miR-21、miR-27a、miR-27b的表達(dá)水平對多囊卵巢綜合征患者肥胖及代謝紊亂的影響

許偉偉,許昌,譚慧芳,呂映頻,祁秀娟,王秋陽,葉園英,王圓圓

(1.青島大學(xué)醫(yī)學(xué)部,山東青島 266000；2.煙臺毓璜頂醫(yī)院肝膽外科，山東煙臺 264000；3.青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科,山東青島 266000)

miR-21、miR-27a、miR-27b的表達(dá)水平對多囊卵巢綜合征患者肥胖及代謝紊亂的影響

許偉偉1,許昌2,譚慧芳3,呂映頻3,祁秀娟3,王秋陽1,葉園英1,王圓圓1

(1.青島大學(xué)醫(yī)學(xué)部,山東青島 266000；2.煙臺毓璜頂醫(yī)院肝膽外科，山東煙臺 264000；3.青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科,山東青島 266000)

目的 探討多囊卵巢綜合征(PCOS)患者外周血淋巴細(xì)胞miR-21、miR-27a、miR-27b的表達(dá)水平與肥胖及相關(guān)代謝紊亂的關(guān)系。方法 收集PCOS患者60例(非肥胖組22例，肥胖組38例)。電化學(xué)發(fā)光法檢測其血清促卵泡素(bFSH)、促黃體生成素(bLH)、雌二醇(bE2)、孕激素(bP)、睪酮(bT)、空腹胰島素(FINS)水平，葡萄糖氧化酶法測定葡萄糖(Glu)，實時熒光定量PCR(qPCR)法檢測淋巴細(xì)胞miR-21、miR-27a、miR-27b的表達(dá)水平。肥胖組控制體重后復(fù)測上述指標(biāo)。結(jié)果 肥胖組bT、Glu、FINS、HOMA-IR水平均明顯高于非肥胖組(P均<0.05)；肥胖組控制體重后BMI、bLH、bT、Glu、FINS、HOMA-IR水平較控制前均明顯降低(P均<0.05)。肥胖組miR-21、miR-27a、miR-27b的表達(dá)水均明顯高于非肥胖組(P均<0.05)，且控制體重后較控制前亦明顯降低(P均<0.05)。miR-21的表達(dá)量與bT呈正相關(guān)(r=0.342,P=0.008)，miR-27a、miR-27b的表達(dá)量與FINS呈正相關(guān)(r=0.413,P=0.001；r=0.397,P=0.002)。結(jié)論 miR-21、miR-27a和miR-27b可能參與PCOS患者肥胖及相關(guān)代謝紊亂的進(jìn)程。

多囊卵巢綜合征;微小RNA；肥胖；實時熒光定量PCR

多囊卵巢綜合征(PCOS)是一種常見的內(nèi)分泌紊亂疾病，多伴有肥胖表型， 其代謝紊亂可能與脂肪沉積、高雄激素、高胰島素等有關(guān)[1]。Murri等[2]發(fā)現(xiàn)miR-21、miR-27b在肥胖型與非肥胖型健康人群外周血中的表達(dá)水平存在明顯差異，而在PCOS患者中未發(fā)現(xiàn)明顯差異。miR-27a和miR-27b同屬于miR-27家族，二者在肥胖型與非肥胖型PCOS患者中的表達(dá)水平是否存在差異目前尚不清楚。本研究通過檢測外周血淋巴細(xì)胞miR-21、miR-27a和miR-27b在肥胖與非肥胖型PCOS患者中的表達(dá)水平，并分析控制體重對各項指標(biāo)的影響，旨在探討miR-21、miR-27a、miR-27b表達(dá)水平與PCOS肥胖及相關(guān)代謝紊亂(高雄激素、高胰島素血癥)關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 研究對象 選取2015年8月至2016年8月于青島大學(xué)附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科就診的PCOS患者60例，年齡27.77±2.52歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)依據(jù)歐洲人類生殖和胚胎醫(yī)學(xué)會與美國生殖醫(yī)學(xué)會(ESHRE/ASRM)制定的鹿特丹診斷標(biāo)準(zhǔn)確診為PCOS[3]。(2)近3個月內(nèi)未服用糖皮質(zhì)激素等激素類藥物者。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)其他引起高雄激素疾?。簬煨谰C合征、分泌雄激素的腫瘤、先天性腎上腺皮質(zhì)增生等。(2)排卵障礙的疾?。喝绺呙谌樗匮Y等。(3)其他引起肥胖的疾病或相關(guān)藥物服用史者。(4)合并其他嚴(yán)重疾病者。根據(jù)WHO對成年人體質(zhì)指數(shù)(BMI)的劃分，將PCOS患者分為非肥胖組(BMI<25 kg/m2)22例和肥胖組(BMI≥25 kg/m2)38例。按照《中國居民膳食指南》指導(dǎo)肥胖組患者調(diào)整飲食和加強(qiáng)體育鍛煉控制體重，其中18例患者體重呈明顯下降趨勢[BMI降低(2.27±0.27)kg/m2]，作為控制體重后組；余14例無明顯改變，6例失訪，不列入分析。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會批準(zhǔn)，患者均知情同意。

