超聲波輔助提取茶葉總黃酮及抗氧化活性分析

呂名秀，高玉梅，董雪茹，強黎明，李玲玲

(河南工程學院 材料與化學工程學院，河南 鄭州 450007)

超聲波輔助提取茶葉總黃酮及抗氧化活性分析

呂名秀*，高玉梅，董雪茹，強黎明，李玲玲

(河南工程學院 材料與化學工程學院，河南 鄭州 450007)

采用超聲波輔助法探討了鐵觀音茶葉中總黃酮的最佳提取工藝條件，并測定了鐵觀音茶葉總黃酮清除羥基自由基的能力. 結果表明，超聲波功率400 W，料液比1∶30 g·mL-1，浸提時間30 min，乙醇濃度50%為超聲波輔助提取鐵觀音茶葉總黃酮的最佳工藝條件，總黃酮提取率為4.74%；抗氧化實驗表明隨著鐵觀音茶葉總黃酮濃度的增大，其對羥基自由基的清除能力增大，當濃度達到0.80 g/L，清除率為65.14%，與BHT相比具有較強的抗氧化能力.

茶葉；總黃酮；超聲波；抗氧化活性

茶葉是重要的世界性作物之一，廣泛分布于亞洲、遠東、拉美和大洋洲等地[1]. 它是世界上僅次于水的第二大飲品. 據(jù)FAO-IGG統(tǒng)計，2015年全球茶葉產(chǎn)量達到528.5萬噸. 2010年以來，中國茶葉產(chǎn)量持續(xù)增長，2015年已達到227.8萬噸，穩(wěn)居世界第一產(chǎn)茶國的地位[2-3]. 茶葉中所含的成分很多，將近500種. 人們熟知的幾種重要成分有茶多酚、黃酮類化合物、維生素C、咖啡堿、蛋白質(zhì)等[4]. 另外，茶葉中還含有許多人體必需的微量元素，如鈣、鐵、鋅、鎂、碘、氟、錳、鉬、硒、鍺等[5-6].

許多文獻報道，茶葉具有良好的抗氧化能力[7]，能抑制活性氧的形成，有效清除自由基[8]，這與其含有多種抗氧化物有關，如黃酮、兒茶素、茶黃素、沒食子酸等[9]. 黃酮有很多的藥理作用，已被廣泛的應用于醫(yī)學的臨床治療[10-13]. 黃酮具有降血壓、防止動脈硬化、降血脂、清熱解毒、抗氧化、強化細胞膜、活化細胞等功效[7]. 隨著患有腫瘤疾病人數(shù)的增多，現(xiàn)代醫(yī)學對黃酮的需求越來越大. 茶葉在全球分布廣泛，且茶葉中總黃酮含量較高[14]. 另外，市場上使用的食品抗氧化劑大多是通過化學實驗合成品(如 BHT)，存在食品安全性問題. 而天然抗氧化劑具有安全、無毒等優(yōu)點[15].

以茶葉為原料，從茶葉中提取黃酮，既可滿足于當代醫(yī)學上、食品添加劑及化妝品對黃酮的需求，又使得茶葉得到廣泛的開發(fā)利用，因此探索提取茶葉黃酮的工藝研究具有良好的經(jīng)濟效益和社會效益. 目前，超聲波提取法在天然產(chǎn)物中有效成分的提取上表現(xiàn)出較強的優(yōu)勢：提取速度快、提取效率高、節(jié)約溶劑、低溫進行(40～60 ℃)、操作簡單易行、提取料液雜質(zhì)少等[16-18]，與傳統(tǒng)提取法相比，超聲波提取法是一種實現(xiàn)快速、高效、環(huán)保、節(jié)能的現(xiàn)代新技術. 本研究將通過單因素實驗和正交試驗，確定超聲波輔助法提取鐵觀音茶葉總黃酮的最佳工藝條件，同時對茶葉總黃酮進行抗氧化活性分析，為茶葉的綜合開發(fā)利用提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鐵觀音茶葉購于福建省安溪縣寶隆茶業(yè)有限公司；蘆丁標準品 購于南京蘇朗醫(yī)藥科技開發(fā)有限公司；無水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、鄰二氮菲、七水合硫酸亞鐵、2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)、鹽酸、雙氧水等均為分析純試劑.

