福壽螺在甲氨基阿維菌素影響下的酶活性研究

摘 要：本文主要研究甲氨基阿維菌素對(duì)福壽螺酶活性影響，以幾組對(duì)照試驗(yàn)分析甲氨基阿維菌素對(duì)福壽螺的作用機(jī)理及影響，旨在為研究福壽螺的防控措施及高效安全的殺螺劑提供依據(jù)及幫助。

關(guān)鍵詞：福壽螺；甲氨基阿維菌素；影響；酶活性

中圖分類號(hào)：S482.3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI：10.11974/nyyjs.20161233025

近幾十年來(lái)，福壽螺在我國(guó)多個(gè)省份迅速蔓延，嚴(yán)重的影響農(nóng)產(chǎn)品的質(zhì)量與產(chǎn)量，并且由于福壽螺是廣州管圓線蟲的寄宿主之一，一旦人類感染常會(huì)引起急性頭痛、發(fā)熱、四肢無(wú)力、皮膚過(guò)敏等癥狀，嚴(yán)重者可致癡呆或者死亡。

1 實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備

按標(biāo)準(zhǔn)參照傅先元的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，選取成螺個(gè)體重量為151.5g，在相同條件下進(jìn)行試驗(yàn)預(yù)處理，之后再分別進(jìn)行對(duì)照實(shí)驗(yàn)。

浸螺法進(jìn)行毒力測(cè)定：稱取一定量的90.2%甲氨基阿維菌素原藥，用丙酮溶解后配置成母液，加水稀釋，成螺的處理濃度為0.8、0.4、0.2、0.1、0.05mg/L，均設(shè)清水為對(duì)照處理，每個(gè)濃度重復(fù)3次。用小桶（8.75cm×8.75cm×16.5cm）盛500mL藥液和清水，每桶投螺15只。在25±1℃的恒溫室浸泡福壽螺，隔6h觀察福壽螺的行為，分別于24h、48h統(tǒng)計(jì)死亡情況，計(jì)算死亡率和校正死亡率。

酶液提?。翰捎媒莘椒▽?duì)成螺進(jìn)行毒力測(cè)定，用DPS 6.55軟件建立毒力回歸方程，并設(shè)置LC25、LC50、LC75 3個(gè)質(zhì)量濃度和空白對(duì)照，試驗(yàn)開始后，分別于6h、12h、24h、48h取樣?？焖俜Q取1 g肝臟置于研缽中，用剪刀剪碎，加入一定量的液氮后快速研磨，分別加入相應(yīng)的試劑檢測(cè)各種酶含量。

1.1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1.1 谷胱甘肽S一轉(zhuǎn)移酶（GSTs）活性測(cè)定

用移液槍依次加入4x10-3mol/L CDNB 50?L、13.33mmol/L GSH60?L、50?L酶液、0.06 mol/L pH7.0磷酸緩沖液90?L于96孔酶標(biāo)板中，總體積為250?L，反應(yīng)條件于26℃下，用酶標(biāo)儀在340nm波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光度值。每30 S讀數(shù)1次，共記錄15min內(nèi)OD值變化。對(duì)照孔中加入50?L磷酸緩沖液代替酶源液，其他參數(shù)一樣。GSTs單位定義：lmg組織中l(wèi)min催化分解1?mol底物為1個(gè)酶活力單位（U）。以反應(yīng)速度表示GSTs酶活性（OD/mg pr./min）。

1.1.2 乙酰膽堿酯酶（ACHE）活性測(cè)定

用移液槍準(zhǔn)確地移取150?L酶源上清液和50?L 0.1mol/LPH8.0的磷酸緩沖液于96孔酶標(biāo)板中，然后依次加入0.01 mol/L二硫代雙硝基苯甲酸（DTNB）溶液50?L、O.075 mol/L碘化硫代乙酰膽堿ATchI溶液50?L，在酶標(biāo)儀測(cè)定下405nm波長(zhǎng)測(cè)定其吸光度值。該反應(yīng)于26℃15min內(nèi)（30s為間隔）的OD值變化。以磷酸緩沖液作為空白對(duì)照，以反應(yīng)速度表示乙酰膽堿酯酶活性（OD/mg pr./min）。

1.1.3 超氧化物歧化酶（SOD）活性測(cè)定

鄰苯三酚自氧化速率測(cè)定：依次加入0.1mol/L Tfis.Hcl 4.5ml緩沖液、4.2 mL二次蒸餾水，對(duì)照管加入10 mmol/L0.3mLHcl，樣品管加入2.5mmol/L0.3mL鄰苯三酚，總體積為9mL。置于傾入光徑lcm比色杯中并計(jì)時(shí)，于325nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度值A(chǔ)0，30s讀數(shù)1次，共記錄5min內(nèi)的吸光度值，并以時(shí)間、吸光度值作坐標(biāo)圖，鄰苯三酚的自氧化速率AA0是用該線性方程的直線斜率表示。每次測(cè)定重復(fù)4次，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