1.2 儀器及試劑 ABI Step One plus 定量PCR儀(美國ABI公司)，Nanodrop 2000超微量分光光度計(美國Thermo Scientific 公司)；Trizol試劑(美國Invitrogen公司)，淋巴細(xì)胞提取液(天津灝洋公司)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ PCR試劑盒(大連寶生物公司)；全自動電化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)及其配套的試劑盒(瑞士Roche公司)。

1.3 標(biāo)本采集 月經(jīng)正?；蛳“l(fā)的PCOS患者于月經(jīng)周期第3～5天,閉經(jīng)者于經(jīng)B超示無優(yōu)勢卵泡時采集空腹12 h以上的靜脈血標(biāo)本5 mL，3 000 r/min離心10 min，收集血清，2 h內(nèi)檢測各項指標(biāo)。

1.4 臨床相關(guān)指標(biāo)的檢測 采用全自動電化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)及配套試劑盒檢測血清促卵泡素(bFSH)、促黃體生成素(bLH)、雌二醇(bE2)、孕激素(bP)、睪酮(bT)、空腹胰島素水平(FINS)水平。葡萄糖氧化酶法測定葡萄糖(Glu)水平。由臨床醫(yī)師測量身高、體重，并根據(jù)公式BMI=體重(kg)/身高(m2)、胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)=Glu(mmol/L)×FINS(mIU/L) /22.5計算。肥胖者控制體重3個月后復(fù)查上述指標(biāo)。

1.5 RNA提取及實時熒光定量PCR檢測 取各研究對象空腹靜脈血4 mL，用淋巴細(xì)胞提取液提取淋巴細(xì)胞，Trizol試劑提取總RNA，用Nanodrop 2000超微量分光光度計檢測總RNA 濃度和純度，取吸光度(A260/280 nm)為1.8～2.0的樣本，樣本置-80 ℃凍存。用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，置-20 ℃保存。根據(jù)miR-21、miR-27a、miR-27b在miRBase中的登錄號(分別為hsa-miR-21-5pMIMAT0000076、hsa-miR-27a-3pMIMAT0000084、hsa-miR-27b-3pMIMAT0000419)，由廣州銳博公司設(shè)計并合成引物。按照SYBR?Premix Ex TaqTM Ⅱ PCR試劑盒說明書操作檢測miR-21、miR-27a、miR-27b的表達(dá)水平。PCR總反應(yīng)體系為20 μL，包括SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(2×)10 μL，10 μmol/L上、下游引物各0.5 μL，ROX Reference Dye(50×) 0.4 μL，DNA模板2 μL，ddH2O 6.6 μL。PCR循環(huán)參數(shù)：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共40個循環(huán)。采用Step One plus軟件采集熒光信號及熔解曲線分析，以U6(試劑盒自帶)為內(nèi)參照。結(jié)果以2-ΔΔCt法計算。

2 結(jié)果

2.1 肥胖與非肥胖型PCOS患者臨床資料的比較 2組患者年齡、bFSH、bLH、bE2、bP差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)；肥胖組BMI、bT、Glu、FINS、HOMA-IR及miR-21、miR-27a和miR-27b表達(dá)水均高于非肥胖組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。見表1。

2.2 肥胖型PCOS患者控制體重前后各項指標(biāo)的比較 肥胖組患者控制體重后BMI、bLH、bT、Glu、FINS、HOMA-IR及miR-21、miR-27a和miR-27b的表達(dá)水平較控制體重前明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。見表2。

表1 肥胖與非肥胖型PCOS患者臨床資料的比較

表2 肥胖組PCOS患者控制體重前后各臨床指標(biāo)的比較

2.3 miRNA表達(dá)水平與bT、FINS的相關(guān)性分析 雙變量相關(guān)性分析結(jié)果顯示，60例PCOS患者miR-21的表達(dá)水平與bT呈弱正相關(guān)(r=0.342,P=0.008)，與FINS無明顯相關(guān)關(guān)系(r=0.217,P=0.096)；miR-27a、miR-27b的表達(dá)水平與bT無明顯相關(guān)關(guān)系(r=0.146,P=0.266;r=0.122,P=0.353),而與FINS呈弱正相關(guān)(r=0.413,P=0.001；r=0.397,P=0.002)。

