3種食用菌分級多糖消脂護(hù)肝功能研究

趙爽，榮成博，劉宇，陳杰，徐甜甜

（1.北京市農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)環(huán)境保護(hù)研究所，北京市食用菌工程技術(shù)研究中心，北京100097；2.農(nóng)業(yè)部都市農(nóng)業(yè)（北方）重點實驗室，北京100097）

3種食用菌分級多糖消脂護(hù)肝功能研究

趙爽1，2，榮成博1，2，劉宇1，2，陳杰1，徐甜甜1

（1.北京市農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)環(huán)境保護(hù)研究所，北京市食用菌工程技術(shù)研究中心，北京100097；2.農(nóng)業(yè)部都市農(nóng)業(yè)（北方）重點實驗室，北京100097）

通過熱水提取、乙醇沉淀的方式獲得榆黃菇、毛木耳和灰樹花多糖，利用分子量截留的超濾方法獲得15個分級多糖組分。采用酒精和脂肪酸（FFA）共同誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞建立脂肪肝模型，以細(xì)胞存活率和胞內(nèi)甘油三酯含量為檢測指標(biāo)評價分級多糖消脂護(hù)肝作用。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)PSV、APV和GFV3個分子量高于100kDa的組分是各自品種分級多糖中的優(yōu)勢組分，比例分別為71.06%、34%和68.89%；3種分級多糖可以提高肝損傷細(xì)胞的存活率分別為27.61%、37.68%和29.25%，同時減少甘油三酯在細(xì)胞內(nèi)的堆積，具有明顯的消脂護(hù)肝作用。

榆黃菇；毛木耳；灰樹花；多糖；消脂；護(hù)肝

脂肪肝是一種以肝實質(zhì)細(xì)胞脂肪變性和脂肪貯存為特征的代謝性臨床病理綜合癥，其特征是彌漫性肝細(xì)胞大皰性脂肪變性，是與高胰島素血癥、血脂異常、II型糖尿病以及遺傳—環(huán)境—代謝應(yīng)激密切相關(guān)的臨床綜合征[1-2]。隨著生活水平的提高，脂肪肝的發(fā)病率不斷增高，根據(jù)全球流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，脂肪肝在成年人中的發(fā)病率高達(dá)20%～33%，而肥胖人群中的發(fā)病率達(dá)到75%。脂肪肝包括單純性肝臟脂肪變、脂肪性肝炎、脂肪性纖維化這一系列病變，最終可發(fā)展為肝細(xì)胞癌，脂肪肝病癥已經(jīng)引發(fā)社會的廣泛關(guān)注[3-4]。目前臨床上對于脂肪肝的治療常采用降血脂藥物、胰島素增敏劑和抗氧化細(xì)胞保護(hù)藥物為主，如他汀、二甲雙胍和羅格列酮等[5]，同時輔以飲食及生活習(xí)慣調(diào)整的方法。中醫(yī)多以疏利肝膽、健脾化濕、祛痰散結(jié)為主，復(fù)配抗脂肪肝的中草藥來治療脂肪肝[6]。

榆黃菇、毛木耳和灰樹花是近年來北方地區(qū)廣泛栽培具有藥理活性的大型真菌。藥理研究顯示，灰樹花、毛木耳多糖能夠明顯降低高脂血癥大鼠血清中膽固醇和甘油三酯的含量，具有清除自由基和抗脂質(zhì)過氧化的作用[7-10]。路玉蘭等研究發(fā)現(xiàn)榆黃菇多糖能夠增加小鼠脾臟重量，具有免疫調(diào)節(jié)的功能，何英還發(fā)現(xiàn)榆黃菇具有明顯的保肝作用[11-12]。3種多糖具有調(diào)節(jié)免疫、降血脂和抗氧化的功效，具有治療脂肪肝的應(yīng)用潛力，但是在消脂護(hù)肝方面的研究卻鮮見報道。因此本文針對3種多糖的消脂護(hù)肝功能展開了研究。

