體外模擬消化法優(yōu)化生長豬飼糧非淀粉多糖酶譜

高理想 陳 亮 崔世貴 謝月華 張宏福*

(1.中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所，動物營養(yǎng)學國家重點實驗室，北京100193；2.中國農(nóng)業(yè)科學院淮安健康養(yǎng)殖與飼料研究中心，淮安223005；3.江蘇華威農(nóng)牧發(fā)展有限公司，淮安223005)

體外模擬消化法優(yōu)化生長豬飼糧非淀粉多糖酶譜

高理想1,2陳 亮1,2崔世貴2,3謝月華2,3張宏福1,2*

(1.中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所，動物營養(yǎng)學國家重點實驗室，北京100193；2.中國農(nóng)業(yè)科學院淮安健康養(yǎng)殖與飼料研究中心，淮安223005；3.江蘇華威農(nóng)牧發(fā)展有限公司，淮安223005)

針對飼糧非淀粉多糖(NSP)酶的海量篩選工作和動物試驗間的可比性差等問題，本研究探討使用體外模擬法優(yōu)化生長豬玉米-豆粕型飼糧和玉米-雜粕型飼糧的NSP酶譜。首先采用單因素隨機試驗設計，研究NSP酶的添加水平與飼糧體外干物質(zhì)消化率(IVDMD)的關系。在玉米-豆粕型飼糧和玉米-雜粕型飼糧中分別添加不同水平的纖維素酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶、β-甘露聚糖酶、α-半乳糖苷酶和果膠酶6種NSP酶，分析各NSP酶對飼糧IVDMD的作用效果。然后采用二次回歸旋轉正交組合試驗設計，篩選2種飼糧中6種NSP酶的最佳酶譜。結果表明：1)6種NSP酶的添加水平與2種類型豬飼糧IVDMD之間存在二次曲線關系。2)α-半乳糖苷酶對玉米-豆粕型飼糧的IVDMD提升最高，達到了1.28%，木聚糖酶對玉米-雜粕型飼糧的IVDMD提升最高，達到了1.95%。3)玉米-豆粕型飼糧的最佳酶譜為：纖維素酶533.6 U/kg、木聚糖酶9 983.7 U/kg、β-葡聚糖酶1 014.4 U/kg、β-甘露聚糖酶4 080.6 U/kg、α-半乳糖苷酶251.6 U/kg和果膠酶107.3 U/kg。玉米-雜粕型飼糧的最佳酶譜為：纖維素酶960.0 U/kg、木聚糖酶17 177.6 U/kg、β-葡聚糖酶405.8 U/kg、β-甘露聚糖酶19 023.2 U/kg、α-半乳糖苷酶307.2 U/kg和果膠酶96.9 U/kg。4)優(yōu)化后的酶譜使玉米-豆粕型飼糧的IVDMD提升了3.26%，使玉米-雜粕型飼糧的IVDMD提升了3.75%。由此可見，6種NSP酶聯(lián)合使用能夠更大程度地提高生長豬玉米-豆粕型飼糧和玉米-雜粕型飼糧的IVDMD。

非淀粉多糖酶；生長豬；飼糧；體外干物質(zhì)消化率；優(yōu)化

非淀粉多糖(NSP)作為一種抗營養(yǎng)因子，常影響畜禽飼糧營養(yǎng)物質(zhì)的消化[1-2]。NSP酶由于可降低NSP的抗營養(yǎng)作用，越來越受到關注[3-5]。許多研究表明，NSP酶能夠降低NSP的抗營養(yǎng)作用，提高營養(yǎng)物質(zhì)利用率[6-7]，改善腸道健康[8-9]。但是也有研究發(fā)現(xiàn)，NSP酶對豬生產(chǎn)性能[10-11]、營養(yǎng)物質(zhì)利用率[12]沒有影響。由于不同飼糧中NSP的含量和組成差異較大，而NSP酶作為生物反應的催化劑，對底物具有專一性，因此，NSP酶的合理配伍是充分發(fā)揮其對飼糧中NSP降解作用的關鍵[13]。但是針對不同的飼糧，通過動物試驗方法來篩選與之相適應的NSP酶的配伍，不但工作量巨大，而且結果變異比較大，不能滿足實際需求。近年來，一些研究者通過體外模擬消化的方法來研究飼糧中添加NSP酶的效果[14-15]，為高效、快速的優(yōu)化NSP酶的配伍提供了一個可行的途徑。王恩玲等[16]和何科林等[17]使用胃蛋白酶-胰液素的體外2步模擬消化法對NSP酶在家禽飼糧中的作用效果進行了體外評定，取得了良好的促生產(chǎn)效果。Narasimha等[18]使用體外消化法成功篩選出了纖維素酶、木聚糖酶和β-葡聚糖酶在幾種飼料原料中的最佳組合。但是，使用體外模擬消化法優(yōu)化生長豬不同飼糧NSP酶譜的研究目前還沒有報道。此外，胰液素是含有多種消化酶的復合物，不同批次之間組成有所不同，無法實現(xiàn)模擬腸液的重復以及測試重演性的需求。本實驗室前期在研究生長豬小腸液組成的基礎上開發(fā)了豬模擬小腸液[19]，并在豬飼糧的體外模擬消化上取得了較好的效果[20]。因此，本試驗使用基于生長豬生理消化液組成依據(jù)的體外三角瓶2步消化法，在玉米-豆粕型和玉米-雜粕型2種不同類型的生長豬飼糧中使用6種NSP酶，探討NSP酶對不同類型飼糧的作用效果，探索優(yōu)化豬飼糧中NSP酶配伍的方法，為NSP酶在豬飼糧中的高效使用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 NSP酶及酶活性測定

