鐵線蓮屬植物遺傳標(biāo)記研究進(jìn)展

和文志+楊玲+王昌命

摘要：指出了鐵線蓮屬植物具有很高的觀賞和藥用價(jià)值，在園林綠化中有廣泛地應(yīng)用。從形態(tài)學(xué)標(biāo)記、細(xì)胞學(xué)標(biāo)記及DNA分子標(biāo)記3個(gè)方面總結(jié)了鐵線蓮屬植物研究現(xiàn)狀，并且展望了遺傳標(biāo)記在鐵線蓮屬植物的應(yīng)用前景。并提出了遺傳標(biāo)記技術(shù)可以應(yīng)用于鐵線蓮屬植物遺傳變異分析、品種分類及遺傳多樣性評(píng)價(jià)等的研究。

關(guān)鍵詞：鐵線蓮；遺傳標(biāo)記；研究進(jìn)展

中圖分類號(hào)：S53

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1674-9944（2017）6-0191-04

1 引言

鐵線蓮屬（Clematis L.）植物隸屬于毛茛科，有“藤本花卉皇后”的美稱，廣泛分布于世界各地，全世界約有300余種。中國約有該屬植物133種，分布較廣，主要分布在西南地區(qū)[1，2]。該屬植物花期長(zhǎng)，花型大且色澤豐富，包含白、粉紅、深藍(lán)、紫色等顏色，具有很高的園藝觀賞價(jià)值[3]。在歐洲、日本、新西蘭、美國等國家占有十分重要地位，大部分植物園、公園和家庭花園都能見到。此外，鐵線蓮植物因其含有各種藥物活性成分，自中華文明發(fā)源以來就一直做為傳統(tǒng)藥材使用，以根及全株入藥。近年來從各種不同鐵線蓮植物中發(fā)現(xiàn)了三萜皂甙、黃酮、香豆素、生物堿及其他許多活性成分[4～6]，這些活性成分具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抗腫瘤、抗氧化、保肝利膽及抗風(fēng)濕等作用[7]，鐵線蓮屬植物的藥用價(jià)值更是激起了人們對(duì)鐵線蓮屬藥用資源植物的研究熱情。

遺傳標(biāo)記（genetic marker）是指可追蹤染色體，染色體某一些節(jié)段，某個(gè)基因座在家系中傳遞的任何一種遺傳特性。生物體任何可遺傳的基因突變導(dǎo)致的表型差異都可以作為遺傳標(biāo)記。遺傳標(biāo)記的發(fā)展經(jīng)歷了形態(tài)學(xué)標(biāo)記（morphological marker）、細(xì)胞學(xué)標(biāo)記（cytological marker）、生物化學(xué)標(biāo)記（biochemical marker）及分子標(biāo)記（molecular marker）4個(gè)階段。但是生化標(biāo)記鐵線蓮屬植物研究中未見報(bào)道，其余幾種遺傳標(biāo)記技術(shù)的應(yīng)用相對(duì)比較廣泛。遺傳標(biāo)記的應(yīng)用可以為鐵線蓮屬植物的親緣關(guān)系分析、遺傳變異及品種分類等研究提供依據(jù)。