此操作方法同上，但在加入鄰苯三酚之前，一定先加入300?L的酶源上清液。并減少加入二次蒸餾水確保蒸餾水一樣。迅速倒入1cm比色皿中，以0.01mol/L HCl緩沖液為參比，于325nnl波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，每隔0.5min 計(jì)數(shù)，連續(xù)測(cè)定5 min。鄰苯三酚自氧化速率測(cè)定用蒸餾水代替酶源上清液。每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次，記錄該曲線的斜率即為△ASOD.SOD酶活力單位定義為在25℃、pH 8.2時(shí)每1 min抑制鄰苯三酚自氧化速率達(dá)50%的酶量。

鄰苯三酚自氧化的抑制率定義為：

抑制率（E）=（△A0--△ASOD）/△A0×100%；

單位酶活力（U/mL）=（E×V1×N）/（50%×V2）；

SOD活力（U/mg）=單位活力/測(cè)定樣品濃度；

（E：鄰苯三酚自氧化的抑制率；V1：反應(yīng)液總體積；V2：測(cè)定樣品體積；N：樣品稀釋液的倍數(shù)）

酶活的抑制率（%）=[（對(duì)照組的酶活力一受試組的酶活力）/對(duì)照組的酶活力]×100。

1.1.4 酚氧化酶（PO）活性測(cè)定

采用磷酸鈉鹽緩沖體系，在2mL的測(cè)活體系（含0.1mol/LpH6.8的Na2HP04—NaH2P04緩沖液和8mmol/L鄰苯二酚中加入200?L酶源上清液，28℃檢測(cè)波長(zhǎng)為430nm處的吸光度值，并以時(shí)間、吸光度值作坐標(biāo)圖，酚氧化酶活力用所得的直線斜率來(lái)表示。在27℃時(shí)每l min增加吸光度值l?的酶量為PO酶活力單位（u）。PO酶量（U/g）通常以1g組織中所含的u的量來(lái)表示，每次測(cè)定重復(fù)3次，取平均值，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

1.1.5 過(guò)氧化氫酶（CAT）活性測(cè)定

在恒溫25℃條件下，將CAT酶提取液加H202-磷酸鹽緩沖液中，采用1cm比色皿在250nm波長(zhǎng)處每隔10 S測(cè)其吸光度數(shù)值。以常溫下100 S分解過(guò)氧化氫一半時(shí)的酶蛋白量作為過(guò)氧化氫酶活性單位。

2 甲氨基阿維菌素對(duì)福壽螺主要酶活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

處理12h內(nèi)，甲氨基阿維菌素低（LC25）、中（LC50）濃度對(duì)成螺肝臟內(nèi)GSTs和AChE酶活力均高于對(duì)照組，12h達(dá)到高峰后開始持續(xù)下降并在48h低于對(duì)照水平（P<0.01），除低濃度（LC25）組成螺肝臟AChE酶活力仍高于對(duì)照組水平。

甲氨基阿維菌素中、高濃度組對(duì)成螺肝臟PO酶活力在6h時(shí)達(dá)到最大值，之后逐漸下降，至48h時(shí)其極顯著低于對(duì)照組水平。

在不同藥劑濃度處理下，福壽螺肝臟CAT活性總體表現(xiàn)為上升—下降的趨勢(shì)。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，福壽螺肝臟內(nèi)CAT酶活力逐漸降低，在48h時(shí)下降至最低值，并與對(duì)照組差異顯著。

甲氨基阿維菌素低濃度（LC25）組的福壽螺肝臟SOD酶活力變化不大，其在長(zhǎng)時(shí)間（48h）的染毒下，較對(duì)照組仍差異不顯著：中（LC50）濃度組的福壽螺肝臟內(nèi)的酶活力在24h達(dá)到最大值，48h其酶活力才被顯著抑制；而高（LC75）濃度組的SOD酶活性比低（LC25、LC50）濃度組在更快的時(shí)間（6h）達(dá)到高峰，之后就開始持續(xù)下降并在24h時(shí)被極顯著抑制。因此，SOD的上升與下降反映了福壽螺抵抗甲氨基阿維菌素的能力。

3 結(jié)語(yǔ)

根據(jù)實(shí)驗(yàn)可以得出，在不同的處理時(shí)間（6、12、24、48h）內(nèi)，不同濃度的甲氨基阿維菌素對(duì)福壽螺的解毒酶、抗氧化酶等酶活性的影響程度不同。在脅迫期間，過(guò)氧化氫酶、超氧化物歧化酶等活力變化，是在一定的劑量范圍或者時(shí)間段內(nèi)體現(xiàn)出的劑量和時(shí)間效應(yīng)，酶活力受毒物劑量的影響，當(dāng)濃度較低時(shí)，毒物對(duì)代謝有一定的促進(jìn)作用，各濃度組福壽螺肝臟CAT酶、SOD酶、PO酶等活力均呈現(xiàn)先上升后下降的變化趨勢(shì)。

參考文獻(xiàn)

[1]黃秀枝，蔡璦安，尚戰(zhàn)峰，等.甲氨基阿維菌素脅迫下福壽螺肝臟抗氧化酶活性及顯微結(jié)構(gòu)的變化[J].江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2015（3）.

[2]劉曉漫.福壽螺不同地理種群抗藥性及其生理生化差異研究[D].廣西大學(xué)，2011.

[3]劉曉漫.福壽螺不同地理種群抗藥性及其生理生化差異研究[D].廣西大學(xué)，2011.

作者簡(jiǎn)介：陳琳（1984-），女，江西贛州，博士，講師，主要研究方向：生物技術(shù)。