對禾草源同型發(fā)酵和/或異型發(fā)酵乳酸菌發(fā)酵無芒雀麥青貯有氧穩(wěn)定性的評價

塔 娜 魏日華 德慶哈拉 那日蘇 王 海*

(1.中國農(nóng)業(yè)科學院草原研究所/農(nóng)業(yè)部草地生態(tài)與修復治理重點實驗室，呼和浩特010010；2.嘉吉飼料(內(nèi)蒙古)有限公司，包頭014000；3.內(nèi)蒙古家畜改良工作站，呼和浩特010010)

對禾草源同型發(fā)酵和/或異型發(fā)酵乳酸菌發(fā)酵無芒雀麥青貯有氧穩(wěn)定性的評價

塔 娜1魏日華2德慶哈拉3那日蘇1王 海1*

(1.中國農(nóng)業(yè)科學院草原研究所/農(nóng)業(yè)部草地生態(tài)與修復治理重點實驗室，呼和浩特010010；2.嘉吉飼料(內(nèi)蒙古)有限公司，包頭014000；3.內(nèi)蒙古家畜改良工作站，呼和浩特010010)

本研究旨在評價禾草源同型發(fā)酵和/或異型發(fā)酵乳酸菌發(fā)酵對無芒雀麥青貯有氧穩(wěn)定性的作用效果。將從禾本科牧草上分離篩選出的2株同型發(fā)酵植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)和蒙氏腸球菌(Enterococcusmundtti)及1株異型發(fā)酵布氏乳桿菌(Lactobacillusbuchneri)制成發(fā)酵劑。選用開花期無芒雀麥，刈割切段至2～3 cm，根據(jù)所噴發(fā)酵劑菌株的不同，分為4個處理：1)對照處理(con處理)，噴灑無菌去離子水；2)異型發(fā)酵處理(he處理)，噴灑布氏乳桿菌液；3)同型發(fā)酵處理(ho處理)，噴灑植物乳桿菌和蒙氏腸球菌混合液(2種菌1∶1混合)；4)同型發(fā)酵+異型發(fā)酵處理(he+ho處理)，噴灑布氏乳桿菌、植物乳桿菌和蒙氏腸球菌混合液(3種菌1∶1∶1混合)。各處理噴灑量均為10 mL/kg鮮牧草，噴灑總菌數(shù)約為5×105CFU/g鮮牧草，每個處理設(shè)5個重復。實驗室常溫發(fā)酵60 d后開封，通過測定無芒雀麥青貯營養(yǎng)成分、菌群數(shù)量及中心溫度變化評價其有氧穩(wěn)定性。結(jié)果顯示：經(jīng)60 d青貯發(fā)酵后，4個處理的pH均較青貯前顯著降低(P<0.05)，所有處理發(fā)酵效果均較好(pH≤4.3)，尤以ho處理效果最優(yōu)。而在有氧暴露試驗期間，con和ho處理的pH迅速增加，至第8天時達到7以上；he+ho處理pH增加幅度略低于con和ho處理，其pH至第8天時為6.3，顯著低于con和ho處理(P<0.05)；he處理pH增加非常緩慢，至第8天時僅為4.4，顯著低于其他處理(P<0.05)。經(jīng)60 d青貯發(fā)酵后，可溶性碳水化合物(WSC)含量以ho處理最高，顯著高于其他處理(P<0.05)；con處理最低，顯著低于其他處理(P<0.05)。而在有氧暴露試驗期間，WSC含量在ho處理中迅速降低，在he處理中緩慢降低；至第8天時，WSC含量以he處理最高，he+ho處理顯著低于前者(P<0.05)，而con和ho處理則顯著低于he和he+ho處理(P<0.05)。青貯發(fā)酵后霉菌數(shù)量明顯受到抑制，且以單獨添加異型發(fā)酵乳酸菌和混合添加同型發(fā)酵和異型發(fā)酵乳酸菌時抑制效果較優(yōu)，這2個處理均未檢出霉菌，且he+ho處理在有氧暴露至第5天時仍未檢出霉菌，he處理在有氧暴露至第8天時仍未檢出霉菌。在有氧暴露第3和5天時，he和he+ho處理酵母菌數(shù)量顯著低于con、ho處理(P<0.05)。在有氧暴露第8天時，he+ho與he處理的乳酸、乙酸濃度均顯著高于另2個處理(P<0.05)。he、he+ho、con和ho處理的有氧穩(wěn)定性依次降低，分別為194、126、62和58 h。綜合評價結(jié)果得出：布氏乳桿菌單獨或與同型發(fā)酵乳酸菌蒙氏腸球菌和植物乳桿菌聯(lián)合接種可有效抑制無芒雀麥青貯的有氧腐敗，保證無芒雀麥青貯有氧暴露期間品質(zhì)的穩(wěn)定，且前者更有效；接種同型發(fā)酵乳酸菌蒙氏腸球菌和植物乳桿菌未能在提高無芒雀麥青貯有氧穩(wěn)定性方面表現(xiàn)出積極的作用。關(guān)鍵詞：無芒雀麥；同型發(fā)酵乳酸菌；異型發(fā)酵乳酸菌；青貯；有氧穩(wěn)定性

