過氧化氫誘導斜帶石斑魚原代肝細胞氧化損傷模型的構建

張潤蔚 王 玲 張春曉 宋 凱

(集美大學水產學院，廈門市飼料檢測與安全評價重點實驗室，廈門361021)

過氧化氫誘導斜帶石斑魚原代肝細胞氧化損傷模型的構建

張潤蔚 王 玲 張春曉 宋 凱*

(集美大學水產學院，廈門市飼料檢測與安全評價重點實驗室，廈門361021)

本試驗以斜帶石斑魚原代培養(yǎng)肝細胞為研究對象，以過氧化氫為刺激源，以肝細胞存活率和抗氧化指標的變化為判斷指標，旨在建立穩(wěn)定的斜帶石斑魚原代肝細胞氧化損傷模型。在原代肝細胞培養(yǎng)液中分別添加0(對照)、100、200、400、600、800和1 000 μmol/L過氧化氫，使之分別作用2、4、6、8、12和24 h，共42組，每組10個重復，測定肝細胞存活率。在得出適宜過氧化氫作用時間的基礎上，使每個濃度的過氧化氫(每個過氧化氫濃度設6個重復)作用于肝細胞適宜時間后，收集肝細胞和培養(yǎng)液測定抗氧化指標，篩選使肝細胞發(fā)生氧化損傷的適宜過氧化氫作用濃度。結果顯示：800 μmol/L過氧化氫作用肝細胞8 h，斜帶石斑魚肝細胞的存活率降低至61.98%；800和1 000 μmol/L組與其他各組相比，肝細胞超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶(600 μmol/L組除外)和過氧化氫酶活性顯著降低(P<0.05)，丙二醛與脂質過氧化物含量顯著升高(P<0.05)，但800和1 000 μmol/L組之間差異不顯著(P>0.05)。以上結果表明，過氧化氫作用濃度為800 μmol/L、作用時間為8 h，可作為建立斜帶石斑魚肝細胞氧化損傷模型的適宜條件。

斜帶石斑魚；原代肝細胞；過氧化氫；氧化損傷模型

石斑魚為我國重要的海水養(yǎng)殖魚類之一。近年來，高密度養(yǎng)殖脅迫、水體富營養(yǎng)化與營養(yǎng)失衡等集約化養(yǎng)殖帶來的各種不利因素嚴重阻礙了石斑魚產業(yè)化發(fā)展[1-3]。動物在受到外界有害因素作用時，會發(fā)生機體代謝功能紊亂[4-6]。由于魚類是水生低等脊椎動物，更易受到外界不良環(huán)境的影響，而適當?shù)耐饨鐟し磻墒刽~類逐步適應生活環(huán)境，提高其免疫效能，從而增加漁業(yè)的產量[6-7]，但外來的過度氧化應激刺激不僅影響魚類的生產能力，同時還會誘發(fā)多種魚類疾病，甚至造成大范圍的死亡[8-10]。

肝臟是脊椎動物機體新陳代謝重要的器官，能不斷地調整其細胞的生理狀態(tài)以適應環(huán)境變化[11]。研究表明，肝細胞能夠行使絕大部分肝臟的功能[12]，因此，國內外研究者多采用體外培養(yǎng)的肝細胞代替活體動物來研究某些物質的毒理作用或代謝途徑等。細胞模型的建立不僅可以減少試驗動物的數(shù)量，而且具有操作簡便、可重復性高，同時避免體內復雜因素干擾等優(yōu)點[13]，已廣泛應用于毒理學、藥理學等研究領域[14-15]。

近年來，學者們對一些經(jīng)濟魚類,如鯉魚[16](Cyprinuscarpio)、羅非魚[17](Oreochromismossambicus)、藍點石斑魚[18](Channapunctatus)及鯰魚[19](Silurusasotus)等的個體及單細胞的氧化應激反應相繼開展研究，然而有關石斑魚肝臟氧化損傷方面的研究非常匱乏?；谀壳皣鴥韧庀嚓P研究報道和研究水平，本試驗以斜帶石斑魚原代培養(yǎng)肝細胞為試驗材料，并測定細胞各種抗氧化指標作為參考，以確定建立過氧化氫(H2O2)誘導的斜帶石斑魚肝細胞氧化損傷模型的最佳條件。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