3 討論

PCOS通常伴有高雄激素血癥、高胰島素血癥或胰島素抵抗(IR)、肥胖等[4]。本研究發(fā)現(xiàn)肥胖型PCOS患者bT、Glu、FINS、HOMA-IR的表達(dá)水平均明顯高于非肥胖型，而通過調(diào)整飲食和加強(qiáng)體育鍛煉控制體重后，其bT、Glu、FINS、HOMA-IR水平較前明顯降低，表明通過控制體重可以改善肥胖型PCOS患者內(nèi)分泌紊亂。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，肥胖組和非肥胖組bLH水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，但控制體重后bLH表達(dá)水平可明顯降低，與彭真等[5]的研究結(jié)果一致。故而推測控制體重可以降低PCOS肥胖患者自身的bLH水平。

另有研究[6-7]表明， miR-21、miR-27a、miR-27b在糖脂代謝過程中發(fā)揮重要作用。Murri等[2]研究結(jié)果表明，miR-21、miR-27b在PCOS肥胖組與非肥胖組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。而本研究發(fā)現(xiàn)PCOS肥胖者miR-21、miR-27a、miR-27b的表達(dá)水平較非肥胖者明顯增加，結(jié)果不一致的原因可能與研究人群存在種族、地域差異性，PCOS的異質(zhì)性以及樣本量的多少有關(guān)。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)PCOS肥胖者控制體重后其外周血淋巴細(xì)胞miR-21、miR-27a、miR-27b的表達(dá)量降低，進(jìn)一步證實了miR-21、miR-27a、miR-27b可能參與了PCOS肥胖的進(jìn)展。

由于高雄激素、高胰島素血癥是PCOS的主要病理生理學(xué)基礎(chǔ)，且肥胖和高雄激素血癥、高胰島素血癥等病理生理學(xué)異常相互作用, 互為因果。本研究發(fā)現(xiàn)與非肥胖組相比，PCOS肥胖患者miR-21、miR-27a、miR-27b的表達(dá)水平較高。進(jìn)一步比較miR-21、miR-27a、miR-27b與bT、FINS的相關(guān)性，結(jié)果顯示miR-21的表達(dá)與bT呈正相關(guān)，與FINS無明顯相關(guān)；而miR-27a、miR-27b的表達(dá)與FINS呈正相關(guān)，與bT無明顯相關(guān)，但三者的相關(guān)性均較弱，推測miR-21、miR-27a、miR-27b可能參與了PCOS肥胖及相關(guān)代謝紊亂(高雄激素血癥、高胰島素血癥)的進(jìn)程，但具體的作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究證實。本研究還存在一些不足之處，如僅比較了肥胖型和非肥胖型PCOS患者的各項指標(biāo)，但是未能進(jìn)一步納入健康人群作為對照，且樣本例數(shù)仍顯不足使統(tǒng)計結(jié)果可能存在誤差。此外,本研究并未涉及miR-21、miR-27a、miR-27b在PCOS患者中調(diào)控的具體下游靶基因及作用途徑，今后我們將進(jìn)一步進(jìn)行相關(guān)機(jī)制研究。

[1]Tosi F, Di Sarra D, Kaufman JM,etal. Total body fat and central fat mass independently predict insulin resistance but not hyperandrogenemia in women with polycystic ovary syndrome[J]. J Clin Endocrinol Metab, 2015, 100(2):661-669.

[2]Murri M, Insenser M, Fernández-Durán E,etal. Effects of polycystic ovary syndrome(PCOS), sex hormones, and obesity on circulating miRNA-21, miRNA-27b, miRNA-103, and miRNA-155 expression[J]. J Clin Endocrino Metab, 2013, 98(11):1835-1844.

[3]Rotterdam ESHRE/ASRM-Sponsored PCOS consensus workshop group. Revised 2003 consensus on diagnostic criteria and long-term health risks related to polycystic ovary syndrome(PCOS)[J]. Hum Reprod, 2004,19(1):41-47.

[4]劉靖芳, 湯旭磊, 成建國,等. 多囊卵巢綜合征患者肥胖與糖代謝異常關(guān)系的研究[J]. 中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志, 2015, 25(18):73-76.

[5]彭真,張全,王麗娥,等. 控制體重對肥胖型多囊卵巢綜合征患者的療效觀察[J]. 生殖醫(yī)學(xué)雜志,2016,25(11):992-997.

[6]俞靜. 內(nèi)臟脂肪棕色化功能改變影響肥胖的分子機(jī)制研究[D].南京：南京醫(yī)科大學(xué),2013.

[7]Nunez Lopez YO, Garufi G, Seyhan AA. Altered levels of circulating cytokines and microRNAs in lean and obese individuals with prediabetes and type 2 diabetes[J]. Mol Biosyst, 2016, 13(1):106-121.

(本文編輯：許曉蒙)

10.13602/j.cnki.jcls.2017.03.10

許偉偉，1990年生，女，碩士研究生，主要從事臨床婦產(chǎn)科研究。

祁秀娟，教授，碩士研究生導(dǎo)師，E-mail:allseasons@yeah.com。

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2017-01-09)