青貯飼料在取飼過程中，空氣易浸透入窖，誘發(fā)在厭氧階段休眠的好氧微生物(酵母菌、霉菌等)增殖，使青貯飼料溫度、pH升高，導致青貯好氧腐敗，造成營養(yǎng)物質(zhì)大量損失[1-2]。因此，防止或降低青貯好氧腐敗，提高有氧穩(wěn)定性是保證青貯飼料品質(zhì)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。目前，有關(guān)青貯飼料有氧穩(wěn)定性的研究中，常規(guī)評價主要通過3個方面：其一，青貯溫度變化(一般以環(huán)境溫度為參照，青貯有氧暴露后，其中心溫度不高于環(huán)境溫度2 ℃所持續(xù)的時間)[3]；其二，化學分析[測定pH、有機酸含量、可溶性碳水化合物(WSC)含量、干物質(zhì)(DM)含量變化及CO2生成量等][4-5]；其三，微生物培養(yǎng)(乳酸菌、酵母菌、霉菌、丁酸菌等變化)[4-5]。

青貯飼料制備過程中應(yīng)用的乳酸菌種質(zhì)資源豐富，不同菌種在青貯發(fā)酵體系中生長、作用及功能區(qū)別很大。同型發(fā)酵乳酸菌(hoLAB)具有較快的發(fā)酵特性和有效抑制不良微生物的活性，且營養(yǎng)物質(zhì)損失較小，能夠較好的保存青綠飼料的營養(yǎng)價值，所以廣泛應(yīng)用于青貯飼料的生產(chǎn)與研究中[6-7]。然而，近幾年隨著青貯飼料有氧穩(wěn)定性方面研究的深入，有研究指出基于同型發(fā)酵乳酸菌的青貯接種物對好氧穩(wěn)定性幾乎沒有有益的效果，甚至會降低青貯飼料的有氧穩(wěn)定性，容易引起青貯的好氧腐敗[8-9]。而異型發(fā)酵乳酸菌(heLAB)對提高青貯有氧穩(wěn)定性方面的積極作用開始受到人們的關(guān)注[10-11]，以及同型和/或異型乳酸菌混合添加對青貯有氧穩(wěn)定性的作用效果逐漸成為青貯乳酸菌添加劑方面的研究熱點[12-13]。

在自然條件下禾本科牧草葉圍附著乳酸菌數(shù)量較少，且不良微生物較多[14-15]。若想獲得成功的青貯，必須添加乳酸菌，主導其發(fā)酵，促進養(yǎng)分較好的保存下來。成品青貯發(fā)酵劑種類繁多，來源不同，大多以引進國外的進口發(fā)酵劑為主，價格昂貴，且微生物的生長有其特定的環(huán)境與溫度，其對國內(nèi)環(huán)境的適應(yīng)性及使用效果也有待證實。不同菌種具有不同的特性，對不同的青貯底物其作用效果也不盡相同[16-17]。本研究結(jié)合上述3種評價方法，對禾草源3株不同發(fā)酵類型乳酸菌對無芒雀麥青貯有氧穩(wěn)定性的作用效果進行分析探討，旨在為調(diào)制優(yōu)質(zhì)牧草青貯并使其養(yǎng)分穩(wěn)定的保存和推廣應(yīng)用提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 乳酸菌添加劑的制備

前期從禾本科牧草上分離篩選出3株供試菌株——植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)、蒙氏腸球菌(Enterococcusmundtti)和布氏乳桿菌(Lactobacillusbuchneri)。其中植物乳桿菌和蒙氏腸球菌為禾草源同型發(fā)酵乳酸菌，布氏乳桿菌為禾草源異型發(fā)酵乳酸菌。分別取1環(huán)上述供試菌株轉(zhuǎn)接入5 mL MRS液體培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)72 h，培養(yǎng)液中活菌數(shù)約為1×109CFU/mL。根據(jù)添加菌株的不同，取要求體積的培養(yǎng)液(其中單種菌的取2 mL，2種菌的各取1 mL，3種菌的各取0.7 mL)，并分別用等量的無菌去離子水稀釋10倍，噴灑前均勻混合，噴灑量為10 mL/kg鮮牧草，噴灑總菌數(shù)約為5×105CFU/g鮮牧草。

1.2 無芒雀麥青貯制作

采集錫盟正藍旗人工種植的開花期無芒雀麥，刈割切段至2～3 cm，將制備好的乳酸菌液用噴壺均勻噴灑于材料牧草上，并充分混勻，裝入3 L透明聚碳酸酯(PC)瓶中，每瓶約1.5 kg，壓緊，密封。根據(jù)所噴菌株不同，分為4個處理：1)對照處理(con處理)，噴灑無菌去離子水；2)異型發(fā)酵處理(he處理)，噴灑布氏乳桿菌液；3)同型發(fā)酵處理(ho處理)，噴灑植物乳桿菌和蒙氏腸球菌混合液；4)異型發(fā)酵+同型發(fā)酵處理(he+ho處理)，噴灑布氏乳桿菌、植物乳桿菌和蒙氏腸球菌混合液。每個處理設(shè)5個重復。實驗室常溫發(fā)酵，試驗期60 d。

1.3 樣品采集與測定指標

分別在發(fā)酵第0天(發(fā)酵前)和第60天，采集原料牧草和無芒雀麥青貯樣品測定營養(yǎng)物質(zhì)含量，包括DM、粗蛋白質(zhì)(CP)、酸性洗滌纖維(ADF)、中性洗滌纖維(NDF)和WSC含量。

發(fā)酵第60天后，每組取3個重復，開封后于第0(剛開封時)、1、3、5、8天時取無芒雀麥青貯樣品，同一樣品連續(xù)取5次，且取樣后不再封口。取無芒雀麥青貯鮮樣30 g，加入270 mL蒸餾水，浸泡60 min后用攪拌機充分攪拌，4層紗布過濾，取濾液，測定濾液pH及揮發(fā)性脂肪酸(VFA)、乳酸(LA)濃度。同時，監(jiān)測開封后無芒雀麥青貯樣品中乳酸菌、霉菌和酵母菌數(shù)量動態(tài)變化、WSC含量動態(tài)變化及有氧穩(wěn)定性。