脂肪肝早期階段是肝脂肪變，其特征表現(xiàn)就是甘油三酯形成脂滴沉積在肝細(xì)胞胞漿中，因此利用游離脂肪酸（FFA）誘導(dǎo)肝細(xì)胞脂肪變是目前常用的體外建模方式[13]。但是人體內(nèi)脂肪肝形成往往是酒精和脂肪雙重影響導(dǎo)致，本研究模擬體內(nèi)環(huán)境采用酒精和FFA共同誘導(dǎo)，使細(xì)胞形成脂肪變模型，以細(xì)胞存活率和甘油三酯水平為評價指標(biāo)，研究榆黃菇、毛木耳和灰樹花15種分級多糖對HepG2細(xì)胞內(nèi)脂肪堆積的緩解作用，以期望為護(hù)肝藥物及功能食品的開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

細(xì)胞株HepG2：中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院；毛木耳3號、榆黃菇、灰樹花菌株：北京市農(nóng)林科學(xué)院植保所食用菌研究室保藏菌株；DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清（FBS）、雙抗（青霉素和鏈霉素）、胰酶：美國Invitrogen公司；油酸、棕櫚酸、MTT測試液、二甲基亞砜（DMSO）、油紅O：美國sigma公司；臺盼藍(lán)染液、Marry氏蘇木素、無水乙醇：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；甘油三酯（TG）酶法測定試劑盒：南京建成科技有限公司；BCA蛋白質(zhì)定量檢測試劑盒：北京博邁德生物技術(shù)有限公司。

MSC-1.2生物安全柜、Steti-cycle371CO2培養(yǎng)箱：美國Thermo公司；分級超濾系統(tǒng)：美國Millipore公司；HYC-360藥品保存箱：中國Haier公司；SHZ-88A恒溫水浴鍋：北京精科華瑞儀器有限公司；5810R冷凍離心機(jī)：美國Eppendrof公司；IX-71倒置顯微鏡：日本Olympus公司；移液器：美國Drummond公司。

1.2 方法

1.2.1 子實體分級多糖提取物的制備

將干燥的子實體制備成均一粉末，每一種子實體取20 g干粉，按1∶40（質(zhì)量比）比例加入去離子水，然后在4℃的冰箱放置10 h，充分浸提后以水浴搖床控制溫度和轉(zhuǎn)速進(jìn)行150 r/min、90℃、4 h的高溫提取。水浴提取后，混合物以6 000 r/min離心30 min取上清，根據(jù)上清液體積，加入4倍體積的無水乙醇靜置過夜使多糖析出，6 000 r/min離心30 min收集沉淀獲得固體多糖，放至60℃的烘箱中烘干直至質(zhì)量恒定，研磨成粉末狀配置成溶液[10]。用Seveage法去除多糖溶液中的蛋白質(zhì)，離心至無蛋白質(zhì)層出現(xiàn)，合并上清液后加入無水乙醇獲得多糖沉淀，烘干再溶解。將多糖溶液分別經(jīng)過分子量截留為8、30、50、100 kDa的膜包進(jìn)行超濾分離，獲得5個分子量分級組分I、II、III、IV和V，即小于8 kDa、8 kDa～30 kDa、30 kDa～50 kDa、50 kDa～100 kDa和大于100 kDa組分，并以硫酸苯酚法確定每一種多糖組分的濃度[14]。

1.2.2 雙因素脂肪損傷模型的建立

HepG2細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液（含1%青霉素、鏈霉素混合液）置37℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞生長至80%～90%密度時用0.25%胰蛋白酶消化，調(diào)整細(xì)胞濃度后接種于培養(yǎng)板進(jìn)行試驗。

取對數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞，細(xì)胞以8×103個/孔的濃度接種于96孔培養(yǎng)板中，置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁后，模擬體內(nèi)脂肪肝形成機(jī)制，以乙醇和游離脂肪酸（FFA）雙重因素誘導(dǎo)建模，檢測乙醇和FFA對細(xì)胞存活率的影響，篩選復(fù)配濃度，使培養(yǎng)液中乙醇終濃度達(dá)到1.4%、1.6%和1.8%，F(xiàn)FA終濃度為0.25、0.5、0.75 mmol/L，設(shè)置對照組，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。小心去除96孔中的培養(yǎng)液，每孔加入20 μL 5 mg/mLMTT培養(yǎng)液，180 μL無血清RPMI 1640培養(yǎng)基。37℃繼續(xù)培養(yǎng)，4 h后終止培養(yǎng)，吸棄孔內(nèi)的上清液，每孔加入200 μL DMSO，振蕩5 min使紫色結(jié)晶物充分溶解。在酶標(biāo)儀上560 nm波長處測定各孔的OD值。以未加入乙醇和FFA的空白組作為對照，計算細(xì)胞的存活率，篩選細(xì)胞存活率在60%～70%之間的組別作為建模處理條件。