斜帶石斑魚[體重為(50±2) g，長度為(13.0±0.8) cm]由集美大學海水養(yǎng)殖試驗場提供。

1.2 主要試劑

H2O2原液、0.25%胰蛋白酶、L-15培養(yǎng)基、磷酸鹽緩沖液(PBS)、青霉素(10 000 IU/mL)、鏈霉素(10 000 μg/mL)、兩性霉素B、胰島素、胎牛血清，均購于Gibco公司(美國)；臺盼藍、二甲基亞砜(DMSO)，均購于上海捷瑞生物工程有限公司；指標測定所用測試盒均購于南京建成生物工程研究所；其他所有化學試劑均為分析純。

1.3 斜帶石斑魚原代肝細胞的培養(yǎng)

按照駱源等[20]的方法獲得斜帶石斑魚原代肝細胞，取對數(shù)生長期的細胞，用完全培養(yǎng)基(L-15培養(yǎng)基)調整細胞密度至2×105個/mL，接種于25 cm2培養(yǎng)瓶[培養(yǎng)液為含有20%胎牛血清(FBS)的L-15培養(yǎng)基]中，置于25 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中進行原代培養(yǎng)。本試驗利用血球計數(shù)板計數(shù)，以細胞活力(將細胞懸液與0.5%臺盼藍染液按1∶1體積比混合，1～2 min后于血球計數(shù)板上計數(shù)，活細胞呈透明卵圓形，死細胞被染成藍色，用活細胞占計數(shù)細胞的百分比表示細胞活力)大于90%的原代肝細胞用于后續(xù)試驗操作。

1.4 試驗設計

采用96孔細胞培養(yǎng)板，每孔接種細胞懸液100 μL，接種濃度在2×105個/mL。在原代肝細胞培養(yǎng)液中分別添加0(對照)、100、200、400、600、800和1 000 μmol/L H2O2，使之分別作用2、4、6、8、12和24 h，共42組，每組10個重復，測定肝細胞存活率。

以H2O2作用后的肝細胞存活率為主要指標初步篩選H2O2作用時間。在獲得H2O2適宜作用時間的基礎上，使每個濃度的H2O2(每個H2O2濃度設6個重復)作用于肝細胞適宜時間后，收集肝細胞和培養(yǎng)液測定抗氧化指標，進一步篩選使肝細胞發(fā)生氧化損傷的適宜H2O2作用濃度[21-22]。

1.5 肝細胞存活率和抗氧化指標的測定及方法

采用噻唑藍(MTT)比色法[23]測定吸光度(OD)值后，根據(jù)下列公式計算肝細胞的存活率：

肝細胞存活率(%)=100×不同濃度H2O2組

OD570 nm/對照組OD570 nm。

谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性采用二硫代二硝基苯甲酸法測定，超氧化物歧化酶(SOD)活性采用黃嘌呤氧化酶法測定，過氧化氫酶(CAT)活性采用比色法測定，丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸法測定，脂質過氧化物(LPO)含量采用熒光法測定。上述指標的詳細測定方法參照南京建成生物工程研究所試劑盒說明書進行。

1.6 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)經(jīng)Origin 2015進行整理和計算，用平均值±標準誤(mean±SE)表示。采用SPSS 19.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計和差異顯著性分析，先對數(shù)據(jù)進行方差齊性檢驗，如滿足差異顯著性分析條件則對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析(one-way ANOVA)，若組間存在顯著性差異，則再采用Duncan氏法進行多重比較檢驗組間差異顯著性，以P<0.05表示差異顯著，P>0.05表示差異不顯著。