選用纖維素酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶、β-甘露聚糖酶、α-半乳糖苷酶和果膠酶6種NSP酶。纖維素酶活性測定參照NY/T 912—2004[21]，木聚糖酶活性測定參照GB/T 23874—2009[22]，β-葡聚糖酶活性測定參照NY/T 911—2004[23]。β-甘露聚糖酶活性測定采用還原糖比色法，酶活性單位定義為：在37 ℃、pH 5.5的條件下，每分鐘從濃度為3 mg/mL的甘露聚糖(Sigma G0753)溶液中降解釋放1 μmol還原糖所需要的酶量，測定波長為540 nm。α-半乳糖苷酶活性測定采用比色法，酶活性單位定義為：在37 ℃、pH 5.5的條件下，每分鐘從濃度為10 mmol/L的對硝基苯-α-D-吡喃半乳糖苷(Sigma N0877)溶液中降解釋放1 μmol對硝基酚所需要的酶量，測定波長為400 nm。果膠酶活性測定采用還原糖比色法，酶活性單位定義為：在37 ℃、pH 5.5的條件下，每分鐘從濃度為4 mg/mL的聚半乳糖醛酸(Sigma P9135)溶液中降解釋放1 μmol半乳糖醛酸所需要的酶量，測定波長為540 nm。

實測6種NSP酶活性值為：纖維素酶6 867 U/g、木聚糖酶33 290 U/g、β-葡聚糖酶12 076 U/g、β-甘露聚糖酶49 283 U/g、α-半乳糖苷酶2 753 U/g、果膠酶1 129 U/g。

1.2 試驗飼糧

本試驗于2014—2015年在中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所動物營養(yǎng)學國家重點實驗室進行。參照NRC(2012)[24]生長豬飼養(yǎng)標準，配制玉米-豆粕型和玉米-雜粕型2種飼糧，試驗飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。參考黃慶華等[2]的方法對飼糧NSP的含量進行測定，結果見表2.

表1 試驗飼糧組成及營養(yǎng)水平(飼喂基礎)

1)預混料為每千克飼糧提供 The premix provided the following per kg of diets：VA 8 250 IU，VD3825 IU，VE 40 IU，VK34 mg，生物素 biotin 0.2 mg，氯化膽堿 choline chloride 600 mg，葉酸 folic acid 2 mg，煙酸 nicotinic acid 35 mg，泛酸 pantothenic acid 15 mg，VB25 mg，VB11 mg，VB62 mg，VB1225 μg，Cu (as copper sulfate) 50 mg，I (as potassium iodide) 0.5 mg， Fe (as ferrous sulfate) 80 mg，Mn (as manganese sulfate) 25 mg，Se (as sodium selenite) 0.15 mg，Zn (as zinc sulfate) 100 mg。

2)實測值 Measured values。

表2 飼糧的非淀粉多糖含量(干物質(zhì)基礎)

1.3 體外消化率的測定

1.3.1 試劑的配制

胃緩沖液、小腸緩沖液按照趙峰等[25]的方法進行制備，用KOH將小腸緩沖液pH調(diào)為7.0，其余組成不變。模擬消化液的制備如下：

模擬豬胃液：稱取184.38 kU的胃蛋白酶(Sigma，P7000)溶解于250 mL pH 2.0的胃緩沖溶液中(39 ℃下標定pH)，緩慢攪拌直至溶解(臨用前配制)。

模擬豬小腸液：量取淀粉酶(Sigma，A3306)60.89 kU，胰蛋白酶(Amersco，0785)19.00 kU，糜蛋白酶(Amersco，0164)2.39 kU，脂肪酶(Sigma，L3126)919.2 U溶解于25 mL去離子水中，并緩慢攪拌直至溶解(臨用前配制)。

1.3.2 體外消化法操作過程

準確稱取1 g(過60目篩)飼料樣品(精確至0.000 1 g)，置于50 mL三角瓶中，向三角瓶中加入16 mL模擬豬胃液，小心混合均勻，用封口膜密封。

放于39 ℃恒溫水浴搖床中(180 r/min)。準確消化4 h，完成胃期的模擬消化。

完成胃期模擬消化后，打開封口膜，向三角瓶中準確加入4 mL小腸緩沖液，水浴搖床運行5 min后，加入預先配制的2 mL模擬豬小腸液。封口膜密封，39 ℃恒溫水浴搖床(180 r/min)中進

行22 h的小腸期模擬消化。取出三角瓶，室溫靜置30 min，用事先已絕干稱重的濾紙(Whatman 1541，孔徑22～25 μm)對三角瓶中的消化殘渣真空抽濾。將抽濾后的殘渣和濾紙置于105 ℃烘箱中烘干至恒重。