XH-300 UL電腦微波超聲波紫外光組合催化合成儀，北京祥鵠科技發(fā)展有限公司；CP 114型電子天平，奧豪斯儀器(上海)有限公司；UV-3600紫外可見近紅外分光光度計，日本Shimadzu公司；DK-8 AX恒溫水浴槽，上海精密儀器儀表有限公司.

1.2 實驗方法

1.2.1 原料處理

首先要把鐵觀音茶葉粉碎，通過恒溫干燥箱干燥至恒重，封口密封，在干燥處保存. 粉碎過40目篩、烘干至恒重，密封，在干燥處保存?zhèn)溆?

1.2.2 蘆丁標準曲線的繪制

將蘆丁標準品在120℃下恒溫烘干，精密稱取純度為98%的蘆丁標準品10.30 mg，置于10 mL容量瓶中，用60%乙醇溶解，然后用70%乙醇定容至刻度線，搖勻，得到蘆丁標準溶液[15-16]，濃度1.009 4 g/L.

精密吸取蘆丁標準溶液0.00、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60 mL，分別置于10 mL容量瓶中，加60%的乙醇至2.0 mL；加入5%的NaNO2溶液0.4 mL，搖勻放置6 min；然后加入10%的Al(NO3)3溶液0.4 mL，搖勻再放置6 min；再加4.0 mL 5%的NaOH溶液；用70%的乙醇定容，搖晃均勻后等待10 min；最后在波長510 nm處測溶液的吸光度A(見圖1). 重復3次，算其平均值.

圖1 蘆丁標準曲線Fig.1 Standard curve of rutin

1.2.3 茶葉提取物的制備

稱取干燥的茶葉粉末2.00 g，加入60 mL 70%的乙醇于60 ℃水浴鍋中回流提取1 h，抽濾. 濾液定容至100 mL，搖勻備用.

1.2.4 提取茶葉總黃酮的單因素試驗

分別考察了超聲波功率，浸提時間，乙醇的體積分數(shù)，料液比和溫度等五個因素對超聲波輔助法從茶葉中提取總黃酮的最佳工藝，每組試驗重復3次，取平均值作圖.

1.2.5 提取茶葉總黃酮的正交試驗

通過比較每個因素對實驗結果的影響，選取乙醇濃度、超聲波功率、浸提時間及料液比四個因素為考察因素，以茶葉總黃酮提取率為考察指標，設計四因素三水平正交實驗. 根據(jù)正交試驗結果得出茶葉總黃酮提取率最大的工藝條件并進行驗證試驗[19-20]，每個試驗重復3次，取平均值.

1.3 總黃酮提取率的計算方法

測定提取液的吸光度[21-22]，具體方法同1.2.2. 根據(jù)蘆丁標準曲線計算茶葉總黃酮的質(zhì)量濃度ρ，每組試驗重復3次，取平均值，計算茶葉總黃酮的提取率.

1.4 鐵觀音茶葉總黃酮對·OH的清除能力測定

在10 mL容量瓶中依次加入7.5 mmol/L鄰二氮菲溶液1.0 mL，50.0 mmol/L Tris-HCl (pH=7.4)溶液2.0 mL，7.5 mmol/L FeSO4溶液1.0 mL，混勻后，再分別加入鐵觀音茶葉總黃酮濃度為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 g/L的溶液1.0 mL，0.1%的雙氧水1.0 mL，用蒸餾水定容，混合均勻后，置于37 ℃的水浴中保溫1 h，在510 nm處測得Ai，當用蒸餾水替代試樣得到A1，用蒸餾水替代H2O2和試樣得到A0，可排除樣品本身的影響，BHT作對照，Tris-HCl溶液作空白溶液，計算得到自由基清除率[23]. 每組試驗重復3次，取平均值作圖.

