液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測(cè)定人血漿氯吡格雷的濃度及其藥動(dòng)學(xué)研究

刁連娜

液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測(cè)定人血漿氯吡格雷的濃度及其藥動(dòng)學(xué)研究

刁連娜

目的 采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法對(duì)健康受試者體內(nèi)的人血漿氯吡格雷含量進(jìn)行分析，并對(duì)氯吡格雷在人體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)進(jìn)行研究。方法 選取鞍山市長(zhǎng)大醫(yī)院2015年6月至2016年6月收治的26例健康受試者為研究對(duì)象，對(duì)其進(jìn)行氯吡格雷藥物口服，并在口服后對(duì)患者的肘靜脈血進(jìn)行藥動(dòng)學(xué)分析，主要采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法進(jìn)行檢驗(yàn)，對(duì)受試者血漿中的氯吡格雷含量及其衍生物含量進(jìn)行分析，總結(jié)氯吡格雷在患者體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)結(jié)果。結(jié)果 相同添加值情況下，氯吡格雷與活性巰基代謝物的日間、日內(nèi)精密度檢測(cè)結(jié)果差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而兩組受試者藥動(dòng)力學(xué)指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果差異也無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論 通過液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測(cè)定人體內(nèi)血漿中的氯吡格雷含量及其代謝產(chǎn)物含量的藥動(dòng)學(xué)結(jié)果準(zhǔn)確、操作簡(jiǎn)單，能夠有效指導(dǎo)臨床檢驗(yàn)。

氯吡格雷；液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法；藥動(dòng)學(xué)分析

【DOI】10.12010/j.issn.1673-5846.2017.04.007

氯吡格雷是臨床常用藥物，主要通過口服用藥進(jìn)行治療?；颊咴诳诜盟幒?，經(jīng)過代謝和反應(yīng)生成氯吡格雷羧酸。此外，氯吡格雷還能夠在人體內(nèi)形成經(jīng)細(xì)胞色素P450酶系代謝成活性巰基代謝物，該成分能夠與人體內(nèi)血小板膜受體結(jié)合，抑制血小板聚集，由于氯吡格雷羧酸與血小板膜受體的結(jié)合是不可逆的，因此氯吡格雷經(jīng)常被應(yīng)用于溶栓、抗栓疾病的治療中[1-2]。但氯吡格雷在治療腦梗死、腦中風(fēng)等疾病過程中，易出現(xiàn)不良反應(yīng)，對(duì)患者康復(fù)產(chǎn)生影響。為了分析氯吡格雷在抗栓、溶栓治療中的應(yīng)用優(yōu)勢(shì)，臨床對(duì)于氯吡格雷應(yīng)用的毒性與風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行了分析，對(duì)患者血液中的活性巰基代謝物含量、濃度、藥動(dòng)學(xué)等指標(biāo)進(jìn)行分析，但由于活性巰基代謝物屬于十分活潑的巰基，在臨床檢驗(yàn)和分析過程中經(jīng)常無法準(zhǔn)確檢驗(yàn)，且需要在血液采集過程中加入活性巰基代謝物保護(hù)劑，操作十分繁瑣，對(duì)檢驗(yàn)十分不利[3-4]。為此，臨床采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法對(duì)人血漿中氯吡格雷的濃度進(jìn)行分析，取得了一定的應(yīng)用效果，本研究對(duì)所選26例健康受試者的臨床檢驗(yàn)資料進(jìn)行總結(jié)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2015年6月至2016年6月于我院行健康體檢的26例健康受試者為研究對(duì)象，其中男14例，女12例，年齡30～42歲，平均（35± 3）歲，體重55～70 kg，平均（62±8）kg。所有健康受試者均在本研究前了解該試驗(yàn)過程、方法等內(nèi)容，并自愿在知情同意書上簽字，試驗(yàn)期間受試者并未進(jìn)行劇烈運(yùn)動(dòng)，嚴(yán)格限制受試者吸煙、飲酒或酒精類飲料。