1.4 試驗設計

采用單因子試驗設計，在2種飼糧中分別添加不同水平的6種NSP酶。采用基于豬生理消化液組成的體外三角瓶2步法(模擬豬胃液+模擬豬小腸液)，通過測定體外干物質(zhì)消化率(invitrodry matter digestibility,IVDMD)，分析各NSP酶對不同類型飼糧IVDMD的作用。然后采用六元二次回歸旋轉正交組合試驗設計，進行最佳酶譜組合的篩選。6種NSP酶為6個影響因子，每個因子設置5個水平，分別用-2.384、-1、0、1、2.384編碼酶添加水平，以IVDMD為指標篩選出最佳酶譜組合。

1.5 數(shù)據(jù)處理

使用SAS 9.2軟件的GLM模塊分析單一NSP酶添加水平與飼糧IVDMD的回歸關系。使用六元二次正交回歸旋轉設計確定各因素的組合，試驗數(shù)據(jù)用SAS 9.2 RSREG模塊進行分析，P<0.05為差異顯著水平，0.05≤P<0.10為有顯著趨勢。

2 結果與分析

2.1 玉米-豆粕型飼糧和玉米-雜粕型飼糧營養(yǎng)物質(zhì)含量和NSP組成

從表1可以看出，玉米-豆粕型飼糧的粗蛋白質(zhì)含量和總能分別為17.2%和16.46 MJ/kg，與玉米-雜粕型飼糧(17.7%，16.42 MJ/kg)比較接近。但是由于玉米-豆粕型飼糧中玉米含量較高，所以其淀粉含量(44.2%)高于玉米-雜粕型飼糧(36.8%)，中型洗滌纖維含量(10.5%)和酸性洗滌纖維含量(2.8%)均低于玉米-雜粕型飼糧的13.1%和6.1%。

從表2可以看出，玉米-雜粕型飼糧的總NSP、不可溶性NSP和可溶性NSP的含量均高于玉米-豆粕型飼糧。從NSP的組成來看，玉米-雜粕型飼糧NSP的大部分組分也高于玉米-豆粕型飼糧，阿拉伯木聚糖是2種飼糧NSP的主要組成部分，其次是葡萄糖。

2.2 NSP酶對玉米-豆粕型飼糧IVDMD的影響

6種單一NSP酶對玉米-豆粕型飼糧IVDMD的影響見表3所示。在較低的添加水平時，玉米-豆粕型飼糧IVDMD均隨著NSP酶添加水平的增加而提高，當纖維素酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶、β-甘露聚糖酶、α-半乳糖苷酶和果膠酶的添加水平分別為60、200、80、60、80和100 μg/g時，IVDMD達到最大，不再隨著添加水平的提高而上升。

從表4可以看出，6種NSP酶的添加水平與IVDMD之間都呈現(xiàn)二次曲線關系(P<0.01)，即IVDMD不會隨著NSP添加水平的持續(xù)升高而一直增加。通過模型計算的各NSP酶作用下IVDMD最大值和實際測定的最大值均非常接近。不同NSP酶單一作用時對IVDMD的提升程度不一，α-半乳糖苷酶對玉米-豆粕型飼糧IVDMD提升程度最大，達到了1.28%，其次是β-甘露聚糖酶，達到了1.05%，纖維素酶提升最小，只有0.62%。

2.3 各NSP酶對玉米-雜粕型飼糧IVDMD的影響

6種單一NSP酶對玉米-雜粕型飼糧IVDMD的影響如表5所示。與玉米-豆粕型飼糧類似，在較低的添加水平時，玉米-雜粕型飼糧IVDMD均隨著添加水平的增加而提高，當纖維素酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶、β-甘露聚糖酶、α-半乳糖苷酶和果膠酶的添加水平分別為100、400、80、300、100和100 μg/g時，IVDMD達到最大，不再隨著添加水平的提高而上升。

從表6可以看出，6種NSP酶中除木聚糖酶和β-葡聚糖酶外，添加水平與IVDMD之間均呈現(xiàn)二次曲線關系(P<0.01)，即IVDMD不會隨著NSP添加水平的持續(xù)增加而一直上升。雖然木聚糖酶和β-葡聚糖酶與IVDMD的二次模型不顯著(P>0.05)，但是IVDMD也沒有隨著這2種酶添加水平的增加而一直上升。通過模型計算的各NSP酶作用下IVDMD最大值和實際測定的最大值也均非常接近。單一NSP酶作用中，木聚糖酶和β-甘露聚糖酶對玉米-雜粕型飼糧的IVDMD提升作用較大，分別達到了1.95%和1.90%，對IVDMD提升程度最低的是β-葡聚糖酶，只有0.63%。

2.4 IVDMD與NSP酶譜回歸模型的建立及最佳酶譜組合的篩選

當單一的NSP酶對飼糧的IVDMD提升作用達到最大時，即隨著NSP酶添加水平的增加，飼糧的IVDMD不再繼續(xù)上升時，選取此時的添加水平為0編碼水平。在玉米-豆粕型飼糧中，使IVDMD達到最大值時纖維素酶、木聚糖酶、β-甘露聚糖酶、α-半乳糖苷酶、β-葡聚糖酶的添加水平分別為60、200、60、80、80和100 μg/g。在玉米-雜粕型飼糧中，使IVDMD達到最大值時纖維素酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶、β-甘露聚糖酶、α-半乳糖苷酶和果膠酶的添加水平分別為100、400、80、300、100和100 μg/g。按照六元二次正交旋轉組合試驗設計的要求，確定各因素(NSP酶)的編碼值及相應水平(表7)。進行不同組合下的體外消化試驗，每種飼糧各進行53組試驗。根據(jù)體外消化試驗結果，建立IVDMD(Y，%)與NSP酶添加水平(X，μg/g)的六元二次回歸方程，回歸方程及相關參數(shù)見表8。

