C57BL/6J小鼠實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎模型建立的關(guān)鍵性問題

吳彥青 郭玉紅,2,3 劉清泉,2,3

(1 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院,北京,100010; 2 北京中醫(yī)醫(yī)院順義醫(yī)院,北京,101300;3 中醫(yī)感染性疾病基礎(chǔ)研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京,100010)

C57BL/6J小鼠實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎模型建立的關(guān)鍵性問題

吳彥青1郭玉紅1,2,3劉清泉1,2,3

(1 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院,北京,100010; 2 北京中醫(yī)醫(yī)院順義醫(yī)院,北京,101300;3 中醫(yī)感染性疾病基礎(chǔ)研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京,100010)

實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)模型是國(guó)際公認(rèn)的多發(fā)性硬化(MS)的經(jīng)典動(dòng)物模型,被廣泛用于MS發(fā)病機(jī)制和評(píng)價(jià)免疫調(diào)節(jié)藥物的實(shí)驗(yàn)研究。實(shí)驗(yàn)操作中仍有較多缺陷導(dǎo)致發(fā)病率不能達(dá)到100%和死亡率偏高,需要對(duì)造模的關(guān)鍵技術(shù)不斷完善。加強(qiáng)該模型免疫前準(zhǔn)備工作、免疫操作和免疫后護(hù)理3個(gè)方面的研究,分析EAE模型成功建立的關(guān)鍵性問題,并根據(jù)實(shí)驗(yàn)操作過程提出解決辦法,完善EAE模型的規(guī)范化造模流程,可以使EAE模型具備發(fā)病率高、死亡率低、模型穩(wěn)定的特點(diǎn)。

實(shí)驗(yàn)性免疫性腦脊髓炎模型;關(guān)鍵性問題;免疫前處理;免疫操作;免疫后護(hù)理

實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(Experimental Autoimmune Encephalomyelitis,EAE)是由自身抗原特異性T細(xì)胞進(jìn)行介導(dǎo)的自身免疫性疾病,在病理特征以及臨床表征上與多發(fā)性硬化(Multiple Sclerosis,MS)非常相似,是當(dāng)前國(guó)際公認(rèn)的、被廣泛運(yùn)用來評(píng)價(jià)防治MS的免疫調(diào)節(jié)藥物和探討MS的發(fā)病機(jī)制進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究的經(jīng)典MS實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型[1-4]。C57BL/6J純系小鼠具有遺傳背景明確的品系特點(diǎn),髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白(MOG35-55)誘導(dǎo)免疫的C57BL/6J小鼠EAE模型主要表現(xiàn)為復(fù)發(fā)-緩解型病程,適合從分子免疫學(xué)的角度探討發(fā)病機(jī)制[5],日漸成為MS臨床前研究、復(fù)雜新藥開發(fā)的重要研究手段。但是,該模型實(shí)驗(yàn)操作中仍有較多缺陷導(dǎo)致發(fā)病率不能達(dá)到100%、臨床表現(xiàn)和病程重復(fù)性差、死亡率偏高。因此,MOG35-55誘導(dǎo)C57BL/6J小鼠造模過程中的諸多細(xì)微的關(guān)鍵技術(shù)無疑應(yīng)該成為值得關(guān)注的問題。

1 免疫前準(zhǔn)備工作

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的確定與飼養(yǎng) 不同品種或品系的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物誘導(dǎo)EAE的易感性與臨床特點(diǎn)迥異,可能由主要組織相容性復(fù)合體基因的多樣性表達(dá)引起[6];EAE的敏感性和臨床過程的特點(diǎn)與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的動(dòng)物品種、年齡、性別具有相關(guān)性[7]。而小鼠在病理學(xué)方面的特點(diǎn)與人類非常相似[8],無論是慢性進(jìn)展型病程還是復(fù)發(fā)-緩解型病程上的模型在病理上均可見脫髓鞘特征。C57BL/6J小鼠一直被認(rèn)定為“標(biāo)準(zhǔn)”的近交系,可以為多種突變基因提供遺傳背景,是生理學(xué)方面、免疫學(xué)方面、遺傳學(xué)方面、腫瘤學(xué)方面在實(shí)驗(yàn)研究中的常用品系。MOG35-55誘導(dǎo)C57BL/6J小鼠建立EAE模型實(shí)驗(yàn)過程中,宜選用8～10周齡雌性C57BL/6J小鼠,體質(zhì)量18 g左右[9-10]。免疫操作前小鼠進(jìn)行適應(yīng)性飼養(yǎng)1周左右,飼養(yǎng)環(huán)境維持明-暗每次各12 h交替循環(huán),籠中每天給予充足的飼料和潔凈飲水[3]。

