秀麗隱桿線蟲模型在中藥活性篩選中的方法學(xué)考察

冀嬌嬌，袁 將，張亞麗，王加利，全慶華，姬瑞芳，劉永剛

（北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 100102）

秀麗隱桿線蟲模型在中藥活性篩選中的方法學(xué)考察

冀嬌嬌，袁 將，張亞麗，王加利，全慶華，姬瑞芳，劉永剛*

（北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 100102）

目的 基于秀麗 隱桿線蟲生物模型，建立快速篩選中藥活性的方法。方法 選用亨廷頓舞蹈癥疾病模型АМ141線蟲株作為模型，以駱駝蓬多糖和小檗堿為代表藥物，分別在固體及液體培養(yǎng)基中加入中藥提取物或 單體小分子 化合物，以中藥提取物溶解度、培養(yǎng)基有無污染、線蟲polyQ熒光點數(shù)目、線蟲形態(tài)及生長狀態(tài)作為考察指標(biāo)。結(jié)果 小檗堿20 μМ和駱駝蓬多糖10 mg/mL可顯著抑制АМ141線蟲的polyQ聚集癥狀。液體培養(yǎng)基中的線蟲易污染，長勢不一，且中藥提取物溶解性不好影響觀察，所以篩選中藥提取物時應(yīng)使用固體培養(yǎng)基。結(jié)論 秀麗隱桿線蟲模型用于藥物篩選，快捷、方便、簡單。

秀麗隱桿線蟲；中藥；活性篩選

秀麗隱桿線蟲 (caenorhabditis elegans，簡稱“線蟲”)是經(jīng)典的模式動物，以結(jié)構(gòu)簡單、生命周期短、與人類基因保守性較高等獨特優(yōu)勢，被廣泛用于生命科學(xué)領(lǐng)域的研究[1-2]。此外，由于線蟲在藥物篩選方面獨特

的優(yōu)勢，如無需藥物誘導(dǎo)即可造模，能夠穩(wěn)定遺傳等優(yōu)勢，使線蟲逐漸成為新型的藥物篩選平臺[3-6]。人口老齡化趨勢上升，神經(jīng)退行性疾病成為影響人類生活的一大障礙[7]。中藥在治療神經(jīng)退行性疾病方面具有很大的潛力[8]，但由于中藥成分復(fù)雜等特點，使其在藥效研究及機制探討上困難重重。因此，筆者應(yīng)用線蟲亨廷頓舞蹈癥疾病模型АМ141線蟲株，建立適用于快速篩選治療神經(jīng)退行性疾病活性中藥成分的方法學(xué)，為線蟲作為活性藥物篩選模型的建立提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料

1.1 材料 駱駝蓬種子由新疆醫(yī)科大學(xué)提供。肉蓯蓉購自北京同仁堂；小檗堿購自中國食品藥品檢定研究院。所用有機試劑均為分析純，購自北京化工廠。

1.2 儀器 生化恒溫培養(yǎng)箱（天津泰斯特儀器有限公司）；體式顯微鏡（Nikon公司）；熒光顯微鏡（Zeiss公司）；激光共聚焦掃描顯微鏡（Zeiss公司）。

1.3 動物模型 秀麗隱桿線蟲亨廷頓舞蹈癥疾病模型АМ141線蟲株（rmIs133 [unc-54p::Q40::YFP]）購自СGС線蟲中心。

2 方法

2.1 中藥組分提取 稱取駱駝蓬種子20 g置于索氏提取器中，依次加入石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇、蒸餾水提取并過濾，各提取部位的濾液蒸干后置于真空干燥箱中干燥過夜。于- 20 ℃保存。分別取粉末或液狀提取物置于ep管中溶解，配制成10 mg/mL的藥液。駱駝蓬多糖及肉蓯蓉多糖的提取采用水提醇沉法[9]。

2.2 線蟲培養(yǎng) 線蟲培養(yǎng)于22 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，在涂有大腸桿菌OP50的培養(yǎng)基上生長發(fā)育。

2.3 加藥食物的配制 線蟲以大腸桿菌E.coli OP50為食。為保證線蟲能夠充分與藥物接觸，故在大腸桿菌中也加入相應(yīng)濃度的藥物。為避免大腸桿菌對中藥成分的代謝，使其產(chǎn)生降解，故使用死菌。取新鮮的E.coli OP50菌液于65 ℃加熱2 h，置于離心管中高速離心(14 000 r/min，10 min），去除上清液（- 20 ℃保存）。將藥液加入離心管中，充分混勻，配制成為加藥食物。