1.4 測定方法

樣品中常規(guī)營養(yǎng)物質(zhì)(DM、CP、ADF、NDF)含量參考張麗英[18]的方法測定，WSC含量采用蒽酮比色法[19]測定，pH直接用便攜式pH計(Horiba，Twin-B-212)測定。

樣品中VFA及LA濃度采用氣相色譜法測定，測定原理為：LA與適當過量的四甲基氫氧化銨作用生成季銨鹽，用二甲基甲酰胺將其溶解，在室溫下季銨鹽與過量碘甲烷完全反應(yīng)生成相應(yīng)甲酯衍生物。甲酯衍生物在15%的鄰苯二甲酸二壬酯與5%的吐溫-80混合固定相不銹鋼色譜柱上進行分離，用保留時間定性、外標法定量測定。儀器：氣相色譜儀(島津GC-9A，日本)，氫火焰離子化檢測器；色譜柱：柱長2 m，內(nèi)徑3 mm，不銹鋼柱；固定相：15%的鄰苯二甲酸二壬酯與5%的吐溫-80混合固定液，擔體為Chromosorb HP(80～100目)；溫度：柱溫100 ℃，檢測器及汽化室溫度150 ℃；氣體流速：載氣(氮氣)，30 mL/min；氫氣，50 mL/min；空氣，500 mL/min；進樣量：1 μL。

樣品中乳酸菌、霉菌和酵母菌數(shù)量采用平板計數(shù)法測定，分別選用MRS培養(yǎng)基、馬丁培養(yǎng)基和馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基，35 ℃恒溫培養(yǎng)3 d，對菌落進行計數(shù)。

兩組患者術(shù)中出血量、手術(shù)時間及術(shù)后住院時間均有記錄。術(shù)后吞咽困難評判標準根據(jù)Bazaz［2］方法分為無、輕度、中度及重度。采用日本矯形外科學會（Japanese Orthopaedic Association,JOA）制定的17評分、視覺疼痛模擬評分（visual analogue scale,VAS）來評估臨床效果。

有氧穩(wěn)定性的測定方法如下：取2.5～3.0 kg發(fā)酵60 d的無芒雀麥青貯裝入滅菌的塑料桶中，放置在室溫[(23±1) ℃]下，將溫度計插入無芒雀麥青貯中，每隔2 h記錄無芒雀麥青貯幾何中心的溫度。有氧穩(wěn)定性以中心溫度不高于環(huán)境溫度2 ℃所持續(xù)的時間表示。有氧穩(wěn)定性測定期間無芒雀麥青貯樣品要保持相對獨立，不被外界影響[20]。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

試驗數(shù)據(jù)采用SAS 9.0軟件中單因素方差分析進行統(tǒng)計分析。采用Duncan氏法進行組間差異顯著性分析，P<0.05代表差異顯著，P<0.01代表差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 無芒雀麥青貯前后pH、營養(yǎng)成分含量及附著微生物數(shù)量變化

表1為無芒雀麥青貯前與青貯發(fā)酵60 d后pH、營養(yǎng)成分含量及附著的微生物數(shù)量的變化情況。經(jīng)60 d青貯發(fā)酵后，4個處理的pH均較青貯前顯著降低(P<0.05)，從6.0降到4.3以下，所有處理發(fā)酵效果均較好，尤以ho處理效果最優(yōu)。無芒雀麥營養(yǎng)成分經(jīng)過青貯發(fā)酵后發(fā)生了不同程度的變化：各處理青貯前后DM、NDF和ADF含量差異均不顯著(P>0.05)；與無芒雀麥相比，4個處理無芒雀麥青貯CP含量均顯著下降(P<0.05)，其中以con處理CP損失最多，而he+ho處理CP損失最少，由此說明同型發(fā)酵和異型發(fā)酵乳酸菌均可以抑制牧草中蛋白質(zhì)的降解，而同型發(fā)酵和異型發(fā)酵乳酸菌混合添加對牧草中蛋白質(zhì)的降解抑制效果最好。青貯發(fā)酵過程使無芒雀麥WSC的含量顯著下降(P<0.05)，其中con處理WSC損失最多，ho處理WSC損失最少。

無芒雀麥經(jīng)過青貯發(fā)酵后附著的乳酸菌數(shù)量明顯增多，且添加乳酸菌的he、ho和he+ho處理的增殖效果略優(yōu)于未添加乳酸菌的con處理；青貯前無芒雀麥附著的酵母菌數(shù)量較多，經(jīng)過青貯發(fā)酵后其附著的酵母菌數(shù)量略有增加，其中添加同型發(fā)酵乳酸菌的ho處理增殖最多，而添加異型發(fā)酵乳酸菌的he處理增殖最少；青貯前無芒雀麥附著的霉菌數(shù)量較多，經(jīng)過青貯發(fā)酵后霉菌數(shù)量明顯受到抑制，且以單獨添加異型發(fā)酵乳酸菌和混合添加同型發(fā)酵和異型發(fā)酵乳酸菌時抑制效果較優(yōu)，這2個處理均未檢出霉菌。

2.2 有氧暴露后無芒雀麥青貯pH的動態(tài)變化

表1 無芒雀麥青貯前后pH、營養(yǎng)成分含量及附著微生物數(shù)量變化

pH和營養(yǎng)成分含量同行數(shù)據(jù)肩標不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，相同字母或無字母表示差異不顯著(P>0.05)。

“—”表示未檢出。下表同。

Values of pH and nutrient contents in the same row with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05), while with the same or no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05).