2 鐵線蓮屬植物的形態(tài)學(xué)標(biāo)記

在鐵線蓮屬植物遺傳多樣性的研究中，形態(tài)學(xué)標(biāo)記是最傳統(tǒng)、最簡(jiǎn)便的方法。通過對(duì)鐵線蓮屬植物的表現(xiàn)性狀如根、莖、葉、花、果實(shí)和種子形態(tài)特征及生理性狀的觀測(cè)，可以用于種間分類和親緣關(guān)系鑒別等方面的研究。最早由林奈于1753年建立了鐵線蓮屬，并且根據(jù)莖形態(tài)特征不同將9種鐵線蓮劃分為攀援類和直立類，還建立了長(zhǎng)瓣鐵線蓮屬（Atragene L.）。此后，1818年De Candolle根據(jù)總苞、萼片、雄蕊及花柱等形態(tài)特征對(duì)鐵線蓮屬分類進(jìn)行了修訂。1885年Kuntze根據(jù)花柱、雄蕊、萼片等花部形態(tài)特征對(duì)鐵線蓮屬屬下類群進(jìn)行分類整理，但其并不承認(rèn)由De Candolle建立的Naravelia屬。1987年日本學(xué)者Tamura根據(jù)幼苗葉片、花萼、雄蕊等形態(tài)的描述，將鐵線蓮屬植物劃分為4個(gè)亞屬[8]。2000年Grey-Wilson C以花萼水平開展、雄蕊無毛作為原始類群，以花萼鐘狀（或管狀）、雄蕊被毛作為進(jìn)化類群，將鐵線蓮屬劃分為9個(gè)亞屬，這與日本學(xué)者Tamura的觀點(diǎn)相反[9]。2000～2006年，王文采[10～15]通過對(duì)鐵線蓮屬植物的營養(yǎng)、生殖器官的特征進(jìn)行描述，根據(jù)該屬植物的形態(tài)學(xué)特征建立了毛茛科鐵線蓮屬新的分類系統(tǒng)，但該分類系統(tǒng)不贊同前人將Naravelia屬劃分成組的處理。2007年孫誠等[16]通過對(duì)全世界約2000份鐵線蓮臘葉標(biāo)本的形態(tài)學(xué)特征調(diào)查結(jié)果進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育重建，并且對(duì)部分種群進(jìn)行重新分類，但其研究結(jié)果不支持王文采將subsect.Connatae亞組下劃分的一個(gè)系ser.Pogonandrae。

形態(tài)學(xué)標(biāo)記不僅用于鐵線蓮屬早期的形態(tài)分類、遺傳進(jìn)化和親緣關(guān)系的研究，而且用于該屬植物的適應(yīng)性、觀賞性和園藝性狀改良等方面的研究。閆雙喜等[17]闡述了河南境內(nèi)的鐵線蓮的分布和觀賞特性，對(duì)河南鐵線蓮屬植物開發(fā)進(jìn)行了探討。劉立波等[18]描述了從歐洲引進(jìn)的6個(gè)栽培品種株高、花期、花冠顏色、萼片個(gè)數(shù)和花徑等性狀，并對(duì)其適生性進(jìn)行評(píng)價(jià)。蔣京橋等[19]對(duì)毛茛鐵線蓮花期、單花的形態(tài)與功能形態(tài)及結(jié)實(shí)率等生物學(xué)特性進(jìn)行了報(bào)道，討論了毛茛鐵線蓮結(jié)實(shí)率低的原因和解決方法。

3 細(xì)胞學(xué)標(biāo)記

細(xì)胞學(xué)標(biāo)記是一種把染色體的形態(tài)結(jié)構(gòu)的變異作為遺傳學(xué)標(biāo)記的研究方法。一般是利用核型分析的方法對(duì)染色體的數(shù)目、形態(tài)進(jìn)行分析。染色體形態(tài)結(jié)構(gòu)與外部形態(tài)結(jié)構(gòu)相比受外界環(huán)境因素的影響更小。通過對(duì)有絲分裂中期的染色體數(shù)目、形態(tài)結(jié)構(gòu)的分析從而在細(xì)胞學(xué)水平上對(duì)鐵線蓮進(jìn)行種屬分類，探討物種的遺傳進(jìn)化和親緣關(guān)系。早在1985年龔維忠等[20]對(duì)來自北京和東北地區(qū)鐵線蓮屬的11個(gè)種的核型進(jìn)行了研究，結(jié)果表明僅有1種為異源四倍體（2n=4x=32），其余10種為二倍體（2n=2x=16），認(rèn)為鐵線蓮核型的進(jìn)化方式分為四種：二倍體到多倍體，最長(zhǎng)與最短染色體比值增大，結(jié)構(gòu)變異和由st演化到t型。張鎰鋰[21]對(duì)我國鐵線蓮屬的7個(gè)種的染色體形態(tài)和數(shù)目進(jìn)行了描述，證明了前人鐵線蓮屬染色體演化趨勢(shì)是由對(duì)稱到不對(duì)稱的研究推論。2011～2015年，盛璐[22，23]先后研究了16種國內(nèi)野生鐵線蓮和7種購于國外的鐵線蓮的染色體數(shù)量和形態(tài)特征。結(jié)果表明，鐵線蓮屬染色體數(shù)目穩(wěn)定，基數(shù)x=8。除圓錐鐵線蓮的染色體為32條外，其余都為16條。核型屬于比較原始的“2A”型。平均臂比值為1.80～3.31之間。連同前人已報(bào)道的共計(jì)32種鐵線蓮根據(jù)核型聚類分析發(fā)現(xiàn)核型分類與形態(tài)學(xué)分類結(jié)果并不完全一致，作者又從分子水平進(jìn)行了深入研究。彭綠春等[24]分析了4個(gè)野生種和6個(gè)國外引進(jìn)栽培品種鐵線蓮組培幼苗根尖細(xì)胞染色體形態(tài)特征。結(jié)果表明，除“杰克曼”染色體為14條外，其余染色體數(shù)均為16條。根據(jù)核型似近系數(shù)的聚類分析結(jié)果與形態(tài)學(xué)分類部分結(jié)果是一致的。