國家藥品審評中心于2003年提出了 “仿產(chǎn)品不是仿標(biāo)準(zhǔn)”的指導(dǎo)思想[8]。本研究結(jié)果亦表明，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)對于不同來源產(chǎn)品的區(qū)分力是很弱的，難以揭示產(chǎn)品的內(nèi)涵。出于產(chǎn)品放行和生命周期的考慮，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的限度往往比較寬松，一個符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的產(chǎn)品是否一定是安全、有效的，還有待商榷。因此，一致性評價絕不能僅從質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)一致著手。

細(xì)胞以1.5×104個/孔的濃度接種于含有細(xì)胞爬片的24孔培養(yǎng)板中，以1.8%的酒精和0.5 mmol/L FFA處理細(xì)胞24 h。建模結(jié)束后，用10%的甲醛固定細(xì)胞，以油紅O稀釋液染色15 min，洗滌細(xì)胞，用Marry氏蘇木素浸染細(xì)胞核30 s，充分洗滌細(xì)胞，光鏡下觀察。

1.2.3 粗多糖細(xì)胞毒性評價

細(xì)胞以8×103個/孔的濃度接種于96孔培養(yǎng)板中，待細(xì)胞貼壁后，加入含有粗多糖的培養(yǎng)液，使多糖作用終濃度達(dá)到100、200、500、800、1 000 μg/mL，以未加多糖的處理組為對照，培養(yǎng)72 h后，用MTT比色法測定細(xì)胞存活率，設(shè)定對照組細(xì)胞活性為100%。

1.2.4 分級多糖消脂護(hù)肝功能檢測

護(hù)肝功能檢測：細(xì)胞以8×103個/孔的濃度接種于96孔培養(yǎng)板中，待細(xì)胞貼壁后，加入酒精和FFA建立脂肪肝模型24 h，其后更換含有分級多糖的培養(yǎng)液處理模型組，以硫酸－苯酚法確定分級多糖各組分的多糖濃度，調(diào)節(jié)濃度使作用濃度均為50 μg/mL，與脂肪肝細(xì)胞共培養(yǎng)48 h。以未處理的細(xì)胞組為對照組，以酒精和FFA處理的細(xì)胞組為模型組，用MTT比色法測定細(xì)胞存活率，設(shè)定對照組細(xì)胞活性為100%。

消脂功能檢測：細(xì)胞以3×105個/孔的濃度接種于6孔培養(yǎng)板中，選用最佳功效的分級多糖，設(shè)置終濃度為50 μg/mL處理模型組細(xì)胞，具體培養(yǎng)方法同護(hù)肝功能檢測，共培養(yǎng)結(jié)束后棄去培養(yǎng)液，收集破碎細(xì)胞，用組織甘油三酯測定試劑盒測定TG含量，用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白含量，以μmol/mg protein表示。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，實驗結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差（±s）表示，采用One－way ANOVA檢驗，P＜0.05表示具有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 榆黃菇、毛木耳和灰樹花分級多糖的提取制備

表1 3種食用菌多糖產(chǎn)量及其提取率Table 1 Yields and extraction rates of the three edible fungus

3種粗多糖通過不同分子量截留分別獲得5個組分，通過硫酸－苯酚法測定發(fā)現(xiàn)各組分多糖含量差異較大，表2顯示的是3種粗多糖分級提取后各組分的分布情況。

表2 3種食用菌分級多糖含量分布Table 2 The contents of fractional polysaccharides of the three edible fungus