1.2 抗原乳劑的配制 完全弗氏佐劑(Complete Freun′s Adjuvant,CFA)是實(shí)驗(yàn)中最常用的免疫佐劑,無論是皮內(nèi)還是皮下注射CFA均可提高細(xì)胞免疫反應(yīng)的強(qiáng)度來激發(fā)多種自身免疫性疾病。大多數(shù)EAE模型在誘導(dǎo)方案中會(huì)采用CFA降低機(jī)體對(duì)抗原的破壞以延遲機(jī)體對(duì)抗原的免疫耐受,同時(shí)促進(jìn)抗原的彌散,從而使抗原對(duì)機(jī)體緩慢持續(xù)的發(fā)揮免疫原性[11]。相對(duì)于易感大鼠,小鼠對(duì)誘導(dǎo)EAE相對(duì)抵抗,主要體現(xiàn)在發(fā)病率以及發(fā)病時(shí)間的差異,因此需要佐劑輔助。此外,CFA可增加EAE模型血腦屏障(Blood Brain Barrier,BBB)的通透性和中樞神經(jīng)系統(tǒng)血管周圍血清蛋白滲出[12]。結(jié)核分枝桿菌在EAE模型的誘導(dǎo)中主要通過激發(fā)T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)來擴(kuò)大免疫效應(yīng)并引起淋巴結(jié)增生[13]。

乳化于完全弗氏佐劑的中樞神經(jīng)系統(tǒng)不同特異性抗原在不同實(shí)驗(yàn)動(dòng)物上誘導(dǎo)多種EAE,常見的抗原包括髓磷脂堿性蛋白(MBP)、蛋白脂質(zhì)蛋白質(zhì)(PLP)、髓鞘相關(guān)糖蛋白(MAG)和MOG,C57BL/6J小鼠是具有EAE-susceptible特性的品系之一,其對(duì)MOG的敏感抗原表位是35-55位氨基酸[14],其致敏的主要抗原是MOG35-55多肽(MEVGWYRSPFSRVVHLYNGK)。

MOG35-55抗原油包水乳劑的配制首先將MOG35-55多肽15 mg加入生理鹽水7.5 mL混勻?yàn)锳液(每100 μL液體含MOG35-55200 μg),將結(jié)核桿菌粉末30 mg加入完全弗氏佐劑(TB 1 mg/mL)7.5 mL中混為B液(每100 μL含結(jié)核桿菌500 μg),采用玻璃注射器吸取A液和B液后反復(fù)用力抽打2個(gè)小時(shí)以上充分乳化至將抗原油包水乳劑滴可以在清潔水面聚集而不分散并保持小球狀。見圖1。

1.3 百日咳毒素溶液的配制 早期的研究顯示,當(dāng)用小鼠脊髓勻漿組織溶于完全弗氏佐劑中來誘導(dǎo)EAE模型時(shí),百日咳毒素可以增加模型的成功率和加重神經(jīng)功能損傷癥狀[15]。后來的研究顯示百日咳毒素能破壞血腦屏障,防止自身反應(yīng)T細(xì)胞抗原產(chǎn)生,刺激抗原呈遞細(xì)胞(APCs),不可逆地抑制第二信使和影響信號(hào)通路[16],所有的這些結(jié)果都在解釋百日咳毒素幫助誘導(dǎo)EAE模型的可能機(jī)制。將百日咳毒素采用生理鹽水稀釋成0.1 mL含400 ng百日咳毒素的溶液。

圖1 抗原乳劑配制成功的標(biāo)準(zhǔn)