2 結果與分析

2.1 H2O2作用濃度和作用時間對肝細胞存活率的影響

由表1可見，在每一作用時間下，隨著H2O2作用濃度的增加，肝細胞存活率呈降低趨勢。當作用時間≥8 h時，600～1 000 μmol/L組肝細胞存活率顯著低于同一作用時間下0～400 μmol/L組(P<0.05)。當H2O2作用濃度增加到800和1 000 μmol/L時，相比于作用2、4 h時，作用時間為6～24 h時肝細胞存活率均急劇減少，肝細胞存活率分別從2 h的89.83%和88.98%降低到24 h的44.53%和40.88%，細胞死亡率高達54%～60%。本試驗選擇細胞存活率在50%～65%作為判別指標[21]，在其范圍內的H2O2作用濃度與作用時間分別是800 μmol/L H2O2作用肝細胞8 h、800 μmol/L H2O2作用肝細胞12 h和1 000 μmol/L H2O2作用肝細胞8 h，其肝細胞存活率分別為61.98%、50.19%和60.08%。上述結果顯示800～1 000 μmol/L的H2O2作用肝細胞8 h后，可濃度依賴性地降低肝細胞存活率，肝細胞存活率降低程度適中，因此選擇8 h作為H2O2的適宜作用時間。

表1 H2O2作用濃度和作用時間對肝細胞存活率的影響

同列數(shù)據(jù)肩標相同字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同字母表示差異顯著(P<0.05)。下表同。

Values in the same column with the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05), while with different letter superscripts mean significant difference (P<0.05). The same as below.

2.2 以原代肝細胞抗氧化指標驗證氧化損傷模型的可靠性

為了驗證斜帶石斑魚氧化損傷模型的可靠性，對不同作用濃度H2O2作用8 h后的原代肝細胞抗氧化指標進行了測定。由表2可知，隨著H2O2作用濃度的升高，肝細胞GSH-Px、CAT和SOD活性逐漸降低。除600 μmol/L組的GSH-Px活性外，800和1 000 μmol/L組的GSH-Px、CAT和SOD活性顯著低于其他各組(P<0.05)，但800和1 000 μmol/L組之間無顯著差異(P>0.05)；對照組的GSH-Px、CAT和SOD活性最高，顯著高于其他各組(P<0.05)。

H2O2同時對斜帶石斑魚肝細胞的脂質過氧化程度有影響，主要反映在LPO與MDA含量2個指標的變化上。由表2可知，肝細胞LPO與MDA含量與抗氧化指標呈現(xiàn)相反的變化規(guī)律，均隨著H2O2作用濃度的增加而逐漸升高。除了100 μmol/L組與對照組無顯著差異(P>0.05)外，其他H2O2作用濃度組均顯著高于對照組(P<0.05)，并且200、400、600 μmol/L組之間無顯著差異(P>0.05)，800和1 000 μmol/L組之間無顯著差異(P>0.05)。

表2 各組斜帶石斑魚原代肝細胞的抗氧化指標

3 討 論

以斜帶石斑魚肝細胞的存活率達50%～65%作為評判標準[21]，根據(jù)此條件對H2O2作用濃度及作用時間進行初步篩選。本試驗中800 μmol/L H2O2作用8 h時肝細胞的存活率為61.98%，符合評判標準。在此基礎上，以抗氧化指標GSH-Px、SOD、CAT活性和MDA、LPO含量為判別依據(jù)，設定作用時間為8 h，800 μmol/L H2O2處理的原代肝細胞的抗氧化酶(GSH-Px、SOD和CAT)活性較對照組顯著降低，同時脂質過氧化產物(MDA和LPO)含量顯著提高。這說明，在800 μmol/L H2O2作用濃度下，斜帶石斑魚肝細胞內的脂質和酶系都發(fā)生了顯著變化，且這種損傷不會導致細胞全部死亡，因此H2O2的最佳作用濃度選為800 μmol/L。本研究結果與金鹿[21]利用H2O2誘導的奶牛乳腺上皮細胞氧化損傷模型檢測結果類似。本研究同時發(fā)現(xiàn)，H2O2作用濃度由800 μmol/L再繼續(xù)增加至1 000 μmol/L，相關指標未發(fā)生顯著變化。由此可見，800 μmol/L H2O2即可對斜帶石斑魚肝細胞產生明顯的氧化損傷，可以作為建立氧化損傷模型時的作用濃度。綜合本試驗的肝細胞存活率和抗氧化指標結果得出，以H2O2為應激源，建立斜帶石斑魚原代肝細胞氧化損傷模型的適宜作用濃度為800 μmol/L，作用時間為8 h。