表7 NSP酶對IVDMD影響的六元二次回歸正交旋轉組合設計因素及水平

表8 飼糧最佳酶譜回歸方程及其參數(shù)

進一步分析了6種NSP酶兩兩之間的交互作用，結果發(fā)現(xiàn)(數(shù)據(jù)未列出)：在玉米-豆粕型飼糧中，纖維素酶和木聚糖酶(P=0.013 3)、纖維素酶和β-甘露聚糖酶(P=0.050 3)、木聚糖酶和β-葡聚糖酶(P=0.054 0)以及β-甘露聚糖酶和α-半乳糖苷酶(P=0.054 0)存在正的互作效應或具有協(xié)同效應的趨勢(0.050.05)。玉米-豆粕型飼糧和玉米-雜粕型飼糧的回歸方程均達顯著水平(P<0.05)。說明6種NSP酶與IVDMD的函數(shù)關系是可用的用此模型進行優(yōu)化分析獲得最佳酶譜組合(表9)。

對優(yōu)化出的酶譜進行有效性驗證，結果如表10所示。經(jīng)過優(yōu)化后的NSP酶譜理論上使玉米-豆粕型飼糧的IVDMD達到83.17%，理論提升3.82%，實際測定的IVDMD為82.61%，實際上提升了3.26%。經(jīng)過優(yōu)化后的NSP酶譜理論上使玉米-雜粕型飼糧的IVDMD達到74.37%，理論提升3.51%，實際測定的IVDMD為74.61%，實際上提升了3.75%。

表9 飼糧最佳NSP酶譜組合

3 討 論

3.1 基于飼糧NSP組成篩選豬飼糧NSP酶譜的重要性

本試驗在實驗室前期建立的測定飼糧NSP含量和組成的方法的基礎上[2]，對2種飼糧的NSP含量和組分進行了測定。從結果可以看出，含有棉籽粕、菜籽粕和甜菜粕的玉米-雜粕型飼糧的NSP含量高于玉米-豆粕型飼糧。2種飼糧NSP的組分包括阿拉伯木聚糖、葡萄糖、糖醛酸、甘露糖、半乳糖和鼠李糖等，巖藻糖的含量很低。豬飼糧中大部分NSP的降解是在大腸中微生物的作用下發(fā)生的[26-27]，因此，NSP的抗營養(yǎng)作用會影響營養(yǎng)物質(zhì)在胃和小腸中的消化吸收。而豬飼糧中NSP的降解程度與NSP的溶解度、多糖聚合物的類型以及和細胞壁其他成分結構上的關聯(lián)程度有關[28]。一些研究發(fā)現(xiàn)，NSP酶可提高豬飼糧干物質(zhì)消化率[6,29]、氮的消化率[30-31]和能量消化率[10,32]，但是也有一些研究發(fā)現(xiàn)豬飼糧中添加NSP酶對干物質(zhì)消化率[11]、蛋白質(zhì)消化率[12]和能量消化率[29]沒有影響。由這些文獻報道可以看出，NSP酶對豬的生長性能以及營養(yǎng)物質(zhì)消化率的影響是不一致的，這種差異很大程度上是由于飼糧的組成和酶的選擇不對稱造成的。所以，根據(jù)飼糧中NSP的組成和含量，添加與之相適應的NSP酶種類，可充分挖掘出飼糧的營養(yǎng)價值。

體外模擬消化法以其具有的快速、重復性好以及與生物法相關性高等特點，被一些研究者用來進行NSP酶作用效果的研究。Bedford等[14]使用胃蛋白酶-胰液素2步模擬消化法，根據(jù)不同水平的木聚糖酶對食糜黏度的影響成功預測了在肉雞小麥類飼糧中添加木聚糖酶的效果。Malathi等[15]研究了3種不同菌株產(chǎn)生的NSP酶對幾種飼料原料的體外消化作用的影響，發(fā)現(xiàn)不同來源的NSP酶對飼料原料的黏度和總糖釋放量的作用不同。Saleh等[33]研究了幾種單一的NSP酶對豆粕體外粗蛋白質(zhì)和干物質(zhì)消化率的影響，發(fā)現(xiàn)果膠酶對豆粕的IVDMD提升最大。Narasimha等[18]使用體外消化法在確定纖維素酶、木聚糖酶和β-葡聚糖酶在幾種飼料原料中最適添加水平的基礎上，進一步針對不同的原料篩選出了3種NSP酶的最佳組合。以上研究者使用的體外消化法均是基于Boisen等[34]建立的以“三角瓶+搖床”為測試工具的方法與手段。許多研究發(fā)現(xiàn)使用以三角瓶為反應容器的體外酶法測定的飼糧體外消化率與體內(nèi)消化率之間具有很高的相關性。Boisen等[34]使用此方法測定的飼糧有機物體外消化率與豬的生物學法測定的表觀能量消化率之間的相關系數(shù)達到了0.94。Regmi等[35]使用此方法測定的21個批次大麥的體外能量消化率與生物學法測定的表觀能量消化率之間的相關系數(shù)達到了0.81。此外，通過酶法測定豬飼糧的消化能值也已被丹麥、荷蘭、法國等發(fā)達國家所認同，并成為其新型飼養(yǎng)標準的核心技術[36]。