“—” represented not detectable. The same as below.

表2 有氧暴露后無芒雀麥青貯pH的動態(tài)變化

同列數(shù)據(jù)肩標不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，相同字母或無字母表示差異不顯著(P>0.05)。下表同。

Values in the same column with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05), while with the same or no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05). The same as below.

2.3 有氧暴露后無芒雀麥青貯中有機酸濃度的動態(tài)變化

表3為有氧暴露后無芒雀麥青貯中有機酸濃度的動態(tài)變化。有氧暴露試驗期間，隨著有氧暴露時間的延長，各處理乳酸濃度均呈現(xiàn)下降趨勢，ho處理下降幅度最大，說明添加蒙氏腸球菌和植物乳桿菌沒能有效延緩無芒雀麥青貯pH的升高，抑制有氧腐敗。青貯開封時he處理乳酸濃度在各處理中最低，但是在有氧暴露至第8天時，he處理乳酸僅損失0.79% DM，而con、ho和he+ho處理的損失量分別為2.33% DM、4.01% DM和2.25% DM。有氧暴露試驗第8天he+ho與he處理的乳酸濃度差異不顯著(P>0.05)，均顯著高于另2個處理(P<0.05)，說明添加布氏乳桿菌可以顯著抑制無芒雀麥青貯有氧暴露期間的乳酸損失，延緩pH上升，防止有氧腐敗。

無芒雀麥青貯有氧暴露后乙酸濃度在各處理均隨有氧暴露時間的延長呈下降趨勢。有氧暴露至第8天時，con、he、ho、he+ho處理乙酸損失量分別為0.93% DM、0.45% DM、0.91% DM和0.51% DM，he和he+ho處理乙酸濃度均顯著高于con和ho處理(P<0.05)。隨著有氧暴露時間的延長，各處理丙酸濃度逐漸減少，直至未檢出。各乳酸菌添加處理丁酸的檢出率較低，con處理的丁酸濃度則較其他處理略高，但在整個有氧暴露試驗期間也隨有氧暴露時間的延長呈下降趨勢。

2.4 有氧暴露后無芒雀麥青貯中微生物數(shù)量的動態(tài)變化

有氧暴露后無芒雀麥青貯中微生物數(shù)量的動態(tài)變化見表4。隨著有氧暴露時間的延長，4個處理中乳酸菌數(shù)量無數(shù)量級上的變化。各處理酵母菌數(shù)量則隨著有氧暴露試驗時間的延長均略有增加，在第3和5天時，he、he+ho處理酵母菌數(shù)量顯著低于con、ho處理(P<0.05)，尤以he處理最低。

在整個試驗期，he處理始終未檢出霉菌存在，he+ho處理僅在有氧暴露第8天時檢出霉菌，而con、ho處理則一直有霉菌檢出，且ho處理霉菌數(shù)量還隨著有氧暴露試驗時間的延長而增加。

2.5 無芒雀麥青貯有氧暴露后WSC含量的動態(tài)變化

有氧暴露試驗期間，隨著有氧暴露時間的延長，4個處理WSC含量均出現(xiàn)了不同程度的下降，WSC含量的下降說明青貯飼料中微生物利用WSC作為底物大量繁殖。在整個有氧暴露試驗期間，ho處理WSC含量下降的幅度最大且出現(xiàn)大幅下降的時間最早；he處理在有氧暴露試驗前5 d WSC損失較少，在第8天WSC含量出現(xiàn)了明顯下降；he+ho處理WSC在有氧暴露試驗期間損失也較大，但WSC含量開始大量下降的時間比ho處理晚。在有氧暴露至第5和8天時，無芒雀麥青貯WSC含量均表現(xiàn)為he處理>he+ho處理>con處理>ho處理，除con與ho處理之間差異不顯著(P>0.05)外，其他處理間差異顯著(P<0.05)。這說明，添加布氏乳桿菌可以有效抑制好氧微生物的生長，減少無芒雀麥青貯有氧暴露試驗期間WSC的損失。

2.6 不同發(fā)酵類型乳酸菌對無芒雀麥青貯有氧穩(wěn)定性的影響

由圖2可知，con、he、ho、he+ho處理的有氧穩(wěn)定性分別為62、194、58、126 h。ho處理有氧穩(wěn)定性比對con處理低4 h，he處理有氧穩(wěn)定性比con處理高132 h，he+ho處理有氧穩(wěn)定性比對con處理高64 h。這說明，添加布氏乳桿菌可以提高無芒雀麥青貯的有氧穩(wěn)定性，而添加蒙氏腸球菌和植物乳桿菌對無芒雀麥青貯的有氧穩(wěn)定性沒有明顯影響，而將3株菌混合添加亦可以提高無芒雀麥青貯的有氧穩(wěn)定性。