2 免疫操作

2.1 C57BL/6J小鼠麻醉 麻醉是保障動(dòng)物福利的重要內(nèi)容之一,也是動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的一項(xiàng)重要基本技術(shù)[17-18]。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物麻醉是保證實(shí)驗(yàn)成功的一個(gè)重要環(huán)節(jié),采用安全、有效、適宜的麻醉方法以達(dá)到良好的麻醉效果是保證實(shí)驗(yàn)安全性、數(shù)據(jù)可靠性的重要基礎(chǔ)。影響動(dòng)物麻醉效果的因素主要包括麻醉劑的種類、濃度、劑量和給藥方式。一項(xiàng)針對(duì)烏拉坦、阿佛丁和水合氯醛對(duì)C57BL/6J小鼠的麻醉研究證明[19],使用烏拉坦則麻醉效果差、死亡率高,以合適劑量注射阿佛丁或水合氯醛(4%水合氯醛以0.20 mL/20 g)對(duì)C57BL/6J小鼠的麻醉時(shí)可以達(dá)到起效時(shí)間短、維持時(shí)間適中、死亡率低的效果。水合氯醛是在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中具有良好效果和安全性保證的一種麻醉藥[4],具有性價(jià)比高、麻醉誘導(dǎo)快、術(shù)后蘇醒快、死亡率低等優(yōu)點(diǎn)[20]。一項(xiàng)水合氯醛對(duì)C57BL/6J小鼠麻醉研究表明,選擇水合氯醛(2.5%水合氯醛以0.10 mL/10 g)腹腔注射麻醉C57BL/6J小鼠就可以誘導(dǎo)淺麻狀態(tài)[21]。MOG35-55誘導(dǎo)C57BL/6J小鼠皮下注射抗原油包水乳劑過程中誘導(dǎo)至淺麻狀態(tài)即可,因此,建議使用2.5%水合氯醛以0.10 mL/10 g腹腔注射進(jìn)行麻醉。

2.2 皮下注射部位 建立EAE模型抗原油包水乳劑給予部位主要有后肢足掌、尾部和側(cè)腹皮下,其臨床病程、高峰期、最高臨床得分各不相同。C57BL/6J小鼠抗原給予部位均以側(cè)腹皮下為主,其中蛋白脂蛋白(PLP)+CFA+百日咳毒素(PT)制成的抗原誘導(dǎo)慢性病程,高峰期為23～25 d;以髓脂質(zhì)堿性蛋白(MBP)聯(lián)合PLP+CFA+PT制成的抗原誘導(dǎo)也為慢性病程,高峰期為10～20 d;以MOG的抗原誘導(dǎo)為復(fù)發(fā)-緩解病程,高峰期為14～20 d[22-23]。由于抗原乳劑能夠誘導(dǎo)強(qiáng)烈的炎性反應(yīng),甚至導(dǎo)致局部皮膚的肉芽腫和壞死,MOG35-55誘導(dǎo)C57BL/6J小鼠注射抗原油包水乳劑建議在小鼠側(cè)腹皮下分四點(diǎn)皮下注射共計(jì)0.2 mL MOG35-55抗原乳劑。注射完抗原乳劑30 min后每只小鼠腹腔內(nèi)注射0.1 mL(400 ng)百日咳毒素溶液,48 h后每只小鼠再次腹腔內(nèi)注射1次0.1 mL(400 ng)溶液。

3 免疫后護(hù)理

動(dòng)物的福利考慮周全,其中對(duì)動(dòng)物的優(yōu)質(zhì)護(hù)理能夠很大程度上減少應(yīng)激因素在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性、可靠性的干擾[5]。其中動(dòng)物麻醉中采取適當(dāng)?shù)乃『銣貕|保溫措施,可以顯著縮短麻醉周期和麻醉后恢復(fù)自主期的時(shí)間,減輕寒顫發(fā)生,增加動(dòng)物舒適度,對(duì)輔助實(shí)驗(yàn)動(dòng)物安全順利蘇醒有著重要的作用[24]。