但是，國內(nèi)外研究者們普遍使用的胃蛋白酶+胰液素的體外模擬消化體系中，胰液素是從豬胰腺中提取的含有多種消化酶的復合物，不同批次胰液素在組成上不是完全相同的，無法實現(xiàn)對模擬消化重演性的需求。此外，針對豬、雞等不同的動物，均使用胰液素來進行模擬消化，是脫離動物的消化生理依據(jù)的。本實驗室前期在研究豬消化生理參數(shù)的基礎上，開發(fā)了基于生長豬消化生理依據(jù)的模擬豬小腸液，能很好的模擬豬飼糧在動物體內(nèi)的消化過程，體內(nèi)外的相關系數(shù)在0.95以上[19-20]。因此，本研究采用“三角瓶+基于豬生理依據(jù)配制的模擬消化液”來研究6種NSP酶對2種不同類型生長豬飼糧體外消化率的影響。結果表明，2種飼糧的IVDMD并不是隨著NSP酶添加水平的增加而一直升高，當NSP酶的添加水平到一定程度時，飼糧的IVDMD不再上升，說明NSP酶的添加有適宜水平的問題，并不是越高越好。不同飼糧中同一種NSP酶達到臨界點時的添加水平也不相同，這是由于不同類型飼糧中NSP的含量不同。2種飼糧中6種NSP酶單獨作用時的最適添加水平差別很大，比如玉米-雜粕型飼糧中木聚糖酶的單獨最適添加水平為400 μg/g，β-甘露聚糖酶的單獨最適添加水平為300 μg/g，而玉米-豆粕型飼糧中木聚糖酶的單獨最適添加水平為200 μg/g，β-甘露聚糖酶的單獨最適添加水平僅為60 μg/g。因此，根據(jù)不同類型飼糧中NSP的含量和組成的不同，篩選與其相適合的NSP酶的配伍尤為重要。

3.2 單一NSP酶的添加對飼糧IVDMD的影響

不同類型的飼糧由于組成不同，導致其NSP的含量和組成也不同。本試驗在研究單一NSP酶對2種類型飼糧IVDMD的作用時發(fā)現(xiàn)，玉米-雜粕型飼糧中6種NSP酶的最佳添加水平普遍高于玉米-豆粕型飼糧，尤其是木聚糖酶和β-甘露聚糖酶。木聚糖酶的添加使玉米-雜粕型飼糧的IVDMD提高了1.95%，高于玉米-豆粕型飼糧的0.68%，β-甘露聚糖酶的添加使玉米-雜粕型飼糧的IVDMD提高了1.90%，也高于玉米-豆粕型飼糧的1.05%。這主要是因為玉米中的NSP含量只有8%左右，而玉米-雜粕型飼糧中含有菜籽粕、棉籽粕和甜菜粕，而豆粕、菜籽粕和棉籽粕的NSP含量分別在22%、24%和30%左右，甜菜粕中NSP的含量更是高達65%。從表2可以看出，玉米-豆粕型飼糧的總NSP含量為13.29%，而玉米-雜粕型飼糧的總NSP含量達到了18.43%。在玉米-雜粕型飼糧中木聚糖含量達到了6.79%，是其NSP的主要組成部分，甘露聚糖含量也較高。隨著高水平的木聚糖和甘露聚糖的降解，其IVDMD會有比較大的提升。雖然在玉米-豆粕型飼糧中，木聚糖和葡萄糖的含量較高，但是α-半乳糖苷酶和β-甘露聚糖酶對玉米-豆粕型飼糧IVDMD提升程度高于木聚糖酶和纖維素酶，這可能是由于酶具有底物專一性，而不同的原料中，NSP的長鏈骨架的構成和鍵型以及交聯(lián)基團有所差異。這更進一步說明了不能盲目的依據(jù)飼糧中NSP的含量去確定NSP酶的添加水平。