3 討 論

3.1 添加乳酸菌主導無芒雀麥青貯發(fā)酵

青貯原料上附著的微生物不僅對青貯發(fā)酵產(chǎn)生影響，也會對青貯微生物添加劑的應(yīng)用產(chǎn)生影響。刈割后的青綠牧草含有各種不同的微生物，其種類及數(shù)量存在很大差異，其中好氧菌如霉菌、酵母菌等的數(shù)量較高，它們對青貯發(fā)酵及保藏過程無任何有益作用。劉晗璐[21]研究表明，披堿草和老芒麥新鮮牧草上附著的微生物主要以一般細菌、酵母菌、霉菌為主，乳酸菌的數(shù)量較少，最高數(shù)量低于5×104CFU/g FM(每克鮮牧草含菌落單位數(shù))，不能滿足常規(guī)青貯乳酸菌的最低數(shù)量(>105CFU/g FM)需求。本研究中，新鮮無芒雀麥附著乳酸菌數(shù)量僅為3.72 lg(CFU/g FM)，而酵母菌和霉菌數(shù)量則超過6 lg(CFU/g FM)，因此要想獲得優(yōu)質(zhì)的禾本科牧草青貯必須額外添加乳酸菌才能主導發(fā)酵進行。

pH是評定青貯發(fā)酵品質(zhì)的重要指標，向青貯飼料中添加乳酸菌可以迅速降低青貯飼料的pH。青貯飼料pH的變化和發(fā)酵終pH與發(fā)酵過程中的主導菌群有著密切的關(guān)系。本研究中，蒙氏腸球菌在發(fā)酵初期生長速度快，可迅速降低青貯飼料的pH，植物乳桿菌耐酸，在較低的pH情況下仍能繼續(xù)繁殖[21]，因此添加蒙氏腸球菌和植物乳桿菌的處理在青貯發(fā)酵過程中pH下降最快，而且發(fā)酵終pH最低。布氏乳桿菌作為一種異型發(fā)酵乳酸菌，發(fā)酵過程中除了產(chǎn)生乳酸以外，還生成一些相對酸性較弱的酸，因此發(fā)酵過程的pH和發(fā)酵終pH也偏高。

同一時間點數(shù)據(jù)點標注不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

Value points at the same time with different small letters mean significant difference (P<0.05).

圖1 無芒雀麥青貯有氧暴露后WSC含量的動態(tài)變化

Fig.1 Dynamic changes of WSC content inBromusinermisLeyss. silage after aerobic exposure

圖2 各處理無芒雀麥青貯的有氧穩(wěn)定性

青貯發(fā)酵過程中不可避免的會出現(xiàn)蛋白質(zhì)降解而導致營養(yǎng)物質(zhì)的損失。添加乳酸菌劑可快速降低青貯飼料的pH而抑制蛋白質(zhì)水解酶的活性，達到降低蛋白質(zhì)降解的目的[22]。本研究中所用乳酸菌均起到了抑制牧草中蛋白質(zhì)降解的作用，其中同型發(fā)酵和異型發(fā)酵乳酸菌混合添加對牧草中蛋白質(zhì)降解的抑制效果最好。由于開花期無芒雀麥WSC含量高，其上附著的酵母菌和霉菌數(shù)量較多，可能導致發(fā)酵過程中DM損失增加以及開窖后穩(wěn)定性的降低，因此有必要開展添加異型發(fā)酵乳酸菌對有氧穩(wěn)定性作用效果的優(yōu)劣評價。本研究中，添加異型發(fā)酵乳酸菌可有效抑制發(fā)酵過程中霉菌的增殖，與青貯前相比，青貯發(fā)酵對酵母菌增殖的抑制作用不明顯，但異型發(fā)酵乳酸菌單獨或與同型發(fā)酵乳酸菌混合添加均表現(xiàn)出了優(yōu)于同型發(fā)酵乳酸菌和未添加乳酸菌的作用效果。Taylor等[23]在研究中發(fā)現(xiàn)，在青貯發(fā)酵早期數(shù)量明顯減少的酵母菌在發(fā)酵后期的檢測中會出現(xiàn)數(shù)量再增加的情況，這與青貯發(fā)酵過程中乳酸菌與酵母菌數(shù)量存在此消彼長的動態(tài)變化有關(guān)。另有研究表明，青貯體系中存在較多種嗜酸酵母菌，其可耐受pH<3的環(huán)境且可利用乳酸和WSC供其生長，而較高濃度的丁酸可抑制這類酵母菌的生長[24]。本研究中獲得的青貯發(fā)酵后期較高酵母菌數(shù)量可能與上述原因有關(guān)，但具體為哪種酵母菌還有待進一步分析探討。

3.2 布氏乳桿菌對無芒雀麥青貯有氧腐敗的抑制效果

布氏乳桿菌是一種專性異型發(fā)酵乳酸菌，在青貯發(fā)酵過程中能夠產(chǎn)生高劑量乙酸抑制青貯飼料中的酵母菌和真菌的活性，從而使青貯飼料暴露于空氣中時不易腐敗變質(zhì)[25]。在不同青貯原料(玉米、高粱、大麥、小麥、苜蓿、黑麥草、王草等)的接種效果研究中發(fā)現(xiàn)，布氏乳桿菌單獨添加可以明顯改善青貯飼料的有氧穩(wěn)定性[26]，盡管其對有氧穩(wěn)定性的提高程度不盡相同，受添加劑量[23,27]、青貯開封時間[23,27]、不同地點[28]等的影響，但所表現(xiàn)的積極效應(yīng)是穩(wěn)定的。本研究中，無芒雀麥中單獨添加布氏乳桿菌(he處理)，其有氧腐敗敏感性指標的變化均表現(xiàn)出不同于其他處理，具體為：1)有效抑制了無芒雀麥青貯在有氧暴露期間乳酸及揮發(fā)性脂肪酸的損失，使無芒雀麥青貯在有氧暴露期間pH保持在較低水平，當其他處理的pH增加到6.0以上時，he處理的pH則穩(wěn)定在4.5以下；2)不論在開封時或暴露時，其高濃度乙酸有效抑制了無芒雀麥青貯的有氧腐敗；3)隨著有氧暴露時間的延長，各處理酵母菌數(shù)量均略有增加，而he處理增加程度最低，終酵母菌數(shù)量最少，且he處理未檢出霉菌；4)開封后，隨著無芒雀麥青貯中好氧微生物復蘇及利用WSC作為底物開始繁殖，WSC含量均出現(xiàn)了不同程度的下降，但he處理終WSC含量顯著高于其他處理；5)青貯溫度變化所用時間則he處理用時最長。綜合以上結(jié)果可表明，本研究所用禾草源布氏乳桿菌可有效抑制無芒雀麥青貯的有氧腐敗，保證無芒雀麥青貯有氧暴露期間品質(zhì)的穩(wěn)定。

