高效液相色譜法研究瘤胃甲烷菌共存對厭氧真菌代謝產(chǎn)生有機(jī)酸特性的影響

李袁飛 孫美洲 成艷芬 朱偉云

(江蘇省消化道營養(yǎng)與動物健康重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京農(nóng)業(yè)大學(xué)消化道微生物實(shí)驗(yàn)室，南京210095)

高效液相色譜法研究瘤胃甲烷菌共存對厭氧真菌代謝產(chǎn)生有機(jī)酸特性的影響

李袁飛 孫美洲 成艷芬*朱偉云

(江蘇省消化道營養(yǎng)與動物健康重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京農(nóng)業(yè)大學(xué)消化道微生物實(shí)驗(yàn)室，南京210095)

本試驗(yàn)旨在利用建立的高效液相色譜法研究瘤胃甲烷菌共存對厭氧真菌代謝產(chǎn)有機(jī)酸特性的影響。根據(jù)6種有機(jī)酸的化學(xué)特性確定紫外檢測波長、緩沖液濃度、pH、流速、柱溫和進(jìn)樣量等液相色譜條件；利用建立的高效液相色譜法檢測厭氧真菌純培養(yǎng)及厭氧真菌與甲烷菌共培養(yǎng)上清液中6種有機(jī)酸的含量。結(jié)果表明，高效液相色譜采用的條件為：5 mmol/L磷酸二氫鉀-磷酸緩沖液(pH=2.4)作為流動相，流速為0.5 mL/min，柱溫25 ℃，進(jìn)樣量為20 μL，214 nm波長檢測。6種有機(jī)酸能夠在30 min內(nèi)得到良好分離。各種有機(jī)酸的線性相關(guān)系數(shù)均大于0.999，檢測限為0.20～1.00 μmol/L，定量限為0.667～3.333 μmol/L，回收率為92.17%～101.61%。甲烷菌共存影響了厭氧真菌的代謝產(chǎn)物。厭氧真菌利用葡萄糖的主要水溶性代謝產(chǎn)物為甲酸、乳酸、乙酸，以及微量琥珀酸、檸檬酸、α-酮戊二酸及乙醇；甲烷菌共存顯著降低了上清液中甲酸和乳酸的含量(P<0.05)，顯著增加了乙酸含量(P<0.05)。綜上，本試驗(yàn)利用建立的高效液相色譜法可快捷、靈敏、有效地檢測厭氧真菌代謝葡萄糖產(chǎn)生的6種有機(jī)酸的含量，并發(fā)現(xiàn)甲烷菌共存顯著促進(jìn)了厭氧真菌氫化酶體對碳水化合物的代謝。

高效液相色譜法；有機(jī)酸；厭氧真菌；甲烷菌；共培養(yǎng)

厭氧真菌是瘤胃內(nèi)最先定殖到植物纖維組織上的微生物之一[1]。它們借助強(qiáng)大的假根系統(tǒng)和分泌的一系列木質(zhì)纖維素降解酶對植物纖維進(jìn)行高效地降解。厭氧真菌進(jìn)行混合酸發(fā)酵，其代謝產(chǎn)物主要為甲酸、乙酸、乳酸、琥珀酸、乙醇、二氧化碳(CO2)和氫氣(H2)[2-4]。甲烷菌嚴(yán)格厭氧，它們不能利用復(fù)雜的有機(jī)物，只能利用H2、CO2、甲酸、乙酸和甲醇等簡單物質(zhì)作為能量來源。甲烷菌和厭氧真菌可以穩(wěn)定共存，而且甲烷菌的存在可以顯著提高厭氧真菌對底物的降解和利用[5-6]。當(dāng)甲烷菌共存時，厭氧真菌的主要代謝產(chǎn)物由甲酸、乙酸、氫氣和乳酸轉(zhuǎn)變?yōu)橐宜帷⒓淄楹腿樗醄7-8]。因此，建立厭氧真菌代謝產(chǎn)物中有機(jī)酸的檢測方法，對于了解甲烷菌共存對厭氧真菌代謝的影響具有重要意義。