4 DNA分子標(biāo)記

分子標(biāo)記是繼表型、生理、形態(tài)和生化標(biāo)記后發(fā)展起來的以核苷酸鏈多態(tài)性為基礎(chǔ)的遺傳標(biāo)記。分子標(biāo)記反映了生物個(gè)體的可遺傳的核酸序列變異特征，是DNA分子多態(tài)性的直接顯現(xiàn)。與其它遺傳標(biāo)記相比，DNA分子遺傳標(biāo)記具有數(shù)量豐富，信息量大；取材不受生長(zhǎng)發(fā)育的影響；擁有較多共顯性，信息位點(diǎn)完整；基因組中的非編碼區(qū)DNA序列不易受環(huán)境因素影響，而且具有操作簡(jiǎn)單、迅速等優(yōu)點(diǎn)。目前在鐵線蓮屬植物研究中運(yùn)用到的分子標(biāo)記技術(shù)主要一方面基于PCR技術(shù)的分子標(biāo)記：隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA標(biāo)記（Random Amplified Polymorphic DNA，RAPD），簡(jiǎn)單重復(fù)間序列（Inter-Simple Sequence Repeat，ISSR）分子標(biāo)記以及聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)及單鏈構(gòu)象多態(tài)性（Polymerase Chain Reaction-Single Strand Conformation Polymorphism，PCR-SSCP）。另一方面基于DNA序列分析的分子標(biāo)記：核糖體DNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（Internal Transcribed Spacer，ITS）序列分析等。

4.1 RAPD分子標(biāo)記

RAPD分子標(biāo)記以植物基因組DNA為模板，利用人工合成的隨機(jī)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過瓊脂糖凝膠或聚丙烯酰胺就凝膠電泳、染色劑染色之后就可以檢測(cè)產(chǎn)物的多態(tài)性[25]。該標(biāo)記方法廣泛用于物種親緣關(guān)系鑒定和遺傳進(jìn)化的研究。張榮等[26]用RAPD法分析了鐵線蓮屬7種中藥。結(jié)果表明RAPD法用于生藥鑒定是可行的。后來普春霞等[27]對(duì)云南省具有藥用價(jià)值的12種鐵線蓮進(jìn)行了RAPD分析，利用10個(gè)隨機(jī)引物對(duì)材料DNA擴(kuò)增得到89條多態(tài)性帶，發(fā)現(xiàn)條帶多態(tài)性百分比100%，不同種擴(kuò)增出的條帶差異明顯。遺傳聚類分析結(jié)果表明RAPD分子標(biāo)記技術(shù)可以用于鐵線蓮屬生藥鑒定，但是利用該標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行系統(tǒng)重建還有待進(jìn)一步研究。國錦琳等[28]不僅利用RAPD法篩選出5個(gè)多態(tài)性好的引物對(duì)10種川木通進(jìn)行擴(kuò)增，而且在此基礎(chǔ)上構(gòu)建了特征性序列擴(kuò)增區(qū)域（sequence characterized amplified region，SCAR）標(biāo)記，用于川木通藥材鑒定。Yuan等人[29]對(duì)從中國各地采集到的Clematis tubulosa，Clematis brevicaudata不同種群及其雜交后代進(jìn)行RAPD標(biāo)記和SNP分析后發(fā)現(xiàn)，C. brevicaudata種群遺傳背景一致，而C. tubulosa種群中檢測(cè)到較多變異，由這兩個(gè)親本（不管是正交還是反交）產(chǎn)生的雜交后代通過RAPD可聚類成為2支，且大多數(shù)為源于C. tubulosa的突變植株。