在榆黃菇多糖構(gòu)成中，PS V組分所占比例最高，達(dá)到71.06%，其它4個組分含量相對平均，在3.78%～5.29%的范圍內(nèi)；灰樹花分級多糖的分布與榆黃菇的相似，比例最大的組分是GF V，占到68.89%，其余組分分布范圍從4.1%～5.24%；毛木耳多糖中AP III和AP V分布比例較大，分別為31.83%和34%，其次AP II分布比例為14.68%。通過分析發(fā)現(xiàn)，3種粗多糖中多糖分子量高于100 kDa的組分所占比例最高，相對分子量低的組分所占比例較少。

2.2 雙因素脂肪損傷模型的建立條件

以前期酒精引發(fā)肝損傷的研究為基礎(chǔ)[15]，選取引發(fā)低損傷的3個酒精濃度與FFA相互作用，圖1顯示的是雙因素相互作用后對細(xì)胞存活率的影響。

圖1 酒精和脂肪酸雙因素對細(xì)胞存活率的影響Fig.1 Influences of ethanol and fatty acids on cells viability

結(jié)果顯示酒精和FFA都可以降低HepG2細(xì)胞的存活率，是引發(fā)肝損傷的誘導(dǎo)因素。MTT結(jié)果顯示，酒精濃度的為1.6%和1.8%的兩個處理組中細(xì)胞存活率顯著低于空白對照組（P＜0.05），在相同濃度酒精條件下，細(xì)胞存活率隨著FFA的濃度升高而下降，通過分析發(fā)現(xiàn)酒精濃度為1.8%和0.5 mmol/LFFA共同作用的條件下，細(xì)胞存活率為68%，滿足模型的需求。

油紅O為活性很強(qiáng)的脂溶性染料，與組織或細(xì)胞的脂質(zhì)有較強(qiáng)的親和力，在脂肪內(nèi)能高度溶解，可特異性的使組織內(nèi)甘油三酯等中性脂肪著色[16]，可以直觀的顯示出細(xì)胞中脂肪含量。依據(jù)細(xì)胞存活率的檢測結(jié)果，選取酒精濃度1.8%和0.5 mmol/L的FFA共同作用建模，圖2顯示的是光鏡下模型組與對照組細(xì)胞中油脂的含量。鏡下觀察顯示，對照組的細(xì)胞內(nèi)僅有少量紅色油滴，而模型組細(xì)胞中密集的分布著紅色油脂，說明通過酒精和FFA誘導(dǎo)能夠引發(fā)脂肪肝的形成，可用于后續(xù)的功能研究。

圖2 細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)油紅O染色結(jié)果Fig.2 Intracellularlipid droplets staining with Oil red O

2.3 粗多糖的細(xì)胞毒性檢測

3種粗多糖以多種濃度直接作用于細(xì)胞72 h后，通過MTT方法檢測細(xì)胞的存活率發(fā)現(xiàn)經(jīng)過榆黃菇多糖的處理，細(xì)胞存活率可以保持在94%以上，其中200 μg/mL～1 000 μg/mL能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖，存活率超過100%（見圖3）；毛木耳和灰樹花粗多糖對HepG2不存在細(xì)胞毒性，各作用濃度均可使細(xì)胞的存活率保持在90%以上。檢測結(jié)果證明3種多糖均可作為護(hù)肝藥物開展護(hù)肝功能檢測。

圖3 3種粗多糖對HepG2細(xì)胞毒性檢測Fig.3 Cytotoxicity assays of the three crude polysaccharides

2.4 分級多糖消脂護(hù)肝功能研究

3種食用菌的分級多糖以同一作用濃度處理脂肪肝細(xì)胞后，經(jīng)過MTT檢測細(xì)胞存活率發(fā)現(xiàn)各分級多糖組分都可以不同程度的提高細(xì)胞存活率。與模型組相比較，榆黃菇品種中PS IV和PS V組分是5個分級多糖中功效最顯著的組分，兩者的功效不存在顯著差異（P＞0.05），分別可以提高細(xì)胞存活率達(dá)到28.79%和27.61%；毛木耳AP V組分活性最高，可提高存活率達(dá)到37.68%；灰樹花GF V組分活性最高，可提高存活率達(dá)到29.25%，具體各組分對細(xì)胞存活率的影響見表3所示。

表3 分級多糖對肝損傷細(xì)胞存活率的影響Table 3 Influences of fractional polysaccharides on injury cells viability