目前有關(guān)厭氧真菌有機(jī)酸檢測方法的報道較少，測定的有機(jī)酸多集中于含量較高的代謝產(chǎn)物，如甲酸、乙酸和乳酸，而且往往是利用不同的方法分開測定的，耗時費(fèi)力，也不經(jīng)濟(jì)。然而，目前還沒有能夠同時檢測厭氧真菌代謝產(chǎn)生的這些有機(jī)酸的方法。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，厭氧真菌發(fā)酵可能產(chǎn)生某些微量代謝產(chǎn)物，如α-酮戊二酸和檸檬酸[9-10]。事實(shí)上還沒有一種定量檢測厭氧真菌代謝產(chǎn)生的這2種微量代謝產(chǎn)物的方法。因此，本研究旨在建立同時檢測厭氧真菌代謝產(chǎn)生的6種有機(jī)酸(甲酸、乙酸、乳酸、α-酮戊二酸、檸檬酸和琥珀酸)的方法，并使用該方法研究厭氧真菌產(chǎn)有機(jī)酸的特性以及甲烷菌共存對厭氧真菌產(chǎn)有機(jī)酸的影響。

1 材料與方法

1.1 高效液相色譜儀與試劑

Waters 2489型高效液相色譜儀(Waters，美國)，Waters 515泵，2489 UA檢測器，HT-330柱溫箱(Waters，美國)，Agilent SB-Aq色譜柱(26 mm×250 mm，5 μm；Agilent，美國)，7725i手動進(jìn)樣器(Rheodyne，美國)，UV2450紫外可見光譜儀(Hitachi，日本)。色譜純甲酸、乙酸、乳酸、α-酮戊二酸、檸檬酸和琥珀酸購于Sigma公司(St. Louis, MO，美國)，分析純磷酸二氫鉀(KH2PO4)購于北京化學(xué)試劑公司。超純水(18.2 mΩ/cm)使用MilliQ超低有機(jī)物超純水機(jī)制備(Millipore，美國)。

1.2 有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制及標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

準(zhǔn)確稱取或量取甲酸、乳酸、乙酸、α-酮戊二酸、檸檬酸和琥珀酸，配制成濃度為50～100 mmol/L的母液。分別移取適量該溶液稀釋1、5、10、100、200、500和1 000倍，配制成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，用0.22 μm的一次性針式過濾器過濾后備用。各有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)品用于確定保留時間，混合標(biāo)準(zhǔn)品用于制作有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3 有機(jī)酸分析方法的建立

在200～600 nm波長范圍內(nèi)掃描各個有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，發(fā)現(xiàn)在214 nm波長下，整體的吸光度較高，而葡萄糖在此波長下幾乎沒有吸收，因此選擇吸收波長為214 nm作為檢測波長。試驗(yàn)中比較了不同濃度KH2PO4-磷酸(H3PO4)(5、10、15、20 mmol/L)緩沖液發(fā)現(xiàn)，濃度為5 mmol/L時有機(jī)酸分離度最好。在KH2PO4-H3PO4緩沖液濃度為5 mmol/L條件下，用H3PO4調(diào)節(jié)緩沖液pH為1.6、2.0、2.4、2.7，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有機(jī)酸在pH為2.4的流動相中分離度最好。因此選用5 mmol/L KH2PO4-H3PO4緩沖液(pH=2.4)作為流動相，檢測波長設(shè)定為214 nm。通過綜合比較分析，最終確定有機(jī)酸高效液相色譜分析條件為：流動相為5 mmol/L KH2PO4-H3PO4緩沖液(pH=2.4)，流速為0.5 mL/min，檢測波長為214 nm，柱溫為25 ℃，進(jìn)樣體積為20 μL。根據(jù)該分析條件，檢測各有機(jī)酸保留時間、建立標(biāo)準(zhǔn)曲線并計算檢測限與定量限。

