五種芽苗菜黃酮提取物的體外抗氧化活性研究

李執(zhí)坤，陳虹竹，馮艷鈺，張超，王淇，臧延青

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，大慶 163319）

五種芽苗菜黃酮提取物的體外抗氧化活性研究

李執(zhí)坤，陳虹竹，馮艷鈺，張超，王淇，臧延青

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，大慶 163319）

以苜蓿、小麥、松柳、紅豆、空心菜五種芽苗菜為原料，在80%乙醇，60℃，料液比1∶15（m·v-1），2 h的提取條件下提取黃酮化合物，并研究了其體外抗氧化活性，包括對(duì)超氧陰離子自由基、DPPH自由基的清除能力和對(duì)鐵離子的還原能力。試驗(yàn)結(jié)果表明芽苗菜黃酮提取物具有良好的體外抗氧化活性，且活性與濃度呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系。研究為功能食品原料的開發(fā)利用提供了理論依據(jù)。

芽苗菜；黃酮提取物；體外抗氧化活性

芽苗菜也稱黃金菜、神仙菜、活體菜，是用谷類、豆類、樹等的種子培育出的可食用“芽菜”。目前，市場上常見的芽苗菜有大豆、綠豆、豌豆、蠶豆、苜蓿、香椿、蕎麥、蘿卜等30多個(gè)品種[1-2]。隨著人們生活水平的提高和飲食習(xí)慣的改變，芽苗菜作為一種富含營養(yǎng)、優(yōu)質(zhì)、無污染的綠色食品，因其風(fēng)味獨(dú)特并具有“藥食同源”的保健功效而越來越受到消費(fèi)者的喜愛。

黃酮類化合物是天然的抗氧化劑，在清除人體內(nèi)超氧陰離子、降血凝、抗衰老、增強(qiáng)免疫力、抵抗DNA損傷等很多方面都具有良好的生理活性[3]。近些年，芽苗菜生物成分的活性得到了一定的證實(shí)，芽苗菜在萌發(fā)過程中不僅維生素、礦物質(zhì)等營養(yǎng)成分增多，其他生物活性物質(zhì)如黃酮類物質(zhì)也明顯增多，具有良好的抗氧化功效，對(duì)于癌癥、冠心病等具有良好的預(yù)防及一定的治療效果[4-6]。 芽苗菜具有占地面積小，生產(chǎn)周期短，單位面積產(chǎn)量高，季節(jié)性影響小、清潔無污染、營養(yǎng)價(jià)值高等特點(diǎn)，因而具有廣闊的發(fā)展前景[7]。試驗(yàn)提取了苜蓿、小麥、松柳、紅豆、空心菜五種芽苗菜的黃酮化合物，并比較研究了提取物的體外抗氧化活性，為芽苗菜產(chǎn)品的綜合開發(fā)利用提供了參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

松柳、紅豆、空心菜、紫花苜蓿購于山東菏澤，小麥（墾九）產(chǎn)自黑龍江墾區(qū)。

DZG-6050SA型真空干燥箱，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；DGG-9140B型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海森信公司；722 s分光光度計(jì)，上海分析儀器總廠制造；HH-1數(shù)顯恒溫水浴鍋，江蘇省榮華儀器制造有限公司；HH.W21.600型電熱恒溫水箱，江蘇省榮華儀器制造有限公司；SHB-ⅢA循環(huán)水式多用真空泵，鄭州長城科工貿(mào)有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 芽苗菜的培育

將洗凈的種子以種子體積2～3倍的蒸餾水浸泡24～36 h。搓去粘液用清水漂洗干凈，瀝干水分，放在平底容器內(nèi)，上蓋濕紗布，置于23～26℃恒溫處催芽48 h，至芽長2～3 mm。之后將種子均勻地撒到育苗盤中，蓋上濕紗布。培育期間棚室溫度保持在18～23℃之間。每天噴水3次。待植株長至10～12 cm時(shí)去掉種皮及其他雜質(zhì)，于60℃鼓風(fēng)干燥箱中干燥，粉碎，40目過篩備用[8-11]。

1.2.2 黃酮的提取

目前，關(guān)于黃酮提取的工藝已相當(dāng)成熟，采用Kim[12-13]等的方法，稱取2.00 g芽苗菜粉末，以80%乙醇為溶劑，物料比1∶15，60℃提取兩次，每次2 h，合并上清液，3 000 r·min-1離心，過濾。將濾液置于潔凈分液漏斗中，加入氯仿15 mL，甲醇15 mL，充分震蕩后加入30 mL蒸餾水，充分靜置后，取上層液體于平皿中，置于真空干燥箱60℃干燥，密封冷藏備用。