4 結 論

在H2O2誘導的斜帶石斑魚肝細胞氧化損傷模型中，肝細胞存活率和抗氧化指標(GSH-Px、SOD、CAT活性及MDA、LOP含量)可以作為判別斜帶石斑魚肝細胞是否發(fā)生氧化損傷的指標，建立斜帶石斑魚原代肝細胞氧化損傷模型的適宜條件為800 μmol/L H2O2作用8 h。

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*Corresponding author, associate professor, E-mail: songkai@jmu.edu.cn

(責任編輯 菅景穎)

Establishment of Oxidative Damage Model of Primary Hepatocytes of Grouper (Epinepheluscoioides) Induced by Hydrogen Peroxide

ZHANG Runwei WANG Ling ZHANG Chunxiao SONG Kai*

(XiamenKeyLaboratoryforFeedQualityTestingandSafetyEvaluation,FisheriesCollege,JimeiUniversity,Xiamen361021,China)

This experiment was aimed to establish the stable oxidative damage model of primary hepatocytes of grouper using primary cultured hepatocytes of grouper (Epinepheluscoioides) as study object, hydrogen peroxide (H2O2) as stress source and the changes of hepatocytes survival rate and antioxidant indexes as judgment indexes. The concentrations of 0 (control), 100, 200, 400, 600, 800 and 1 000 μmol/L H2O2were added in the cultured fluid of primary hepatocytes, and were cultured by 2, 4, 6, 8, 12 and 24 h, respectively. There were 42 groups and each group had 10 replicates. After culturing, the survival rate of hepatocytes was detected. Based on the appropriate action time was obtained, each concentration of H2O2(each concentration of H2O2had 6 replicates) was used to culture hepatocytes for appropriate time. After culturing, the hepatocytes and cultured fluid were collected to determined antioxidant indexes, in order to select the appropriate action concentration of H2O2ensuring oxidative damage to hepatocytes. The results showed that the survival rate of hepatocytes induced by 800 μmol/L H2O2at 8 h was reduced to 61.98%. The experiment also revealed that the 800 and 1 000 μmol/L group was significantly decreased the activities of superoxide dismutase, glutathione peroxidase (except 600 μmol/L group) and catalase (P<0.05), and significantly increased the contents of malondialdehyde and lipid peroxidation compared with other groups (P<0.05). However, the 800 and 1 000 μmol/L groups had no significant differences (P>0.05). The results manifest that 800 μmol/L H2O2incubated for 8 h can be used as a suitable method to establish oxidative damage model of primary hepatocytes of grouper.[ChineseJournalofAnimalNutrition, 2017, 29(4)：1227-1232]

grouper (Epinepheluscoioides); primary hepatocytes; hydrogen peroxide; oxidative damage model

10.3969/j.issn.1006-267x.2017.04.018

2016-10-25

福建省科技廳(重點)項目“石斑魚保肝型飼料添加劑的研發(fā)與應用”(2016N0023)；國家自然科學基金青年基金項目“應用蛋白質組學技術研究皮質醇對斜帶石斑魚肝細胞代謝的影響機制”(31302198)；福建省科技重大專項專題“石斑魚健康養(yǎng)殖技術及高效配合飼料的研發(fā)和推廣應用”(2016NZ0001-3)

張潤蔚(1991—)，女，河北邢臺人，碩士研究生，從事水產生物學科學專業(yè)研究。E-mail: 1659002099@qq.com

*通信作者:宋 凱，副教授，碩士生導師，E-mail: songkai@jmu.edu.cn

Q813.1+1；S917.4

A

1006-267X(2017)04-1227-06