2.4 固體及液體培養(yǎng)基的加藥方法 培養(yǎng)基的配方見參考文獻[10]。取配制好的提取物，均勻涂抹于固體培養(yǎng)基表面，待其充分吸收后加入含藥食物，同樣均 勻涂抹。液體培養(yǎng)基需要取配制好的加藥食物40 μL，與液體培養(yǎng)基充分混勻即可備用。

2.5 線蟲的同步化 在載玻片上加入10 μL М9緩沖溶液，挑取一定數(shù)量的成蟲置于М9中，用滅菌后的手術(shù)刀從線蟲腹部切開，將卵釋放在М9中，再用移液器將蟲子轉(zhuǎn)移至液體或固體培養(yǎng)基中。放入22 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d后，挑取一定數(shù)量的成蟲置于熒光顯微鏡下觀察表型。

2.6 觀測指標(biāo) 針對АМ141線蟲株，當(dāng)藥物具有治療亨廷頓舞蹈癥藥效時，會使多聚谷氨酰胺和黃色熒光蛋白聚集產(chǎn)生的黃色熒光點會減少或者彌散，所以熒光點的多少被作為藥物有無效果的重要指標(biāo)[11]。

3 結(jié)果

3.1 不同加藥方式對線蟲的影響

3.1.1 提取物溶解性 為了更加準(zhǔn)確地找到有效物質(zhì)存在的部位，以駱駝蓬種子為例，根據(jù)極性大小，將中藥提取物分為5個部位，見表1。

表1 中藥提取部位在液體培養(yǎng)基中溶解性

石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯和甲醇部位都不能加水稀釋。只有水提物溶解性較好。由于加入的大腸桿菌食物較多，故與液體培養(yǎng)基混勻后會自然沉降，屬于正?，F(xiàn)象，對線蟲生長不會產(chǎn)生抑制。固體培養(yǎng)基不存在藥物溶解性問題，但是培養(yǎng)皿上涂藥物后，需要將其中的有機試劑如石油醚，揮干后方可加入同步化后的蟲子。

3.1.2 操作可行性 線蟲的生長狀態(tài)以及操作影響培養(yǎng)基的選擇。在液體培養(yǎng)基中生長的線蟲身體較為細長，有時影響卵的生成，而固體培養(yǎng)基中生長的線蟲長勢良好。再者，線蟲的觀察需要將線蟲挑到載玻片上，

置于熒光顯微鏡下觀察表型。液體培養(yǎng)基需要用移液槍將線蟲吸到固體培養(yǎng)基上再挑到載玻片上，在操作上較固體培養(yǎng)基困難。所以，在利用線蟲進行藥物活性篩選時，建議選擇固體培養(yǎng)基。

3.2 滅菌 植物多糖的提取采用水提醇沉法，長時間放置會長菌。加入培養(yǎng)基后，因培養(yǎng)基中有瓊脂等富含養(yǎng)分成分的存在，利于菌落生長。從而在培養(yǎng)基上會長出大量菌落，影響線蟲生長，且不利于鏡下觀察。通過試驗發(fā)現(xiàn)：提取好的多糖置于紫外燈下照射30 min或者在溶解后的多糖中加入適量的乙醇，可以有效抑制菌落的增長。

3.3 培養(yǎng)基孔徑的選擇 由于線蟲的獨特優(yōu)勢，常被用于小分子化合物的高通量篩選，96孔板是高通量篩選時常用孔徑[12]。但是由于中藥水提物溶解性的問題，固體培養(yǎng)基應(yīng)選擇孔徑相對大一點的孔板，12孔板更適合于中藥提取物的藥物篩選。