1.2.3 黃酮含量的測定

采用氯化鋁法，以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，確定吸光度與蘆丁濃度之間的關(guān)系，得出芽苗菜中黃酮的含量。準(zhǔn)確配制0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 mg·mL-1蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液，分別取3 mL置于25 mL試管中，加入3 mL AlCl3乙醇溶液（2%w·v-1）靜置15 min，在430 nm處測吸光度值，獲得蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線方程[1]。

稱取干燥后的黃酮提取物，配成一定濃度溶液，將樣品的吸光度代入標(biāo)準(zhǔn)回歸方程，計(jì)算黃酮粗提物中黃酮的含量，從而計(jì)算出芽苗菜中黃酮的含量。

1.2.4 芽苗菜黃酮對(duì)O2-·的清除作用

取提取的黃酮粗品稀釋為 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg·mL-1濃度的樣液，備用。向10 mL試管中加入5 mL pH=8.4的磷酸鹽緩沖液，2 mL不同濃度的SF樣液，0.1 mL 4.5 mmol·L-1鄰苯三酚溶液。25℃恒溫水浴10 min后，加入2滴鹽酸終止反應(yīng)，于420 nm處測定吸光度值，記為Ai。同時(shí)，向空白管依次加入5 mL pH=8.4的磷酸鹽緩沖液，2 mL蒸餾水，0.1 mL 4.5 mmol·L-1鄰苯三酚溶液。420 nm處測定吸光度值，記為Aj。用TP代替SF進(jìn)行陽性對(duì)照，每個(gè)樣品重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)[15]。

超氧陰離子清除率按如下公式計(jì)算：

1.2.5 芽苗菜黃酮對(duì)DPPH的清除作用

將黃酮提取物稀釋為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg·mL-1濃度的樣液。用95%乙醇配制4×10-4M的DPPH溶液，在10 mL試管中先后加入各3 mL DPPH、2 mL樣液，室溫避光靜置1 h，于517 nm處讀數(shù)，每個(gè)樣品進(jìn)行3次平行試驗(yàn)。

DPPH清除率按如下公式計(jì)算：

1.2.6 芽苗菜黃酮的還原能力測定（鐵氰化鉀還原力）

參照張紅城等[1]的方法，在25 mL試管中先后加入2.5 mL pH=6.6磷酸緩沖溶液，1 mL不同濃度的提取物溶液（空白管加80%乙醇），2.5 mL 1%鐵氰化鉀，50℃恒溫加熱20 min，加10%三氯乙酸2.5 mL，3 000 r·min-1離心分離，取上清液2.5 mL，加入2.5 mL蒸餾水及0.5 mL 0.1%FeC13，混合均勻，避光靜置10 min后在700 nm波長下測吸光度A值，計(jì)算還原力，每個(gè)樣品重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)。

還原力=[（A樣品-A空白）/A空白]×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=8.021 4x+0.005 8，相關(guān)系數(shù)為0.999 2。利用蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，得出芽苗菜黃酮含量如表1。

表1 芽苗菜黃酮含量Table 1 Flavonoids content of SF

2.2 芽苗菜黃酮對(duì)O2-·的清除作用

圖1 SF對(duì)超氧陰離子自由基的清除作用Fig.1 The scavenging ability of SF against superoxide radicals

超氧陰離子自由基不僅自身具有毒性，而且能夠通過一系列反應(yīng)生成其他氧離子自由基，對(duì)生物體產(chǎn)生進(jìn)一步的損害作用[17]。 在堿性條件下鄰苯三酚能迅速自氧化產(chǎn)生O2-·，加速鄰苯三酚的自氧化，產(chǎn)生有色中間產(chǎn)物，次有色中間產(chǎn)物在325 nm具有強(qiáng)烈的光吸收，由于O2-·的濃度決定了自氧化速率，清除O2-·抑制了自氧化反應(yīng)，阻止中間產(chǎn)物的積累，由此來評(píng)價(jià)樣品清除O2-·的能力[18]。

由圖2可知，在0.1 mg·mL-1到0.5 mg·mL-1的樣品濃度中，SF對(duì)超氧陰離子自由基具有一定的清除活性。不同品種芽苗菜黃酮提取物對(duì)O2-·的清除效果隨著樣品濃度的逐漸遞增，在0.5 mg·mL-1時(shí)達(dá)到最大，此濃度下，清除率分別達(dá)到苜蓿（15.70%），小麥（34.12%），紅豆（41.90%），松柳（41.38%），空心菜（36.78%），其O2-·清除能力順序?yàn)椋杭t豆＞松柳＞空心菜＞小麥＞苜蓿。

2.3 芽苗菜黃酮對(duì)DPPH的清除作用

圖2 SF對(duì)DPPH自由基的清除作用Fig.2 The scavenging ability of SF against DPPH free radicals