免疫后小鼠由于強(qiáng)烈的炎性反應(yīng)產(chǎn)生眾多的免疫調(diào)節(jié)功能,小鼠出現(xiàn)激惹狀態(tài),建議減少單籠小鼠數(shù)量,并給予足量食物和水,否則弱小小鼠會(huì)被吃掉。免疫后3 d體質(zhì)量緩慢下降,并伴有精神萎靡、皮毛不光滑、活動(dòng)減少等特征,但是無運(yùn)動(dòng)功能障礙,隨后體質(zhì)量有所恢復(fù)。免疫第11天左右,伴隨著出現(xiàn)體質(zhì)量明顯下降,小鼠逐漸依次出現(xiàn)尾部遠(yuǎn)端無力、尾麻痹、跛行、弓背、肢體癱瘓、瀕死貌等癥狀,此時(shí)部分小鼠可以自行進(jìn)食、飲水,多數(shù)小鼠進(jìn)食、飲水比較困難,必須注意單籠飼養(yǎng)、食料及飲水嘴邊放置、保溫等精心呵護(hù),必要時(shí)進(jìn)行人工灌胃4次/d以防止其營(yíng)養(yǎng)缺乏、脫水及水電解質(zhì)紊亂等引起死亡,造模后死亡幾乎全由免疫后護(hù)理不周全引起。

4 結(jié)語(yǔ)

綜上所述,EAE模型模擬人類MS或與人類MS極為相似的發(fā)病現(xiàn)象旨在有助于人們深入研究MS并探索合適的治療方法。MOG35-55誘導(dǎo)C57BL/6J小鼠EAE模型在病理學(xué)特點(diǎn)上與人類MS相似,在復(fù)發(fā)緩解型病程上可見脫髓鞘特征,組建MOG35-55誘導(dǎo)C57BL/6J小鼠EAE模型的規(guī)范化流程彌補(bǔ)實(shí)驗(yàn)操作中的導(dǎo)致發(fā)病率不能達(dá)到100%和死亡率偏高的缺陷是進(jìn)行MS研究和治療的根基,其他研究工作都要圍繞在均一性動(dòng)物模型成功建立的基礎(chǔ)上展開。因此,加強(qiáng)免疫前準(zhǔn)備工作、免疫操作和免疫后護(hù)理3個(gè)方面的研究,分析EAE模型成功建立的關(guān)鍵性問題,對(duì)于其后一系列研究的成功有著重要意義。

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(2017-03-17收稿 責(zé)任編輯：王明)

Key issues on establishment of the experimental autoimmune encephalomyelitis model in C57BL/6J mice

Wu Yanqing1, Guo Yuhong1,2,3，Liu Qingquan1,2,3

(1BeijingHospitalofTraditionalChineseMedicine,affiliatedwithCapitalMedicalUniversity,Beijing100010,China; 2BeijingHospitalofTraditionalChineseMedicineshunyibranch,Beijing101300,China; 3BeijingKeyLaboratoryofbasicresearchwithTraditionalChineseMedicineoninfectiousdiseases,Beijing100010,China)

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) model is an internationally recognized classic animal model of multiple sclerosis (MS) and is widely used in researches on the pathogenesis of MS and the evaluation of immunomodulator for MS. However, There are still many defects leading to morbidity less than 100% and high mortality. Therefore, in order to reach a high morbidity, a low mortality and a stable EAE model, the process of EAE model establishment was standardized and refined by improving the preparation, operation and nursing of the model immunization. In addition, the key issues to the successful establishment were analyzed and the solutions were provided according to the process of experiment operation.

Experimental autoimmune encephalomyelitis; Key issues; Preparation before immunization; Operation in immunization; Nursing after immunization

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號(hào):81403221)

吳彥青(1980.02—),男,醫(yī)學(xué)博士,博士后,副主任醫(yī)師,研究方向:中醫(yī)藥防治急危重癥的臨床與基礎(chǔ)研究,E-mail:wyqbs120@163.com

劉清泉(1965.11—)，男，大學(xué)本科，主任醫(yī)師/教授，首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院院長(zhǎng)，研究方向：中西醫(yī)結(jié)合診治危重病，E-mail:liuqingquan2003@126.com

R228

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2017.04.006