3.3 同型和/或異型乳酸菌混合添加對無芒雀麥青貯有氧穩(wěn)定的作用效果

青貯飼料有氧暴露后的理化性質(zhì)變化受發(fā)酵完成時的pH、青貯飼料中LA與VFA濃度、有氧暴露期間好氧菌的生長情況等多種因素影響，其變化能反映出青貯飼料的腐敗速度和程度。許多同型發(fā)酵乳酸菌以發(fā)酵過程中產(chǎn)生更多的乳酸及較強的酸化作用，降低了營養(yǎng)物質(zhì)損失[29]，從而保證了較高的青貯發(fā)酵品質(zhì)。但由于同型發(fā)酵乳酸菌在青貯發(fā)酵過程中降低了青貯飼料中抗真菌物質(zhì)的含量，使青貯飼料在有氧暴露后穩(wěn)定性下降[30]；同時，相對較多的乳酸和殘余的WSC可供好氧微生物分解利用，也不利于青貯飼料有氧暴露后的品質(zhì)穩(wěn)定[29]。在本研究中，無芒雀麥青貯發(fā)酵完成時因含有高濃度乳酸而有最低pH的同時添加蒙氏腸球菌和植物乳桿菌的ho+he處理，在有氧暴露期隨著乳酸濃度迅速下降，導致pH急劇升高，且該處理在厭氧發(fā)酵過程中乳酸發(fā)酵占優(yōu)勢，乙酸的生成量少，在有氧暴露期間未能有效抑制無芒雀麥青貯腐敗，有氧穩(wěn)定性比con處理下降了4 h。因此，本研究所用蒙氏腸球菌和植物乳桿菌未能在提高無芒雀麥青貯有氧穩(wěn)定性方面表現(xiàn)出積極的作用。

在有關(guān)青貯飼料中同型/異型乳酸菌混合添加而達到既可促進厭氧發(fā)酵也可提高有氧穩(wěn)定性的“雙重目的”的部分研究中，在高水分玉米、高粱、狗牙根和黑麥草青貯中的應(yīng)用取得了較好的“雙重功效”[13,31]。本研究中，當3種菌混合添加時，無芒雀麥青貯在有氧暴露試驗第8天乳酸和乙酸濃度顯著高于con與ho處理，酵母菌和霉菌數(shù)量則明顯低于con與ho處理，且有氧暴露試驗前5 d效果最優(yōu)，其青貯溫度變化所用時間則略低于he處理，但顯著高于con與ho處理。因此，將本試驗所用3種菌混合添加可以抑制開封后無芒雀麥青貯中腐敗菌的生長，雖抑制效果沒有單獨添加布氏乳桿菌作用效果好，但也可以明顯改善無芒雀麥青貯的有氧穩(wěn)定性。

4 結(jié) 論

禾草源異型發(fā)酵乳酸菌——布氏乳桿菌可有效抑制無芒雀麥青貯的有氧腐敗，保證無芒雀麥青貯有氧暴露期間品質(zhì)的穩(wěn)定；禾草源同型發(fā)酵乳酸菌——蒙氏腸球菌和植物乳桿菌未能在提高無芒雀麥青貯有氧穩(wěn)定性方面表現(xiàn)出積極的作用；將上述3種菌混合添加可以抑制開封后無芒雀麥青貯中腐敗菌的生長，雖抑制效果沒有單獨添加布氏乳桿菌效果好，但也可以明顯改善無芒雀麥青貯的有氧穩(wěn)定性。

[1] CHEN Y,WEINBERG Z G.Changes during aerobic exposure of wheat silages[J].Animal Feed Science and Technology,2009,154(1/2):76-82.

[2] TABACCO E,PIANO S,REVELLO-CHION A,et al.Effect ofLactobacillusbuchneriLN4637 andLactobacillusbuchneriLN40177 on the aerobic stability,fermentation products,and microbial populations of corn silage under farm conditions[J].Journal of Dairy Science,2011,94(11):5589-5598.

[3] 洪梅,刁其玉,姜成鋼,等.布氏乳桿菌對青貯發(fā)酵及其效果的研究進展[J].草業(yè)學報,2011,20(5):266-271.

[4] NKOSI B D,MEESKE R,PALIC D,et al.Effects of ensiling whole crop maize with bacterial inoculants on the fermentation,aerobic stability,and growth performance of lambs[J].Animal Feed Science and Technology,2009,154(3/4):193-203.

[5] FILYA I,SUCU E,KARABULUT A.The effect ofLactobacillusbuchnerion the fermentation,aerobic stability and ruminal degradability of maize silage[J].Journal of Applied Microbiology,2006,101(6):1216-1223.

[6] CONTRERAS-GOVEA F E,MUCK R E,BRODERICK G A,et al.Lactobacillusplantarumeffects on silage fermentation andinvitromicrobial yield[J].Animal Feed Science and Technology,2013,179(1/2/3/4):61-68.

[7] 楊艷,潘寶海,孫笑非.植物乳桿菌的功能及在動物生產(chǎn)中的應(yīng)用[J].飼料研究,2013(2):36-37.