由圖3可知，在0.1 mg·mL-1到0.5 mg·mL-1的樣品濃度中，SF對(duì)DPPH具有一定的清除能力。清除效果隨著樣品濃度的逐漸遞增，在0.5 mg·mL-1時(shí)達(dá)到最大，此濃度下，清除率分別達(dá)到苜蓿（11.36%），小麥（26.90%），紅豆（14.01%），松柳（49.52%），空心菜（25.31%），其DPPH清除能力順序?yàn)椋杭t豆＞小麥＞空心菜＞松柳＞苜蓿。

2.4 芽苗菜黃酮還原力的測定

在三氯化鐵/鐵氰化鉀混合溶液中，樣品中的還原性物質(zhì)可將Fe3+還原成Fe2+，形成一種藍(lán)色化合物，使得溶液吸光度增大，該化合物在700 nm處有最大吸收值。所以通過溶液的吸光度的變化來評(píng)價(jià)還原力的大小。以此來評(píng)價(jià)芽苗菜提取物的抗氧化活性[19-20]。

圖3 SF還原力的測定Fig.3 The reduction ability of SF

由圖4可知，在0.1 mg·mL-1到0.5 mg·mL-1的樣品濃度范圍，隨著濃度的逐漸增加，SF的還原力均逐漸遞增，在0.5 mg·mL-1時(shí)達(dá)到最大，五種芽苗菜黃酮提取物均對(duì)Fe3+表現(xiàn)出一致的還原能力。其還原能力順序?yàn)椋盒←湥舅闪究招牟耍炯t豆＞苜蓿。

根據(jù)Gil ES[21]等人的研究，抗氧化能力的強(qiáng)弱與黃酮上活性基團(tuán)的數(shù)量與所處的位置有關(guān)。也有研究表明，擁有鄰位羥基芳香環(huán)的黃酮具有較高的抗氧化活性[22]。此外，黃酮的結(jié)構(gòu)并不是影響抗氧化能力的唯一原因，Ndhlala等[23]通過對(duì)黃酮提取物及其分離組分的抗氧化研究，發(fā)現(xiàn)黃酮提取物的抗氧化活性均高于分離組分，表明了黃酮類物質(zhì)的抗氧化能力具有協(xié)同或者疊加作用。

3 討論

苜蓿、小麥、紅豆、松柳、空心菜五種芽苗菜黃酮提取物均表現(xiàn)了對(duì)O2-·和DPPH自由基的清除能力，對(duì)Fe3+具有良好的還原能力，并且呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系。綜合各項(xiàng)抗氧化能力指標(biāo)，紅豆、松柳、小麥SF的抗氧化活性較好，苜蓿的抗氧化能力稍差。不同品種芽苗菜黃酮提取物對(duì)DPPH、超氧陰離子自由基、Fe3+的清除能力表現(xiàn)出較大的差異，這可能是由不同品種芽苗菜含有的黃酮類物質(zhì)的含量、黃酮的組成結(jié)構(gòu)的差異以及不同黃酮類物質(zhì)的協(xié)同疊加作用所導(dǎo)致的。此外，提取物中可能少量含有其他酚類物質(zhì)，這也是影響其抗氧化活性的可能原因。實(shí)驗(yàn)初步研究了芽苗菜中黃酮類物質(zhì)的含量及其抗氧化能力的差異，其抗氧化能力差異的反應(yīng)機(jī)理有待進(jìn)一步的研究。

4 結(jié)論

苜蓿、小麥、紅豆、松柳、空心菜五種芽苗菜黃酮具有一定的體外抗氧化能力，作為功能性食品原料具有廣闊的開發(fā)利用前景。

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Antioxidative Activities in Vitro Study on Flavonoids Extracts from Five Sprouts

Li Zhikun，Chen Hongzhu，F(xiàn)eng Yanyu，Zhang Chao，Wang Qi，Zang Yanqing
（College of Food Science，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319）

The antioxidative activities in vitro of the flavonoids from sprouts of Water Spinach，Pine Willow，Red Bean，Wheat，and Alfalfa were studied.The extraction condition was extraction solvent 80%ethanol，extraction temperature 60℃，solid-liquid ratio1∶15，extraction time 2 hours.Antioxidative activities including superoxide radical（O2-·），1，1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical（DPPH）and Ferric iron of the flavonoids were studied.The results showed that the sprouts flavonoids had good antioxidant abilities in vitro.Activity and concentration indicated certain relationship.The research provided theory basis for the development and utilization of functional food ingredients.

sprouts;flavonoids;antioxidant activities in vitro

Q539

A

1002-2090（2017）02-0048-04

10.3969/j.issn.1002-2090.2017.02.010

2016-05-20

2015年省級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練項(xiàng)目（201510223022）。

李執(zhí)坤（1993-），男，黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院食品質(zhì)量與安全專業(yè)2013級(jí)本科生。

臧延青，講師，E-mail：byndzangyanqing@163.com。