經(jīng)過分級多糖對細(xì)胞存活率作用的篩選，發(fā)現(xiàn)PS IV、PS V、AP V和GF V是3種食用菌的最佳功效組分。以上述分級多糖分別作用模型細(xì)胞48 h后，測定胞內(nèi)TG含量來反映多糖的消脂作用。由圖4顯示PS IV、PS V、AP V和GF V可以分別降低細(xì)胞內(nèi)TG含量達(dá)到55.43%、47.34%、54.68%和29.32%，與模型組比較均達(dá)到顯著性差異的程度（P＜0.05），說明這4種多糖可以減少脂肪在細(xì)胞內(nèi)的堆積。

綜合多糖含量和功效分析發(fā)現(xiàn)，PS IV和PS V分別占榆黃菇子實體干重的4.35‰和81.72‰，AP V在毛木耳子實體干重中的含量為5.1‰，GF V占灰樹花子實體干重的24.11‰。PS IV雖然是榆黃菇中護(hù)肝消脂功效最強(qiáng)的組分，但是其含量遠(yuǎn)低于PS V，因此PS V更適合作為功效組分進(jìn)行開發(fā)應(yīng)用。通過本研究的評價和篩選證明，PS V、AP V和GF V是榆黃菇、毛木耳和灰樹花中的護(hù)肝降脂的功效成分，具有藥物開發(fā)和應(yīng)用的前景。

圖4 分級多糖對胞內(nèi)TG含量影響Fig.4 Influences of fractional polysaccharides on intracellular TG content

3 結(jié)論

本研究模擬體內(nèi)脂肪肝成因在體外建立起酒精和脂肪酸雙因素誘導(dǎo)的脂肪肝模型，在模型的基礎(chǔ)上研究了榆黃菇、毛木耳和灰樹花分級多糖對細(xì)胞存活率以及胞內(nèi)甘油三酯含量的影響。結(jié)合分級多糖的提取率和功效分析篩選出PS V、AP V和GF V 3種護(hù)肝消脂功能多糖，為護(hù)肝藥物的開發(fā)奠定了研究基礎(chǔ)，擴(kuò)大了食用菌多糖的應(yīng)用范圍。

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Reduce Fat and Hepato-protective Studies on Fractional Polysaccharides of Pleurotus citrinipileatus，Auricularia polytricha and Grifola frondosa

ZHAO Shuang1，2，RONG Cheng-bo1，2，LIU Yu1，2，CHEN Jie1，XU Tian-tian1
（1.Institute of Plant and Environment Protection，Beijing Academy of Agriculture and Forestry Science，Beijing Engineering Research Center for Edible Mushroom，Beijing 100097，China；2.Key Laboratory of Urban Agriculture（North），Ministry of Agriculture，Beijing 100097，China）

This study obtained crude polysaccharides of Pleurotus citrinipileatus，Auricularia polytricha and Grifola frondosabythe hot-water-extraction and ethanol-precipitation method.The crude polysaccharides were divided into 15 fractional components using ultrafiltration method of molecular weight.Fatty liver injury model was induced by alcohol and fatty acids with HepG2 cells.The cell survival rate and intracellular triglyceride levels were detected to evaluate the hepato-protective effect of fractional polysaccharides.The results showed that the components PS V，AP V and GF V，molecular weight above 100 kDa，were the highest content fractions each strains with the ratios of 71.06%，34%and 68.89%，respectively.PS V，AP V and GF V could increase the survival rate of injury hepatic cells，which were 27.61%，37.68%and 29.25%，respectively.Meanwhile these fractional polysaccharides also reduced intracellular triglycerides accumulation，which indicated that they were potential agents in hepatic protection application.

Pleurotus citrinipileatus；Auricularia polytricha；Grifola frondosa；polysaccharide；reduce fat；hepato-protection

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.08.037

2017-01-11

北京市優(yōu)秀人才培養(yǎng)資助項目（2015000020060G138）；北京市農(nóng)林科學(xué)院青年基金項目(QNJJ201524)；北京市農(nóng)林科學(xué)院科技創(chuàng)新能力建設(shè)專項（KJCX20170205）

趙爽（1982—），女（回），助理研究員，博士，研究方向：食用菌功能及加工技術(shù)研究。