1.4 精密度和回收率的測定

精確吸取適宜濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按高效液相色譜分析條件連續(xù)進(jìn)樣5次，記錄峰面積并計算精密度。將同一發(fā)酵液樣品分裝成2份，一份直接測定其中有機(jī)酸含量，另外一份添加混合標(biāo)準(zhǔn)品后測定其含量，記錄峰面積，平行測定3次，計算回收率，該試驗(yàn)重復(fù)5次。

1.5 甲烷菌共存對厭氧真菌代謝的影響

以本實(shí)驗(yàn)室從山羊瘤胃液中分離得到的厭氧真菌(屬于Piromyces)和甲烷菌(Methanobrevibacterthaueri)共培養(yǎng)[5]為試驗(yàn)菌株，通過添加氯霉素去除甲烷菌以獲得厭氧真菌純培養(yǎng)。參照Barichievich等[11]方法配制培養(yǎng)基，將10 mL生長3 d的培養(yǎng)物接種于已預(yù)熱至39 ℃的90 mL培養(yǎng)基(4 g/L葡萄糖為底物)中，39 ℃靜置培養(yǎng)3 d，參照Marin-Sikkema等[12]方法取上清液并分裝于2 mL凍存管，-80 ℃保存，用于厭氧真菌底物及代謝產(chǎn)物分析。

1.6 厭氧真菌底物及代謝產(chǎn)物分析

采用葡萄糖氧化酶/過氧化物酶法測定上清液中葡萄糖含量(南京建成生物工程研究所)。上清液離心后(12 000 r/min、4 ℃離心10 min)與KH2PO4-H3PO4緩沖液(5 mmol/L，pH=2.4)按1∶2比例混勻，0.22 μm過濾后用上述已建立方法檢測其中有機(jī)酸的含量。參照Edgardo等[13]方法測定上清液中乙醇含量：氣相色譜為Agilent 7890B(Agilent，美國)；載氣[柱前壓，高純氮?dú)?N2)]0.04 MPa；分流比100∶1；KR-9(白酒柱)，0.32 m×30 m；火焰離子化檢測儀(FID)；氣化溫度150 ℃，柱溫105 ℃，檢測器溫度220 ℃。

1.7 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2007初步整理后，利用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件中獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)對純培養(yǎng)和共培養(yǎng)中底物及代謝產(chǎn)物含量進(jìn)行比較。數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，顯著性水平置于0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 厭氧真菌代謝產(chǎn)物高效液相色譜法的建立

2.1.1 保留時間、標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢測限和定量限的確定

通過各有機(jī)酸的單一標(biāo)準(zhǔn)品測定其保留時間(表1)，然后利用有機(jī)酸混合標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行測定分析。結(jié)果表明，6種有機(jī)酸在30 min內(nèi)能得到良好的分離效果(圖1)。以進(jìn)樣濃度(mmol/L)為橫坐標(biāo)，峰面積(mV·min)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性回歸，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程，6種有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)均大于0.999(表1)。以3倍、10倍信噪比(S/N)的判斷標(biāo)準(zhǔn)分別進(jìn)行6種有機(jī)酸的檢測限及定量限的計算，其中α-酮戊二酸的檢測限最低，為0.20 μmol/L；乙酸的檢測限最高，為1.00 μmol/L。α-酮戊二酸的定量限最低，為0.667 μmol/L；乙酸的定量限最高，為3.333 μmol/L(表1)。

2.1.2 精密度和回收率試驗(yàn)

表2為6種有機(jī)酸檢測的重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果，由表2可知，各有機(jī)酸峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation,RSD)的平均值均低于6%，表明該方法具有良好的精密度。表3為該檢測方法的回收率試驗(yàn)結(jié)果。由表3可知，乳酸的回收率最高，為101.61%；檸檬酸的回收率最低，為92.17%。結(jié)果表明各有機(jī)酸加樣回收率良好。

1：甲酸；2：乳酸；3：乙酸；4：α-酮戊二酸；5：檸檬酸；6：琥珀酸。

1: formate; 2: lactate; 3: acetate; 4: α-ketoglutarate; 5: citrate; 6: succinate.