2 結果與討論

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 超聲波功率對茶葉總黃酮提取的影響

在200～500 W范圍內(nèi)，改變超聲波功率，測定茶葉總黃酮的提取率，結果見圖2. 茶葉總黃酮的提取率隨著超聲波功率的增大呈現(xiàn)先升后降的趨勢，350 W時茶葉總黃酮提取率最高，推測可能是因為超聲波功率太大，能量太高，使部分總黃酮結構遭到破壞，這樣就導致檢測到的總黃酮含量減少. 因此，試驗選擇350 W作為提取茶葉總黃酮的超聲波功率.

圖2 超聲波功率對茶葉總黃酮提取率的影響Fig.2 Effect of ultrasonic power on extraction yield of tea flavonoids

2.1.2 浸提時間對茶葉總黃酮提取的影響

由圖3可以看出：延長浸提時間，茶葉總黃酮的提取率呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢，浸提時間為30 min時，茶葉總黃酮提取率最高. 30 min前茶葉總黃酮的提取率隨時間延長而增大；30 min之后，茶葉總黃酮的提取率隨時間的延長反而下降，這可能是因為時間太長，會使茶葉細胞內(nèi)其他雜質(zhì)進入提取液，增大傳質(zhì)阻力，影響茶葉總黃酮的溶出. 因此，超聲波輔助下，茶葉總黃酮的最佳浸提時間為30 min.

圖3 浸提時間對茶葉總黃酮提取率的影響Fig.3 Effect of extracting time on extraction yield of tea flavonoids

2.1.3 乙醇濃度對茶葉總黃酮提取的影響

由圖4可以得出：隨著乙醇濃度的增大，茶葉總黃酮的提取率呈現(xiàn)先升后降的趨勢，乙醇濃度為50%時，茶葉總黃酮提取效果最好. 當乙醇濃度大于50%時，茶葉總黃酮的提取率下降，這可能是乙醇濃度過大，茶葉中一些易溶于乙醇的脂溶性物質(zhì)、色素等副產(chǎn)物溶出，從而減少了茶葉總黃酮的溶出量，測量結果偏低. 因次，選擇50%乙醇為提取茶葉總黃酮的溶劑.

圖4 乙醇濃度對茶葉總黃酮提取率的影響Fig.4 Effect of ethanol concentration on extraction yield of tea flavonoids

2.1.4 料液比對茶葉總黃酮提取的影響

由圖5可以得出：增加溶劑的體積，茶葉總黃酮的提取率呈現(xiàn)先升后降的趨勢，料液比為1∶20 g·mL-1時，茶葉總黃酮的提取率最大. 但隨著溶劑體積繼續(xù)增大，茶葉總黃酮的提取率減小，這也許是由于隨著乙醇用量的增大，許多易溶于乙醇的其他物質(zhì)大量溶出，干擾了茶葉總黃酮的溶出，從而使茶葉總黃酮的提取率降低. 因此提取茶葉總黃酮的最適合的料液比是1∶20 g·mL-1.

圖5 料液比對茶葉總黃酮提取率的影響Fig.5 Effects of material to liquid ratio on extraction yield of tea flavonoids

2.1.5 溫度對茶葉總黃酮提取的影響

由圖6可得：升高溫度，在35 ℃之前，茶葉總黃酮的提取率隨溫度升高而迅速升高，在35 ℃之后茶葉總黃酮的提取率升高的較為緩慢，從節(jié)約能量和滿足實驗條件的方面來說，選擇溫度35 ℃恰到好處，既能滿足實驗所需要到的溫度又減少耗能使提取茶葉總黃酮的量最多又節(jié)約了成本.