1.2 方法

1.2.1 藥物與器械 儀器選用Agilent 1200液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀，主要包括高壓泵、進(jìn)樣器、柱溫箱、電噴霧離子化接口以及設(shè)計(jì)軟件。藥物則選擇硫酸氫氯吡格雷片，分別由南京正大天晴制藥有限公司和賽諾菲安萬特制藥有限公司生產(chǎn)，規(guī)格均為每片75 mg。按照儀器與試劑說明書嚴(yán)格進(jìn)行操作。色譜柱：WATERS ACQUITY UPLC HSS T3（2.1 mm× 50 mm，1.8 μm），流動(dòng)相：水和乙腈，兩種溶液均含有 0.1%甲酸。儀器設(shè)置中將柱溫設(shè)置為 30 ℃，將10 μl樣本放置于儀器中進(jìn)行測(cè)定，時(shí)間為1.5 min，0～0.7 min時(shí)流動(dòng)相B含量由20%逐漸上升為90%，并在0.7～1.2 min時(shí)保持90%的濃度，1.2～1.3 min時(shí)流動(dòng)相B含量由90%逐漸下降為20%，并在1.3～1.5 min內(nèi)保持在20%濃度。

1.2.2 試驗(yàn)方法 首先將26例受試者分別分為試驗(yàn)組與參照組，試驗(yàn)組患者采用賽諾菲安萬特制藥有限公司生產(chǎn)的硫酸氫氯吡格雷片，參照組患者采用南京正大天晴制藥有限公司生產(chǎn)的硫酸氫氯吡格雷片，患者均在禁食、禁水12 h后清晨空腹用藥，方式為口服，用250 ml溫水送服75 mg硫酸氫氯吡格雷片，在服藥后4 h兩組患者統(tǒng)一發(fā)放早餐。待患者用藥后15 min至48 h內(nèi)分別進(jìn)行不同時(shí)間的肘靜脈血采集，時(shí)間分別為15 min、30 min、45 min、60 min、1.0 h、1.5 h、2.0 h、3.0 h、4.0 h、6.0 h、8.0 h、12.0 h、24.0 h、36.0 h以及48.0 h，將不同時(shí)點(diǎn)采集的標(biāo)本進(jìn)行離心處理，離心機(jī)設(shè)置為每分鐘4000 r，離心5 min，離心半徑為26 cm，取上層清液放置于-20 ℃冰箱中待檢。

1.2.3 標(biāo)本檢驗(yàn)方法 對(duì)離心后的血液樣本進(jìn)行取樣，劑量為50 μl/樣，向樣本中加入50 mmol/L三（2-羧乙基）膦鹽酸鹽（TCEP），劑量為25 μl，利用渦旋處理5 min，然后加入乙腈溶液，乙腈溶液中含有氯甲酸芐酯（CBZ），乙腈溶液劑量為200 μl，CBZ含量為100 ng/ml，再進(jìn)行渦旋處理，時(shí)間為2 min，然后進(jìn)行離心處理，時(shí)間為5 min。將處理后的標(biāo)本取上層清液，在避光條件下進(jìn)行測(cè)定和操作。

1.3 觀察指標(biāo) 將控制檢驗(yàn)的添加值和測(cè)定值均設(shè)定為4.00，平行檢測(cè)3次，分析不同時(shí)點(diǎn)患者體內(nèi)氯吡格雷及活性巰基代謝物的標(biāo)準(zhǔn)差、相對(duì)偏差、日內(nèi)精密度、日間精密度差異，日間精密度是對(duì)所選2日間的血檢結(jié)果進(jìn)行取值，日內(nèi)精密度則是對(duì)2日內(nèi)不同時(shí)點(diǎn)血液檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行取值，同時(shí)對(duì)氯吡格雷及其衍生物的藥動(dòng)學(xué)指標(biāo)進(jìn)行分析和比較。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以百分率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 氯吡格雷及其衍生物測(cè)定精準(zhǔn)度比較 相同添加值情況下，氯吡格雷與活性巰基代謝物的日間、日內(nèi)精密度檢測(cè)結(jié)果差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

表1 氯吡格雷及活性巰基代謝物平行測(cè)定3次的精準(zhǔn)度比較(±s)

表1 氯吡格雷及活性巰基代謝物平行測(cè)定3次的精準(zhǔn)度比較(±s)

組別 例數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差(ng/ml)相對(duì)偏差(%)日內(nèi)精密度(%)日間精密度(%) 0.001 0.00 5.24 6.15 0.004 -0.58 8.95 4.27氯吡格雷 26 0.005 -2.03 2.57 8.15 0.061 -0.76 8.51 10.48活性巰基代謝物 26 0.082 2.78 8.54 9.11 0.089 -0.87 7.49 8.06