圖1 有機(jī)酸混合標(biāo)準(zhǔn)品的高效液相色譜圖

表2 高效液相色譜檢測方法的精密度

表3 6種有機(jī)酸加樣回收試驗(yàn)結(jié)果

2.2 甲烷菌共存對厭氧真菌葡萄糖代謝的影響

經(jīng)過72 h培養(yǎng)后，檢測發(fā)現(xiàn)厭氧真菌純培養(yǎng)和甲烷菌與厭氧真菌共培養(yǎng)上清液中作為底物的葡萄糖被完全利用，且兩者間差異不顯著(P>0.05)。利用建立的高效液相色譜法測定有機(jī)酸含量時發(fā)現(xiàn)，甲烷菌共存影響了厭氧真菌的代謝產(chǎn)物(圖2，表4)。由表4可知，厭氧真菌利用葡萄糖的主要水溶性代謝產(chǎn)物為甲酸、乳酸和乙酸。甲烷菌共存顯著降低了上清液中甲酸和乳酸的含量(P<0.05)，顯著增加了上清液中乙酸的含量(P<0.05)，對上清液中的微量代謝產(chǎn)物琥珀酸、檸檬酸、α-酮戊二酸和乙醇的含量無顯著影響(P>0.05)。

表4 純培養(yǎng)和共培養(yǎng)上清液中代謝產(chǎn)物含量

同列數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，相同或無字母表示差異不顯著(P>0.05)。

In the same column, values with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05), while with the same or no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05).

3 討 論

3.1 檢測厭氧真菌代謝的6種有機(jī)酸方法的建立

高效液相色譜法具有柱效高、重復(fù)性良好、操作方便等特點(diǎn)，并且可以同時定量多種化合物[15]。然而，由于厭氧真菌培養(yǎng)基成分復(fù)雜，厭氧真菌代謝產(chǎn)物組分也比較復(fù)雜，因此對上清液中有機(jī)酸的測定有較大干擾。在條件摸索過程中，筆者發(fā)現(xiàn)樣品在甲酸目標(biāo)峰的附近出現(xiàn)了較多雜峰，干擾了甲酸的準(zhǔn)確測定。筆者調(diào)節(jié)了緩沖液pH(1.6～2.7)、緩沖液濃度(5～20 mol/L)、柱溫(15～30 ℃)、流動相中甲醇比例和流動相流速等來消除雜峰對甲酸的干擾：緩沖液濃度為5 mmol/L時效果好于其他濃度；pH為2.0和2.4時效果好于其他pH；柱溫為30 ℃時效果最好；甲醇的加入與否對結(jié)果影響不大；當(dāng)流速較小時，更有利于各有機(jī)酸的分離，然而流速過小會使分析時間過長。通過控制相關(guān)因素我們最終得到了最佳組合，最大程度地消除了雜峰對甲酸檢測的干擾。

在以往的研究中，厭氧真菌代謝的有機(jī)酸往往是利用不同的方法分開測定的，耗時費(fèi)力，檢測靈敏度較低，誤差較大，而且測定多集中于甲酸、乙酸、乳酸等含量相對較高的代謝產(chǎn)物，對琥珀酸、檸檬酸和α-酮戊二酸等微量代謝產(chǎn)物的關(guān)注則較少。目前還沒有一種關(guān)于同時檢測瘤胃厭氧真菌多種有機(jī)酸方法的報道。在以往甲酸采用甲酸脫氫酶法測定[3,8]，所需試劑成本較高而且不易保存；乳酸采用氣相測定時需衍生化處理[3]，因此降低了測定的準(zhǔn)確性。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，6種有機(jī)酸在30 min內(nèi)能得到良好的分離效果；各有機(jī)酸的回收率在92.17%～101.61%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于10%。同時，本方法中采用的流動相(KH2PO4-H3PO4緩沖液)濃度低于其他報導(dǎo)[14-15]，因而大大降低了高鹽對色譜系統(tǒng)的不利影響。而且本方法樣品處理簡單，整個測定過程中無需應(yīng)用有毒有害試劑。因此本方法完全滿足厭氧真菌發(fā)酵液中有機(jī)酸的測定。

A：厭氧真菌純培養(yǎng)上清液樣品高效液相色譜圖；B：厭氧真菌和甲烷菌共培養(yǎng)上清液樣品高效液相色譜圖。

A: HPLC chromatograms of anaerobic fungal pure culture supernatant; B: HPLC chromatograms of co-culture of anaerobic fungi and methanogens supernatant.