3.3 NSP酶譜對飼糧IVDMD的提升作用

飼糧中的NSP是由其各組分通過多種類型的化學鍵交聯(lián)而成的復雜結構，只有使它們之間的相關連接被破壞，才能破壞其抗營養(yǎng)性，發(fā)揮飼糧營養(yǎng)潛能[37-39]。NSP組分和結構的復雜性導致了單一的NSP酶很難充分發(fā)揮作用，多種NSP酶的共同作用才有可能有效地降解鏈式結構，釋放營養(yǎng)物質(zhì)，提高飼糧的營養(yǎng)價值[40-41]。從本試驗結果可以看出，經(jīng)過優(yōu)化后的NSP酶譜，其對各自飼糧的IVDMD的提升程度均高于單一酶的作用。這表明6種NSP酶的協(xié)同作用，使飼糧中的NSP得到了更充分的降解。Malathi等[15]通過體外消化法測定消化產(chǎn)物的黏度和總糖釋放量對幾種酶譜組合的效果進行了對比，發(fā)現(xiàn)與纖維素酶+木聚糖酶組合以及纖維素酶+木聚糖酶+β-葡聚糖酶組合相比，木聚糖酶+纖維素酶+果膠酶+β-葡聚糖酶組合使豆粕的總糖釋放量顯著增加。Saleh等[33]研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過體外2步模擬消化后，纖維素酶、果膠酶、木聚糖酶、葡聚糖酶和半纖維素酶組合作用時玉米-豆粕型飼糧的總糖釋放率高于各種酶單一作用時，與本試驗的結果也相一致。本試驗中，優(yōu)化后的NSP酶譜對NSP含量相對較高的玉米-雜粕型飼糧的IVDMD提升程度相對高于NSP含量較低的玉米-豆粕型飼糧。趙敏[42]研究發(fā)現(xiàn)，NSP酶對蛋雞玉米-雜粕型飼糧的離體消化能的提升高于玉米-豆粕型飼糧。何科林等[17]研究發(fā)現(xiàn)，NSP酶對肉雞小麥型飼糧的離體消化能的提升也高于玉米-豆粕型飼糧。以上結果均和本試驗的研究結果相一致。這是因為NSP酶能顯著提高飼糧IVDMD的基礎是飼糧中的NSP含量，NSP含量高的飼糧，NSP酶對其消化率的提升作用才會更明顯，玉米-豆粕型飼糧的NSP含量(13.29%)低于玉米-雜粕型飼糧(18.43%)，所以NSP酶對其的作用效果略低。

4 結 論

① 基于豬生理消化液組成依據(jù)的胃蛋白酶-模擬小腸液體外2步消化法是快速優(yōu)化生長豬飼糧NSP酶譜的可行的途徑，可為生產(chǎn)上對NSP酶作用效果的初步預判提供幫助。

② 在本試驗條件下，生長豬玉米-豆粕型飼糧的最佳NSP酶譜組成為：纖維素酶533.6 U/kg，木聚糖酶9 983.7 U/kg，β-甘露聚糖酶4 080.6 U/kg，α-半乳糖苷酶251.6 U/kg，β-葡聚糖酶1 014.4 U/kg，果膠酶107.3 U/kg；生長豬玉米-雜粕型飼糧的最佳NSP酶譜組成為：纖維素酶960.0 U/kg，木聚糖酶17 177.6 U/kg，β-甘露聚糖酶19 023.2 U/kg，α-半乳糖苷酶307.2 U/kg，β-葡聚糖酶405.8 U/kg，果膠酶96.9 U/kg。

③ 在本試驗條件下，針對2種類型飼糧篩選的NSP酶譜，分別使玉米-豆粕型飼糧的IVDMD提高3.26%、玉米-雜粕型飼糧的IVDMD提高3.75%。

[1] BACH KNUDSEN K E.Carbohydrate and lignin contents of plant materials used in animal feeding[J].Animal Feed Science and Technology,1997,67(4):319-338.

[2] 黃慶華,陳亮,高理想,等.乙酸酐衍生化氣相色譜法測定飼料非淀粉多糖含量時適宜稱樣量確定依據(jù)的研究[J].動物營養(yǎng)學報,2015,27(5):1620-1631.

[3] HOODA S,METZLER-ZEBELI B U,VASANTHAN T,et al.Effects of viscosity and fermentability of purified non-starch polysaccharides on ileal and total tract nutrient digestibility in ileal-cannulated grower pigs[J].Livestock Science,2010,134(1/2/3):79-81.

[4] CHOCT M,DERSJANT-LI Y,MCLEISH J,et al.Soy oligosaccharides and soluble non-starch polysaccharides:a review of digestion,nutritive and anti-nutritive effects in pigs and poultry[J].Asian-Australasian Journal of Animal Science,2010,23(10):1386-1398.

[5] BROWNLEE I A.The physiological roles of dietary fibre[J].Food Hydrocolloids,2011,25(2):238-250.

[6] NORTEY T N,PATIENCE J F,SIMMINS P H,et al.Effects of individual or combined xylanase and phytase supplementation on energy,amino acid,and phosphorus digestibility and growth performance of grower pigs fed wheat-based diets containing wheat millrun[J].Journal of Animal Science,2007,85(6):1432-1443.

[7] ZHANG G G,YANG Z B,WANG Y,et al.Effects of dietary supplementation of multi-enzyme on growth performance,nutrient digestibility,small intestinal digestive enzyme activities,and large intestinal selected microbiota in weanling pigs[J].Journal of Animal Science,2014,92(5):2063-2069.

[8] HE J,YIN J,WANG L,et al.Functional characterisation of a recombinant xylanase fromPichiapastorisand effect of the enzyme on nutrient digestibility in weaned pigs[J].British Journal of Nutrition,2010,103(10):1507-1513.

[9] KIARIE E,NYACHOTI C M,SLOMINSKI B A,et al.Growth performance,gastrointestinal microbial activity,and nutrient digestibility in early-weaned pigs fed diets containing flaxseed and carbohydrase enzyme[J].Journal of Animal Science,2007,85(11):2982-2993.

[10] OLUKOSI O A,SANDS J S,ADEOLA O.Supplementation of carbohydrases or phytase individually or in combination to diets for weanling and growing-finishing pigs[J].Journal of Animal Science,2007,85(7):1702-1711.

