4] Dong M M,Yi T H. Stem cell and peripheral nerve injury and repair[J].FacialPlasticSurgery,2010,26(5):421-427.

[5] 景秀京,楊繼飛,張 建,等. 氯化鋰對(duì)培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞增殖分化的影響及其機(jī)制研究[J]. 中國(guó)康復(fù)理論與實(shí)踐,2007,13(9):850-852.

[6] Su H,Chu T H,Wu W. Lithium enhances proliferation and neuronal differentiation of neural progenitor cellsinvitroand after transplantation into the adult rat spinal cord[J].ExpNeurol,2007,206(2):296-307.

[7] Cote M P,Amin A A,Tom V J,etal. Peripheral nerve grafts support regeneration after spinal cord injury[J].Neurotherapeutics,2011,8(2):294-303.

[8] Kerns J M,Danielsen N,Holmquist B,etal. The influence of predegeneration on regeneration through peripheral nerve grafts in the rat[J].ExpNeurol,1993,122(1):28-36.

[9] Oudega M,Varon S,Hagg T. Regeneration of adult rat sensory axons into intraspinal nerve grafts: promoting effects of conditioning lesion and graft predegeneration[J].ExpNeurol,1994,129(2):194-206.

[10] Su H,Zhang W,Yang X,etal. Neural progenitor cells generate motoneuron-like cells to form functional connections with target muscles after transplantation into the musculocutaneous nerve[J].CellTransplant,2012,21(12):2651-2663.

[11] Gu S H,Xu W D,Xu L,etal. Regenerated host axons form synapses with neurons derived from neural stem cells transplanted into peripheral nerves[J].JIntMedRes,2010,38(5):1721-1729.

[12] Cabrera O,Dougherty J,Singh S,etal. Lithium protects against glucocorticoid induced neural progenitor cell apoptosis in the developing cerebellum[J].BrainRes,2014,1545(1):54-63.

[13] Dong B T,Tu G J,Han Y X,etal. Lithium enhanced cell proliferation and differentiation of mesenchymal stem cells to neural cells in rat spinal cord[J].IntJClinExpPathol,2015,8(3):2473-2483.

[14] Gaudet A D,Popovich P G,Ramer M S. Wallerian degeneration: gaining perspective on inflammatory events after peripheral nerve injury[J].JNeuroinflammation,2011,8(1):110-122.

[15] Terenghi G. Peripheral nerve regeneration and neurotrophic factors[J].JAnatomy,1999,194(Pt 1): 1-14.

[16] Sekiguchi H,Ii M,Jujo K,etal. Estradiol promotes neural stem cell differentiation into endothelial lineage and angiogenesis in injured peripheral nerve[J].Angiogenesis,2013,16(1):45-58.

[17] Rietze R L,Valcanis H,Brooker G F,etal. Purification of a pluripotent neural stem cell from the adult mouse brain[J].Nature,2001,412(6848):736-739.

[18] Dill J,Wang H,Zhou F,etal. Inactivation of glycogen synthase kinase 3 promotes axonal growth and recovery in the CNS[J].JNeurosci,2008,28(36):8914-8928.

[19] De Sarno P,Axtell R C,Raman C,etal. Lithium prevents and ameliorates experimental autoimmune encephalomyelitis[J].JImmunol,2008,181(1):338-345.

[20] de Meyer I,Martinet W,van Hove C E,etal. Inhibition of inositol monophosphatase by lithium chloride induces selective macrophage apoptosis in atherosclerotic plaques[J].BrJPharmacol,2011,162(6):1410-1423.

[21] Zhang M,Jin W,Zhou X,etal. Deregulation of Tpl2and NF-kappaB signaling and induction of macrophage apoptosis by the anti-depressant drug lithium[J].CellSignal,2009,21(4):559-566.

[22] Ben-Hur T. Immunomodulation by neural stem cells[J].JNeurologicalSciences,2008,265(1-2): 102-104.

[23] Busch S A,Hamilton J A,Horn K P,etal. Multipotent adult progenitor cells prevent macrophage-mediated axonal dieback and promote regrowth after spinal cord injury[J].JNeurosci,2011,31(3):944-953.

(編輯:張慧茹)

《福建醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)》

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The Effect of Lithium Chloride on NSC Transplanted into Peripheral Nerve

ZHANG Liqun, ZHANG Wenming, LIU Zhifeng, LAN Wenbin, LIN Jianhua

Department of Orthopedics, The First Affiliated Hospital of Fujian Medical University, Fuzhou 350005, China

Objective To investigate the effect of lithium chloride on the survival and differentiation of neural stem cells (NSCs) after transplanted into rat tibial nerve, and the effect of transplanted NSCs with lithium treatment on the axonal degeneration and inflammatory cell infiltration in host tibial nerve. Methods The right tibial nerve of adult rat was ligated, and the dissociated NSCs were injected into distal dump of tibial nerve, followed by intraperitoneal injection of either lithium or normal saline for one week. After that, the expression of Nestin, NeuN, choline acetyltransferase (ChAT), glial fibrillary acidic protein (GFAP) in transplanted NSCs, the expression of neurofilament 200 kD (NF200), and macrophages marker ED1 in host tibial nerve were studied. Results One week after transplantation, transplanted NSCs survived well and migrated from injection site to surrounding tissue through axon interspace. There was no obvious expression of Nestin, NeuN, and ChAT in transplanted NSCs, while most of the transplanted NSCs had GFAP expression. The lithium injection significantly reduced the expression of GFAP in the transplanted NSCs. After tibial nerve ligation, most of the axons degenerated. The animal that received NSC transplantation had more NF200 positive residual axons, compared to control group without NSC, and lithium injection enhance the expression of NF200. Lithium also reduces ED1 expression in tibial nerve after NSC transplantation. Conclusion Transplanted NSCs can survived well in tibial nerve, and most of the NSCs differentiated into GFAP positive glia. Lithium injection may reduce the GFAP differentiation of transplanted NSCs and inhibite macrophage infiltration after NSC transplantation.

lithium chloride； nervous system/*cytology； stem cells； transplantation； peripheral nervous system diseases

2016-08-03

福建省自然科學(xué)基金(2015J01458)；福建省衛(wèi)生教育聯(lián)合攻關(guān)計(jì)劃(WKJ-FJ-08);福建省臨床重點(diǎn)?？平ㄔO(shè)項(xiàng)目(閩衛(wèi)科教[2012]149號(hào))

福建醫(yī)科大學(xué) 附屬第一醫(yī)院骨科，福州 350005

張立群，男，副主任醫(yī)師，醫(yī)學(xué)博士. Email:zhanglq89@126.com

R329.24； R651.3； R916.3

A

1672-4194(2017)01-0017-07