4.2 ISSR-PCR分子標(biāo)記

ISSR-PCR分子標(biāo)記技術(shù)是以錨定的串聯(lián)重復(fù)序列為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠或聚丙烯酰胺就凝膠電泳，經(jīng)過銀染或EB染色后對(duì)條帶進(jìn)行分析[30]。該方法廣泛應(yīng)用于種質(zhì)資源和物種親緣關(guān)系鑒定以及物種遺傳多樣性研究。孫正海等[31]運(yùn)用單因子試驗(yàn)和正交試驗(yàn)對(duì)滑葉藤ISSR-PCR反應(yīng)體系進(jìn)行了優(yōu)化，提出了滑葉藤ISSR-PCR的反應(yīng)中模板DNA、TaqDNA聚合酶、Primer濃度、dNTPs濃度及Mg2+濃度的最佳條件。此外，王楠等[32]采用單因子實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)鐵線蓮園藝品種‘Gravetye Beauty的ISSR-PCR反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化，并篩選出11條擴(kuò)增條帶清晰、多態(tài)性好的引物。Cires E等[33]利用ISSR和AFLP對(duì)伊比利亞半島西北部瀕危物種R.cabrerensis及其亞種進(jìn)行研究，分別擴(kuò)增出2830和103條條帶，發(fā)現(xiàn)多態(tài)性比率分別為97.57%和81.38%。方差分析（AMOVA）結(jié)果表明該種的遺傳變異主要來自于不同的地理群體內(nèi)部，不同地理群體之間的差異達(dá)到顯著水平。作者對(duì)R.cabrerensis的遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行一系列分析，還提出了對(duì)該種植物種質(zhì)資源的保護(hù)策略。

4.3 PCR-SSCP標(biāo)記

PCR-SSCP標(biāo)記技術(shù)是基于單鏈DNA不同構(gòu)象來檢測(cè)基因突變的方法。該方法利用特異引物對(duì)基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過變性劑和高溫處理DNA雙鏈解鏈形成具有某一空間構(gòu)象的單鏈DNA。經(jīng)過非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳、銀染顯色對(duì)電泳條帶進(jìn)行SSCP圖譜分析。根據(jù)條帶的不同位置顯示不同個(gè)體之間的DNA的特性[34]。該技術(shù)廣泛用于基因突變檢測(cè)和物種鑒定。安蕊利用PCR-SSCP譜帶分析技術(shù)對(duì)鐵線蓮屬3種基原植物進(jìn)行物種分類及鑒別。此外，還通過對(duì)比分析威靈仙藥材基原ITS序列，設(shè)計(jì)出能夠擴(kuò)增出特異鑒別位點(diǎn)的引物，也正是利用了PCR-SSCP技術(shù)的經(jīng)濟(jì)、高通量的特點(diǎn)[35]。