[11] WOYENGO T A,SANDS J S,GUENTER W,et al.Nutrient digestibility and performance responses of growing pigs fed phytase- and xylanase-supplemented wheat-based diets[J].Journal of Animal Science,2008,86(4):848-857.

[13] ZIJLSTRA R T,OWUSU-ASIEDU A,SIMMINS P H.Future of NSP-degrading enzymes to improve nutrient utilization of co-products and gut health in pigs[J].Livestock Science,2010,134(1/2/3):255-257.

[14] BEDFORD M R,CLASSEN H L.Aninvitroassay for prediction of broiler intestinal viscosity and growth when fed rye-based diets in the presence of exogenous enzymes[J].Poultry Science,1993,72(1):137-143.

[15] MALATHI V,DEVEGOWDA G.Invitroevaluation of nonstarch polysaccharide digestibility of feed ingredients by enzymes[J].Poultry Science,2001,80(3):302-305.

[16] 王恩玲,張宏福,趙峰,等.離體法優(yōu)化肉鴨日糧非淀粉多糖酶酶譜的研究[J].飼料工業(yè),2008,29(10):9-14.

[17] 何科林,薩仁娜,高杰,等.體外法優(yōu)化肉雞日糧非淀粉多糖酶[J].中國農(nóng)業(yè)科學,2012,45(21):4457-4464.

[18] NARASIMHA J,NAGALAKSHMI D,REDDYY R,et al.Evaluation of non starch polysaccharide degrading enzymes and enzyme combinations for their ability to degrade non starch polysaccharides of layer diet by two stageinvitrodigestion assay[J].Journal of Veterinary & Animal Sciences,2013,9(3):188-194.

[19] 胡光源,趙峰,張宏福,等.飼糧蛋白質(zhì)來源與水平對生長豬空腸液組成的影響[J].動物營養(yǎng)學報,2010,22(5):1220-1225.

[20] CHEN L,GAO L X,HUANG Q H,et al.Prediction of digestible energy of feed ingredients for growing pigs using a computer-controlled simulated digestion system[J].Journal of Animal Science,2014,92(9):3887-3894.

[21] 中華人民共和國農(nóng)業(yè)部.NY/T 912—2004 飼料添加劑 纖維素酶活力的測定 分光光度法[S].北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,2005.

[22] 中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局.GB/T 23874—2009 飼料添加劑木聚糖酶活力的測定 分光光度法[S].北京:中國標準出版社,2009.

[23] 中華人民共和國農(nóng)業(yè)部.NY/T 911—2004 飼料添加劑 β葡聚糖酶活力的測定 分光光度法[S].北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,2005.

[24] NRC.Nutrient requirements of swine[S].11th ed.Washington,D.C.:National Academy Press,2012.

[25] 趙峰,張宏福,張子儀.單胃動物仿生消化系統(tǒng)操作手冊[M].2版.北京:中國農(nóng)業(yè)科學院,2011.

[26] BACH KNUDSEN K E,CANIBE N.Breakdown of plant carbohydrates in the digestive tract of pigs fed on wheat- or oat-based rolls[J].Journal of the Science of Food and Agriculture,2000,80(8):1253-1261.

[27] BACH KNUDSEN K E,J?RGENSEN H.Impact of wheat and oat polysaccharides provided as rolls on the digestion and absorption processes in the small intestine of pigs[J].Journal of the Science of Food and Agriculture,2007,87(13):2399-2408.

[28] VORAGEN A G J,COENEN G J,VERHOEF R P,et al.Pectin,a versatile polysaccharide present in plant cell walls[J].Structural Chemistry,2009,20(2):263-275.

[29] OLUKOSI O A,BEDFORD M R,ADEOLA O.Xylanase in diets for growing pigs and broiler chicks[J].Canadian Journal of Animal Science,2007,87(2):227-235.

[30] EMIOLA I A,OPAPEJU F O,SLOMINSKI B A,et al.Growth performance and nutrient digestibility in pigs fed wheat distillers dried grains with solubles-based diets supplemented with a multicarbohydrase enzyme[J].Journal of Animal Science,2009,87(7):2315-2322.

[31] REILLY P,SWEENEY T,O’SHEA C,et al.The effect of cereal-derived beta-glucans and exogenous enzyme supplementation on intestinal microflora,nutrient digestibility,mineral metabolism and volatile fatty acid concentrations in finisher pigs[J].Animal Feed Science and Technology,2010,158(3/4):165-176.

[32] DIEBOLD G,MOSENTHIN R,PIEPHO H P,et al.Effect of supplementation of xylanase and phospholipase to a wheat-based diet for weanling pigs on nutrient digestibility and concentrations of microbial metabolites in ileal digesta and feces[J].Journal of Animal Science,2004,82(9):2647-2656.

[33] SALEH F,OHTSUKA A,TANAKA T,et al.Effect of enzymes of microbial origin oninvitrodigestibilities of dry matter and crude protein in soybean meal[J].Animal Science Journal,2003,74(1):23-29.

[34] BOISEN S,FERNNDEZ J A.Prediction of the total tract digestibility of energy in feedstuffs and pig diets byinvitroanalyses[J].Animal Feed Science and Technology,1997,68(3/4):277-286.