圖2 高效液相色譜分析甲烷菌共存對厭氧真菌代謝產(chǎn)物的影響

Fig.2 Effects of co-cultured methanogens on the metabolites of anaerobic fungi by HPLC

3.2 厭氧真菌發(fā)酵葡萄糖的代謝產(chǎn)物和代謝途徑

厭氧真菌利用葡萄糖進(jìn)行混合酸發(fā)酵的代謝產(chǎn)物主要為甲酸、乙酸、乙醇、乳酸、CO2和H2[2-3]。與其他好氧真菌不同，厭氧真菌沒有線粒體，但其胞內(nèi)存在一種類似于線粒體的細(xì)胞器——?dú)浠阁w(氫體)。厭氧真菌的氫化酶體是細(xì)胞內(nèi)以膜隔離的大約1 μm的小區(qū)室，它們在厭氧條件下通過底物水平磷酸化作用產(chǎn)生ATP[12]。厭氧真菌可以同時在細(xì)胞質(zhì)和氫化酶體中進(jìn)行碳水化合物代謝，細(xì)胞質(zhì)中主要代謝產(chǎn)生乳酸、乙醇和甲酸，而氫化酶體中代謝產(chǎn)生H2、CO2、乙酸和甲酸[16]。本研究中厭氧真菌純培養(yǎng)的主要代謝產(chǎn)物為甲酸、乳酸和乙酸，以乳酸的濃度為最高，表明有很大一部分的碳水化合物在細(xì)胞質(zhì)中被代謝。Cheng等[10]研究發(fā)現(xiàn)，厭氧真菌存在不完整的三羧酸循環(huán)(TCA)，包括還原支路和氧化支路；其中氧化支路的終產(chǎn)物為α-酮戊二酸，還原支路的終產(chǎn)物為琥珀酸。本試驗(yàn)在厭氧真菌上清液中檢測到了代謝產(chǎn)物α-酮戊二酸和琥珀酸，這驗(yàn)證了Kwon等[9]和Cheng等[10]的推測。

3.3 甲烷菌共存對厭氧真菌葡萄糖代謝的影響

在甲烷菌共存情況下，厭氧真菌的主要代謝產(chǎn)物為乳酸和乙酸，以乙酸含量最高。筆者前期的研究表明，在厭氧真菌和甲烷菌共培養(yǎng)的發(fā)酵體系中幾乎沒有氫氣的積累，而厭氧真菌純培養(yǎng)則有氫氣積累[6]。甲烷短桿菌屬為氫營養(yǎng)型甲烷菌，可以利用氫氣或甲酸還原二氧化碳生成甲烷，幾乎不利用乙酸[17]。因此，本研究中厭氧真菌與甲烷菌存在著種間氫轉(zhuǎn)移的關(guān)系。在甲烷短桿菌存在的情況下，厭氧真菌所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物H2和甲酸會被甲烷菌迅速利用，解除了H2對氫化酶的抑制作用[18]和甲酸對丙酮酸甲酸裂解酶的抑制作用[19]，因此氫化酶體中的代謝途徑加強(qiáng)，產(chǎn)生的ATP也增多。氫化酶體在產(chǎn)生ATP的同時會伴隨著乙酸的生成[20-21]。共培養(yǎng)上清液中乙酸含量顯著高于厭氧真菌純培養(yǎng)組，這表明共培養(yǎng)組中更多的碳水化合物被厭氧真菌氫化酶體所代謝。氫化酶體中含有的氫化酶催化煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)生成煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)和氫氣，乳酸生成過程中需NADH的參與[4]。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)的NADH減少時，乳酸的生成也會受到影響，因此共培養(yǎng)組的乳酸含量顯著低于純培養(yǎng)組。本研究中，共培養(yǎng)和純培養(yǎng)發(fā)酵液中的琥珀酸、檸檬酸和α-酮戊二酸含量都沒有顯著差異，這可能是因?yàn)閺腡CA還原支路和氧化支路代謝的碳源量很低且純培養(yǎng)和共培養(yǎng)所利用底物(葡萄糖)的量無顯著差異。