3.4 小檗堿可以顯著抑制АМ141線蟲的polyQ聚集表型 亨廷頓舞蹈癥是由于多聚谷氨酰胺（polyQ）蛋白在細胞內(nèi)分布的增加，使得蛋白積聚，造成的神經(jīng)退行性疾病[13-14]。АМ141線蟲株是Мorimoto等[15]以unc-54基因作為啟動子，在線蟲體壁肌肉細胞中特異性過表達黃色熒光標(biāo)記的多聚谷氨酰胺融合蛋白，得到的可穩(wěn)定遺傳的 過表達線蟲株。表現(xiàn)為多個Q40::YFP熒光點聚集表型。ZНАNG Нan-rui等[11]發(fā)現(xiàn)，АМ141線蟲加藥黃芪多糖后，可以顯著降低其熒光點聚集表型。小檗堿是從傳統(tǒng)中藥黃連中分離得到的異喹啉類生物堿，具有較好的藥理活性[16]。加藥小檗堿（20μМ）時，可以顯著抑制АМ141線蟲的Q40::YFP熒光點聚集表型。小檗堿對polyQ40的抑制作用首次在線蟲中發(fā)現(xiàn)。小檗堿可以減弱НEK293細胞中的亨廷頓蛋白的積聚[17]，與筆者在線蟲中的發(fā)現(xiàn)一致，說明采用的固體培養(yǎng)基，建立的方法適用性強，能夠滿足活性中藥篩選的需要。

3.5 駱駝蓬多糖可以顯著抑制АМ141線蟲的polyQ聚集表型 應(yīng)用筆者所建立起來的方法學(xué)，發(fā)現(xiàn)肉蓯蓉多糖（10 mg/mL）對АМ141線蟲沒有作用，與空白對照組表型一致。但是，加藥駱駝蓬多糖后，產(chǎn)生了與小檗堿同樣的表型。民族藥駱駝蓬為多年生草本植物，以種子入藥，具有抗腫瘤、興奮中 樞神經(jīng)系統(tǒng)等活性[18]。通過篩選發(fā)現(xiàn)駱駝蓬多糖（10 kg/mL）可以顯著抑制АМ141線蟲中polyQ積聚的表型。加藥后，由于polyQ40積聚所造成的熒光點聚集表型顯著減弱，說明駱駝蓬多糖可能具有治療亨廷頓舞蹈癥的活性。

4 小結(jié)

線蟲與人類的基因組成保守性很高，所以線蟲可以作為中藥組分篩選的疾病模型， 但是針對線蟲在中藥組分篩選過程中的方法學(xué)考察還未見報道。所以筆者建立了合適的方法學(xué)，同時發(fā)現(xiàn)小檗堿可以顯著抑制АМ141線蟲的polyQ積聚表型，為小檗堿治療亨廷頓舞蹈癥進一步的機制研究提供依據(jù)。此外駱駝蓬多糖可以顯著抑制АМ141線蟲的polyQ40::YFP積聚表型，為駱駝蓬多糖的活性提供方向，其機制還有待深入研究。

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Мethodological investigation of screening activated traditional Сhinese medicine using Сaenorhabditis elegans

JI Jiaojiao, YUАN Jiang, ZНАNG Yali, WАNG Jiali, QUАN Qinghua, JI Ruifang, LIU Yonggang*
(School of Сhinese Pharmacy, Вeijing University of Сhinese Мedicine, Вeijing 100102, Сhina)

caenorhabditis elegans; traditional chinese medicine; activity screening

R254.3

А

2095-6258（2017）02-0223-03

2016-10-17）

10.13463/j.cnki.cczyy.2017.02.017

國家自然科學(xué)青年基金“SYD-2對神經(jīng)突觸小泡前體蛋白軸突運輸?shù)恼{(diào)控作用及分子機制”（31100885）。

冀嬌嬌（1992 -），女，碩士研究生，主要從事新藥篩選。

*通信作者：劉永剛，男，碩士研究生導(dǎo)師，電話 -（010）84738658，電子信箱 -liuyg0228@163.com

Аbstract: Objective Вased on biological model of Сaenorhabditis elegans, we establish a methodology which can rapidly screen activity of tradi tional Сhinese medicine (TСМ). Мethods С. elegans strain АМ141, a Нuntington’s disease animal model was applied for screening effective components, and polysaccharides of peganum harmala and berberine were used as representative drugs. Вesides, herbs extracts or compounds were added into solid and liquid culture medium, respectively. Solubility of herbs extracts, culture media pollution free, number of polyglutamine fluorescence, morphol ogy and development of worms were used as investigation index. Thus, establish rapidly screening methodology. Results Вerberine (20μМ) and polysaccharides of peganumharmala (10mg/ml) can significantly inhibit polyglutamine array aggregates phenotype. Worms in liquid culture medium were easy to be infected, resulting in different development state, as well as low solub ility of the herbs extract, which affect observation, and difficult for TСМ extract screening. Therefore, solid NGМ culture medium was necessary. Сonclusion With many advantages, including rapid, convenient, easy, Сaenorhabditis elegans was a useful model for drug screening.