2.2 藥動(dòng)力學(xué)比較 兩組受試者藥動(dòng)力學(xué)指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果顯示差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表2。

表2 兩組受試者藥動(dòng)力學(xué)比較(±s)

表2 兩組受試者藥動(dòng)力學(xué)比較(±s)

組別 例數(shù)Cmax (ng/mL) Tmax (h) t1/2 (h) AUC0-48(hng/mL) AUC0-∞(hng/mL)參照組 13 1.81±1.09 1.02±0.87 3.58±1.25 4.48±4.67 4.51±4.71試驗(yàn)組 13 1.92±1.35 0.84±0.52 3.47±1.62 4.45±4.33 4.76±4.44

3 討論

氯吡格雷在我國(guó)臨床上主要應(yīng)用于腦梗死、腦中風(fēng)的治療中，能夠有效降低血液中血小板凝結(jié)效果，達(dá)到溶栓、抗栓等目的。患者在服用氯吡格雷后，其血液中產(chǎn)生一定的活性巰基代謝物，該代謝物是與血小板相結(jié)合的主要成分，活性巰基代謝物是氯吡格雷治療腦梗死、腦中風(fēng)的主要作用物質(zhì)，是保證患者臨床療效的主要成分[5-6]。隨著氯吡格雷在臨床上應(yīng)用逐漸增加，患者在用藥過程中經(jīng)常出現(xiàn)的不良發(fā)應(yīng)也越來越明顯，對(duì)氯吡格雷的臨床應(yīng)用產(chǎn)生了一定影響，因此，對(duì)氯吡格雷進(jìn)行藥物檢驗(yàn)和藥動(dòng)力學(xué)研究十分必要。但在檢驗(yàn)過程中，對(duì)氯吡格雷在人體內(nèi)產(chǎn)生的衍生物檢驗(yàn)有一定難度，因患者在服用氯吡格雷后，其體內(nèi)所產(chǎn)生的活性巰基代謝物含量相對(duì)較低，且在血液中活性強(qiáng)，容易與血液中血小板發(fā)生反應(yīng)，形成二硫鍵后無法得到有效檢出，因此對(duì)臨床檢驗(yàn)有一定影響[7-8]。液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法在氯吡格雷及其衍生物的測(cè)定中應(yīng)用價(jià)值極高，既解決了氯吡格雷及其衍生物的檢測(cè)問題，還能夠?qū)钚詭€基代謝物在人體血液中的穩(wěn)定性與藥代動(dòng)力學(xué)指標(biāo)進(jìn)行系統(tǒng)觀察。而且通過不同時(shí)點(diǎn)的檢驗(yàn)，對(duì)氯吡格雷的檢驗(yàn)結(jié)果更加精確，能夠有效指導(dǎo)氯吡格雷的臨床藥物檢驗(yàn)工作。

本研究結(jié)果顯示，通過液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法檢測(cè)人血漿中氯吡格雷濃度和藥動(dòng)力學(xué)指標(biāo)，相同添加值情況下，氯吡格雷與活性巰基代謝物的日間、日內(nèi)精密度檢測(cè)結(jié)果差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而兩組受試者藥動(dòng)力學(xué)指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果差異也無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明該方法檢驗(yàn)結(jié)果相對(duì)穩(wěn)定，可以有效測(cè)定人血漿中氯吡格雷濃度和代謝物濃度的變化，還能避免在血漿樣本采集和處理過程中活性巰基代謝物含量減少的問題。此外，通過對(duì)兩組藥動(dòng)力學(xué)比較分析也可得知，通過液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法檢測(cè)人血漿中氯吡格雷濃度和藥動(dòng)力學(xué)指標(biāo)，檢驗(yàn)結(jié)果能夠隨人體藥物種類的差異得出不同結(jié)果，檢驗(yàn)結(jié)果更加準(zhǔn)確。

綜上所述，通過液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法檢測(cè)人血漿中氯吡格雷濃度和藥動(dòng)力學(xué)指標(biāo)，不但能直接檢驗(yàn)，且檢驗(yàn)結(jié)果十分精準(zhǔn)。

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