4.4 ITS序列分析

ITS序列片段由于長(zhǎng)度相對(duì)保守、信息位點(diǎn)豐富且屬、種間差異明顯的特點(diǎn)而多被用于藥材品種鑒定。蔣明等[36]對(duì)浙江境內(nèi)鐵線蓮屬的8種藥用植物進(jìn)行ITS序列對(duì)比。結(jié)果顯示了這8種鐵線蓮植物的ITS1和ITS2之間的長(zhǎng)度為534～561bp，變異位點(diǎn)及信息位點(diǎn)較為豐富，同時(shí)對(duì)其遺傳距離和親緣關(guān)系進(jìn)行了分析。李驍?shù)萚37]利用PCR法擴(kuò)增了鐵線蓮屬蒙藥材的rDNA-ITS序列，經(jīng)過序列的分析比對(duì)，從6種藥用植物中ITS序列中，篩選出變異位點(diǎn)57個(gè)，特異性鑒別位點(diǎn)33個(gè)，證明了ITS序列可以用于鑒別鐵線蓮屬藥用植物。鄭安勇[38]利用PCR技術(shù)擴(kuò)增出18份威靈仙藥材及混偽品的核基因ITS2序列，序列經(jīng)過測(cè)序、拼接及數(shù)據(jù)分析比對(duì)，發(fā)現(xiàn)正品與混偽品的二級(jí)結(jié)構(gòu)差異明顯，以核基因ITS2片段為DNA條形碼可以鑒定威靈仙藥材中的混偽品。同樣地，劉美子等[39]利用ITS2片段條形碼也可以鑒別川木通與混偽品及近緣種。由于ITS序列短，提供的性狀數(shù)量少，有學(xué)者將ITS序列分析與其它分析技術(shù)相結(jié)合探討鐵線蓮屬植物的遺傳進(jìn)化關(guān)系。如穆琳、謝磊利用槭葉鐵線蓮的ITS和3個(gè)葉綠體DNA片段，經(jīng)目的片段擴(kuò)增、基因測(cè)序之后構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果不支持將槭葉鐵線蓮與繡球藤組聚為一類，認(rèn)為槭葉鐵線蓮可能是北溫帶古老類群的孑遺[40]。

5 展望

目前，有關(guān)鐵線蓮屬植物研究中形態(tài)學(xué)標(biāo)記和細(xì)胞學(xué)標(biāo)記的應(yīng)用較為廣泛，但是形態(tài)學(xué)標(biāo)記是基于個(gè)體性狀的描述，易受外部環(huán)境因子的影響，依據(jù)形態(tài)進(jìn)行種群分類產(chǎn)生了很多爭(zhēng)議。而且細(xì)胞學(xué)標(biāo)記與傳統(tǒng)的形態(tài)標(biāo)記在鐵線蓮屬植物遺傳進(jìn)化關(guān)系的研究結(jié)果也有許多差異。遺傳標(biāo)記在本屬植物的研究中，生物化學(xué)標(biāo)記應(yīng)用未見報(bào)道。生物化學(xué)標(biāo)記可以反映同一基因產(chǎn)物蛋白的差異性，不易受環(huán)境因素影響，而且還具有經(jīng)濟(jì)、快速的特點(diǎn)。所以可以加強(qiáng)生物化學(xué)標(biāo)記技術(shù)在鐵線蓮屬植物研究中的應(yīng)用，填補(bǔ)生化標(biāo)記在鐵線蓮屬應(yīng)用的空白。此外，雖然DNA分子標(biāo)記在鐵線蓮屬的研究中已經(jīng)取得一定的成果，但是已應(yīng)用到的DNA分子標(biāo)記技術(shù)還較少。鐵線蓮屬植物已有幾百年的栽培歷史。尤其是是在歐洲，育種專家多以雜交育種的方式培育出很多栽培品種，這些栽培品種的遺傳背景十分復(fù)雜，品種分類有較多爭(zhēng)議，因此在今后的研究中可以將多種遺傳標(biāo)記手段相結(jié)合，從多方面入手加大鐵線蓮的基礎(chǔ)和應(yīng)用研究，健全鐵線蓮種質(zhì)資源的分類和評(píng)價(jià)體系，對(duì)鐵線蓮種質(zhì)遺傳多樣性的保護(hù)、開發(fā)利用及優(yōu)良品種的培育提供參考依據(jù)。

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