圖6 浸提溫度對茶葉總黃酮提取率的影響Fig.6 Effects of ethanol temperature on extraction yield of tea flavonoids

2.2 正交試驗結果分析

為獲得茶葉總黃酮最優(yōu)的提取工藝，在單因素試驗基礎上，選擇乙醇濃度、超聲波功率、浸提時間及料液比作為考察因素，以總黃酮提取率為考察指標，按照L9(34)正交表進行正交試驗，因素水平表如表1所示，正交試驗結果與數(shù)據(jù)分析見表2.

表1 正交試驗因素水平數(shù)

表2 正交試驗結果

正交實驗結果說明，不同的因素對提取率的影響是：乙醇濃度 > 超聲波功率 > 料液比 > 浸提時間. 根據(jù)結果可知，超聲波輔助法提取茶葉總黃酮最佳條件是：A2B3D3C2，即乙醇濃度為50%，超聲波功率為400 W，浸提時間為30 min，茶葉與乙醇的料液比為1∶30 g·mL-1.

2.3 驗證實驗

為確定優(yōu)化提取工藝的穩(wěn)定性，在該工藝條件下進行3組平行實驗，測得鐵觀音茶葉總黃酮的提取率分別為4.72%，4.74%，4.75%，平均為4.74%，此條件為鐵觀音茶葉總黃酮的最佳提取工藝.

2.4 清除·OH自由基能力

以BHT作為對照，測定了茶葉總黃酮清除羥基自由基能力，結果如圖7所示. 茶葉總黃酮對·OH自由基的清除能力隨著總黃酮濃度的增加而增大，當濃度達到0.8 g/L后，清除率為65.14%，說明茶葉總黃酮能夠清除·OH自由基，且在測定濃度范圍內(nèi)茶葉總黃酮清除·OH自由基能力強于BHT.

圖7 茶葉總黃酮和BHT對·OH的清除率Fig.7 Scavenging effects of tea flavonoids and BHT on hydroxyl radical

3 結論

采用超聲波輔助法提取茶葉中的總黃酮具有良好的效果. 單因素試驗和正交試驗結果顯示各因素對茶葉黃銅提取率的影響順序為：乙醇濃度>超聲波功率>料液比>浸提時間. 通過驗證試驗可知超聲波輔助法提取茶葉總黃酮的最優(yōu)條件為：乙醇濃度50%，超聲波功率400 W，浸提時間30 min，料液比為1∶30 g·mL-1，在此條件下，茶葉總黃酮的提取率可達4.74%. 茶葉總黃酮和BHT對·OH自由基的清除能力均隨著濃度增大而變強. 茶葉總黃酮能夠清除·OH，且比BHT對·OH的清除能力強.

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[責任編輯：吳文鵬]

Study on ultrasonic-assisted extraction and antioxidant activity of flavonoids from tea

Lü Mingxiu*, GAO Yumei, DONG Xueru, QIANG Liming, LI Lingling

(SchoolofMaterialandChemicalEngineering,HenanUniversityofEngineering,Zhengzhou450007,Henan,China)

Flavonoids from Tieguanyin tea were extracted by ultrasonic method, and their antioxidant activity was determined. The results showed that the optimum extraction conditions are ultrasonic power of 400 W, material to liquid ratio of 1∶30 g·mL-1, extracting time of 30 min, ethanol concentration of 50%, and the extraction yield of tea flavonoids is 4.74%. With the increasing concentration of tea flavonoids, their antioxidant activity became greater. When the concentration of tea flavonoids reaches 0.80 g/L, clearance rate of free radical is 65.14%. The antioxidant capacity of tea flavonoids is stronger than butylated hydroxytoluene (BHT).

tea; flavonoids; ultrasonic; antioxidant activity

2016-12-29.

河南省基礎與前沿技術研究計劃項目(132300410307)，河南省科技攻關項目(112102310544)，河南省教育廳自然科學研究計劃項目(2011A150006、2011A150007).

呂名秀(1982-)，女，講師，研究方向為天然產(chǎn)物化學、化學生物學.*

，E-mail：rettyking@163.com.

TS201.1

A

1008-1011(2017)02-0213-06