[35] REGMI P R,SAUER W C,ZIJLSTRA R T.Prediction ofinvivoapparent total tract energy digestibility of barley in grower pigs using aninvitrodigestibility technique[J].Journal of Animal Science,2008,86(10):2619-2626.

[36] SAUVANT D,PEREZ J M,TRAN G.Tables of composition and nutritional value of feed materials:pigs,poultry,cattle,sheep,goats,rabbits,horses and fish[M].Netherlands:Wageningen Academic Publishers,2004.

[37] CHOCT M.Feed non-starch polysaccharides:chemical structures and nutritional significance[J].Feed Milling International,1997,6:13-26.

[38] BENAMROUCHE S,CRNIER D,DEBEIRE P,et al.A chemical and histological study on the effect of (1→4)-β-endo-xylanase treatment on wheat bran[J].Journal of Cereal Science,2002,36(2):253-260.

[39] KUMAR V,SINHA A K,MAKKAR H P S,et al.Dietary roles of non-starch polysachharides in human nutrition:a review[J].Critical Reviews in Food Science and Nutrition,2012,52(10):899-935.

[40] KERR B J,SHURSON G C.Strategies to improve fiber utilization in swine[J].Journal of Animal Science and Biotechnology,2013,4:11.

[41] JUANPERE J,PéREZ-VENDRELL A M,ANGULO E,et al.Assessment of potential interactions between phytase and glycosidase enzyme supplementation on nutrient digestibility in broilers[J].Poultry Science,2005,84(4):571-580.

[42] 趙敏.非淀粉多糖酶對蛋雞日糧能量代謝調(diào)控的研究[D].碩士學位論文.西寧:青海大學,2007.

*Corresponding author, professor, E-mail: zhanghongfu@caas.cn

(責任編輯 武海龍)

Optimization of Non-Starch Polysaccharide Enzymes of Diets for Growing Pigs UsinginVitroMethod

GAO Lixiang1,2CHEN Liang1,2CUI Shigui2,3XIE Yuehua2,3ZHANG Hongfu1,2*

(1.StateKeyLaboratoryofAnimalNutrition,InstituteofAnimalSciences,ChineseAcademyofAgricultureScience,Beijing100193,China; 2.Huai’anResearchCenterofHealthyBreedingandFeedScience,ChineseAcademyofAgricultureScience,Huaian223005,China; 3.JiangsuHuaweiAnimalFeedDevelopmentCo.Ltd.,Huai’an223005,China)

Aimed to resolve the problem of massive work and poor comparability for screening non-starch polysaccharides (NSP) enzymes by animal experiment, the study was conducted to optimize the NSP enzymes combination of corn-soybean meal diet and corn-miscellaneous meal diet for growing pigs using aninvitromethod. The first step was to determine the dose-response of the NSP enzymes supplemental level on theinvitrodry matter digestibility (IVDMD) of diets using one-way randomized experimental design. The NSP enzymes including cellulase, xylanase, β-glucanase, β-mannanase, α-galactosidase and pectinase were added into corn-soybean meal diet and corn-miscellaneous meal diet, and to analysis the effects of NSP enzymes on the IVDMD of diets. The second step was to screen the optimum enzyme combinations of 6 kinds NSP enzymes using quadratic orthogonal rotation combination design. The results showed as follows: 1) quadratic effects of NSP enzymes on the IVDMD of diets for growing pig were observed. 2) The α-galactosidase had a greatest effect in all NSP enzymes of corn-soybean meal diet and increased the IVDMD by 1.28%; whereas xylanase increased the IVDMD of corn-miscellaneous meal diet by 1.95%. 3) The optimum enzyme combination in the corn-soybean meal diet was cellulase 533.6 U/kg, xylanase 9 983.7 U/kg, β-glucanase 1 014.4 U/kg, β-mannanase 4 080.6 U/kg, α-galactosidase 251.6 U/kg and pectinase 107.3 U/kg. The optimum enzyme combination in the corn-miscellaneous meal diet was cellulase 960.0 U/kg, xylanase 17 177.6 U/kg, β-glucanase 405.8 U/kg, β-mannanase 19 023.2 U/kg, α-galactosidase 307.2 U/kg and pectinase 96.9 U/kg. 4) The IVDMD of corn-soybean meal diet was increased by 3.26% and the IVDMD of the corn-miscellaneous meal diet was also increased 3.75% using the optimum NSP enzymes combination. In conclusion, the combination of the 6 NSP enzymes can improve the IVDMD of corn-soybean meal diet and corn-miscellaneous meal diet for growing pig diets more effectively.[ChineseJournalofAnimalNutrition, 2017, 29(4)：1205-1217]

NSP enzyme; pig; diet;invitrodry matter digestibility; optimization

10.3969/j.issn.1006-267x.2017.04.016

2016-09-02

國家科技支撐計劃項目課題(2012BAD39B01)；中國農(nóng)業(yè)科學院科技創(chuàng)新工程(ASTIP-IAS07)；產(chǎn)學研聯(lián)合創(chuàng)新資金(BY2013054)；蘇北科技發(fā)展計劃(BN2014034)

高理想(1987—)，男，安徽阜陽人，博士研究生，從事飼料生物學效價評定研究。E-mail： glxahu@163.com

*通信作者:張宏福，研究員，博士生導師，E-mail： zhanghongfu@caas.cn

S828

A

1006-267X(2017)04-1205-13