4 結(jié) 論

厭氧真菌代謝葡萄糖產(chǎn)生的主要有機(jī)酸為甲酸、乳酸、乙酸以及微量的琥珀酸、檸檬酸和α-酮戊二酸。

甲烷菌共存對琥珀酸、檸檬酸、α-酮戊二酸和乙醇的含量無顯著影響，卻顯著減少了甲酸和乳酸的含量，顯著增加了乙酸的含量。

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*Corresponding author, associated professor, E-mail: yanfencheng@njau.edu.cn

(責(zé)任編輯 武海龍)

Effects of Associated Methanogen on Organic Acid Profile of Metabolism by Anaerobic Fungus Revealed Using High Performance Liquid Chromatography

LI Yuanfei SUN Meizhou CHENG Yanfen*ZHU Weiyun

(JiangsuKeyLaboratoryofGastrointestinalNutritionandAnimalHealth,LaboratoryofGastrointestinalMicrobiology,NanjingAgriculturalUniversity,Nanjing210095,China)

The objective of the present study was to investigate the effects of associated methanogen on organic acid profile of metabolism by anaerobic fungus using the established analytic method of high-performance liquid chromatography (HPLC). The wavelength of detector, concentration of buffer, pH, flow rate, column temperature and volume of injection were determined for HPLC method based on the chemical properties of the organic acids. The established method was then applied to detecting the concentrations of formate, lactate, acetate, α-ketoglutarate, citric acid and succinic acid in the supernatant of fungal mono-culture and co-culture of anaerobic fungi with methanogens. The results showed that the operation condition for HPLC was as follows: 5 mmol/L KH2PO4-H3PO4buffer solution (pH=2.4) at a flow rate of 0.5 mL/min, the column temperature at 25 ℃, injection volume 20 μL and wavelength of detector at 214 nm. The organic acids could be separated and identified by their retention times within 30 min. All the correlation coefficients were no less than 0.999. The limit of detection ranged from 0.20 to 1.00 μmol/L and the limit of quantification ranged from 0.667 to 3.333 μmol/L. The recovery rate varied from 92.17% to 101.61%. The analysis of metabolites in the supernatant of cultures showed that the metabolic profiles of anaerobic fungi were shifted by associated methanogens. The dominant water soluble metabolites of anaerobic fungal pure culture were formate, lactate and acetate. α-ketoglutarate, citric acid, succinic acid and ethanol were detected as well. With the presence of associated methanogens, the concentrations of formate and lactate were significantly decreased (P<0.05), while the concentration of acetate was significantly increased (P<0.05). In conclusion, the six organic acid contents produced by anaerobic fungi can be rapidly and sensitively detected by the established HPLC method. The presence of associated methanogens increases the carbohydrate metabolism in the hydrogenosomes of anaerobic fungi.[ChineseJournalofAnimalNutrition, 2017, 29(4)：1198-1204]

high performance liquid chromatography; organic acids; anaerobic fungi; methanogens; co-culture

10.3969/j.issn.1006-267x.2017.04.015

2016-10-01

國家自然科學(xué)基金(31101735)；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)(KYZ201312)；江蘇省自然科學(xué)基金(BK20141372)

李袁飛(1988—)，男，湖南資興人，博士研究生，從事消化道微生物研究。E-mail: 2014205026@njau.edu.cn

*通信作者:成艷芬，副教授，碩士生導(dǎo)師，E-mail: yanfencheng@njau.edu.cn

S811.6

A

1006-267X(2017)04-1198-07