[8] KELES G,DEMIRCI U.The effect of homofermentative and heterofermentative lactic acid bacteria on conservation characteristics of baled triticale-Hungarian vetch silage and lamb performance[J].Animal Feed Science and Technology,2011,164(1/2):21-28.

[9] NKOSI B D,MEESKE R,LANGA T,et al.Effects of bacterial silage inoculants on whole-crop maize silage fermentation and silage digestibility in rams[J].South African Journal of Animal Science,2011,41(4):350-359.

[10] SCHMIDT R J,HU W,MILLS J A,et al.The development of lactic acid bacteria andLactobacillusbuchneriand their effects on the fermentation of alfalfa silage[J].Journal of Dairy Science,2009,92(10):5005-5010.

[11] NKOSI B D,MEESKE R.Effects of ensiling totally mixed potato hash ration with or without a heterofermentative bacterial inoculant on silage fermentation,aerobic stability,growth performance and digestibility in lambs[J].Animal Feed Science and Technology,2010,161(1/2):38-48.

[12] FILYA I.The effect ofLactobacillusbuchneriandLactobacillusplantarumon the fermentation,aerobic stability,and ruminal degradability of low dry matter corn and sorghum silage[J].Journal of Dairy Science,2003,86(11):3575-3581.

[13] FILYA I.The effect ofLactobacillusbuchneri,with or without homofermentative lactic acid bacteria,on the fermentation,aerobic stability and ruminal degradability of wheat,sorghum and maize silages[J].Journal of Applied Microbiology,2003,95(5):1080-1086.

[14] 蔡義民,熊井清雄,廖芷,等.乳酸菌劑對青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)的改善效果[J].中國農(nóng)業(yè)科學,1995,28(2):73-82.

[15] 侯美玲,格根圖,孫林,等.甲酸、纖維素酶、乳酸菌劑對典型草原天然牧草青貯品質(zhì)的影響[J].動物營養(yǎng)學報,2015,27(9):2977-2986.

[16] 敖曉琳,蔡義民,胡愛華,等.接種植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)對小規(guī)模飼料稻青貯品質(zhì)的影響[J].微生物學通報,2014,41(6):1125-1131.

[17] 董艷.具有抑制婁地青霉的植物乳桿菌的篩選及其在青貯飼料中的應(yīng)用研究[D].碩士學位論文.呼和浩特:內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學,2015.

[18] 張麗英.飼料分析及飼料質(zhì)量檢測技術(shù)[M].3版.北京:中國農(nóng)業(yè)大學出版社,2007:48-78.

[19] OWENS V N,ALBRECHT K A,MUCK R E,et al.Protein degradation and fermentation characteristics of red clover and alfalfa silage harvested with varying levels of total nonstructural carbohydrates[J].Crop Science,1999,39(6):1873-1880.

[20] RANJIT N K,KUNG L,Jr.The effect ofLactobacillusbuchneri,Lactobacillusplantarum,or a chemical preservative on the fermentation and aerobic stability of corn silage[J].Journal of Dairy Science,2000,83(3):526-535.

[21] 劉晗璐.禾本科牧草乳酸菌發(fā)現(xiàn)及發(fā)酵品質(zhì)檢測與動物生產(chǎn)性能影響研究[D].博士學位論文.呼和浩特:內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學,2008.

[22] 柯文燦.不同種類添加劑對紫花苜蓿青貯脂肪酸和蛋白質(zhì)降解的影響[D].碩士學位論文.蘭州:蘭州大學,2015.

[23] TAYLOR C C,KUNG L,Jr.The effect ofLactobacillusbuchneri40788 on the fermentation and aerobic stability of high moisture corn in laboratory silos[J].Journal of Dairy Science,2002,85(6):1526-1532.

[24] CAI Y M,BENNO Y,OGAWA M,et al.Effect of applying lactic acid bacteria isolated from forage crops on fermentation characteristics and aerobic deterioration of silage[J].Journal of Dairy Science,1999,82(3):520-526.

[25] HOLZER M,MAYRHUBER E,DANNER H,et al.The role ofLactobacillusbuchneriin forage preservation[J].Trends in Biotechnology,2003,21(6):282-287.

[26] KUNG L,Jr.Aerobic stability of silages[C]//Proceedings of the 2nd International Symposium on Animal Production Under Grazing.Brazil:University of Vicosa,2008:233-248.

[27] DRIEHUIS F,OUDE ELFERINK S J W H,VAN WIKSELAAR P G.Fermentation characteristics and aerobic stability of grass silage inoculated with Lactobacillus buchneri,with or without homofermentative lactic acid bacteria[J].Grass and Forage Science,2001,56(4):330-343.

[28] SCHMIDT R J,KUNG L,Jr.The effects ofLactobacillusbuchneriwith or without a homolactic bacterium on the fermentation and aerobic stability of corn silages made at different locations[J].Journal of Dairy Science,2010,93(4):1616-1624.

[29] HUISDEN C M,ADESOGAN A T,KIM S C,et al.Effect of applying molasses or inoculants containing homofermentative or heterofermentative bacteria at two rates on the fermentation and aerobic stability of corn silage[J].Journal of Dairy Science,2009,92(2):690-697.

[30] KUNG L,Jr,TAYLOR C C,LYNCH M P,et al.The effect of treating alfalfa withLactobacillusbuchneri40788 on silage fermentation,aerobic stability,and nutritive value for lactating dairy cows[J].Journal of Dairy Science,2003,86(1):336-343.

[31] ADESOGAN A T,KRUEGER N,SALAWU M B,et al.The influence of treatment with dual purpose bacterial inoculants or soluble carbohydrates on the fermentation and aerobic stability of bermudagrass[J].Journal of Dairy Science,2004,87(10):3407-3416.

*Corresponding author, assistant professor, E-mail: grassland302@aliyun.com

(責任編輯 菅景穎)

Evaluation of Aerobic Stability ofBromusinermisLeyss.Silage Fermented by Homofermentative and/or Heterofermentative Lactic Acid Bacteria from Grass

Tana1WEI Rihua2Deqinghala3Narisu1WANG Hai1*

(1.InstituteofGrasslandResearchChineseAcademyofAgriculturalSciences/KeyLaboratoryofGrasslandEcologyandRestorationoftheMinistryofAgriculture,Hohhot010010,China; 2.CargillAnimalNutrition(InnerMongolia)Co.Ltd.,Baotou014000,China; 3.InnerMongolianLivestockImprovementStation,Hohhot010010,China)

This experiment was conducted to evaluate the action effect of homofermentative and/or heterofermentative lactic acid bacteria from grass on aerobic stability ofBromusinermisLeyss. silage. Two homofermentative lactic acid bacteria (LAB) (a strain ofLactobacillusplantarumand a strain ofEnterococcusmundtti) and a heterofermentative LAB (a strain ofLactobacillusbuchneri) from grass were selected and were used to prepare fermentation agents.BromusinermisLeyss. was harvested at the flowering stage, chopped to 2 to 3 cm lengths and treated with fermentation agents. Based on the bacteria type, four treatments were designed: 1) control treatment (con treatment), which was sprayed with sterile deionized water; 2) heterofermentative treatment (he treatment), which was sprayed withLactobacillusbuchneriliquid; 3) homofermentative treatment (ho treatment), which was sprayed with a mixed liquid ofLactobacillusplantarumandEnterococcusmundtti(1∶1); 4) heterofermentative+homofermentative treatment (he+ho treatment), which was sprayed with a mixed liquid ofLactobacillusplantarum,EnterococcusmundttiandLactobacillusbuchneri(1∶1∶1). The spraying dose of each treatment was 10 mL/kg fresh forage, and the total bacteria count was about 5×105CFU/g fresh forage. Each treatment had five replicates. After ensiling 60 days under lab condition, the aerobic stability ofBromusinermisLeyss. silage was evaluated by testing nutrient contents, microbial number and core temperature change. The results showed as follows: at the end of ensiling period (60 days), the pH of four treatments was significantly decreased compared with before silage (P<0.05), all treatments silage had a good fermentation quality (pH≤4.3) and especially ho treatment was the best. When exposed to air, the pH of con and ho treatments increased rapidly, and reached up to 7 on the 8th day of aerobic exposure; the increasing extent of pH of he+ho treatment was slightly lower than that of con and ho treatments, and the pH of he+ho treatment reached up to 6.3 on the 8th day of aerobic exposure which was significantly lower than that of con and ho treatments (P<0.05); the pH of he treatment increased slowly, and only was 4.4 on the 8th day of aerobic exposure which was significantly lower than that of other treatments (P<0.05). After 60 days of ensiling, the water soluble carbohydrate (WSC) content of ho treatment was the highest, and significantly higher than that of other treatments (P<0.05); the WSC content of ho treatment was the lowest, and significantly lower than that of other treatments (P<0.05). When exposed to air, ho treatment silage showed a sharp decline in the WSC content while he treatment decreased slowly. On the 8th day of aerobic exposure, the WSC content of he treatment was the highest, he+ho treatment was significantly lower than the former (P<0.05), while con and he treatments was significantly lower than he and he+ho treatments (P<0.05). The mold activity was obviously inhibited after silage fermentation, and the inhibitory effect of he and he+ho treatments was better in which mold was not detected. Moreover, the mold was not detected in the he+ho treatment until the 5th day of aerobic exposure, and it was not detected in the he treatment until the 8th day of aerobic exposure. The yeast quantity of he and he+ho treatments was significantly lower than that of con and he treatments on the 3rd and 5th day of aerobic exposure (P<0.05). Lactic and acetic acid concentrations of he and he+ho treatments were significantly higher than those of other 2 treatments on the 8th day of aerobic exposure (P<0.05). Aerobic stability of he, he+ho, con and ho treatments decreased systematically, which showed 194, 126, 62 and 58 h, respectively. Through synthetic analysis, the results indicate that inoculation withLactobacillusbuchnerialone or in combination with homofermentative lactic acid bacteriaLactobacillusplantarumandEnterococcusmundttican effectively inhibit the aerobic deterioration and ensure the stable quality ofBromusinermisLeyss. silage when exposed to air, even if the former is more effective. The results also confirm that inoculation with homofermentative lactic acid bacteriaLactobacillusplantarumandEnterococcusmundtticannot play an active role in the improvement of aerobic stability ofBromusinermisLeyss. silage.[ChineseJournalofAnimalNutrition, 2017, 29(4)：1301-1311]

BromusinermisLeyss.; homofermentative lactic acid bacteria; heterofermentative lactic acid bacteria; silage; aerobic stability

10.3969/j.issn.1006-267x.2017.04.027

2016-10-24

中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費專項資金(中國農(nóng)業(yè)科學院草原研究所1610332015023)；“十二五”國家科技支撐計劃項目(2012BAD13B07)

塔 娜(1980—)，女，蒙古族，內(nèi)蒙古蘇尼特左旗人，副研究員，碩士，研究方向為動物營養(yǎng)與飼料科學。E-mail: Tana_1980@163.com

*通信作者:王 海，助理研究員，E-mail: grassland302@aliyun.com

S816.5+3

A

1006-267X(2017)04-1301-11