水解酪素對(duì)藏系綿羊瘤胃液體外產(chǎn)氣及纖維素分解率的試驗(yàn)研究

田發(fā)益 ， 巴 平

(西藏農(nóng)牧學(xué)院生物技術(shù)中心 ， 西藏 林芝 860000)

水解酪素對(duì)藏系綿羊瘤胃液體外產(chǎn)氣及纖維素分解率的試驗(yàn)研究

田發(fā)益 ， 巴 平

(西藏農(nóng)牧學(xué)院生物技術(shù)中心 ， 西藏 林芝 860000)

反芻動(dòng)物瘤胃中生產(chǎn)甲烷和纖維素分解兩類(lèi)微生物對(duì)環(huán)境和家畜起著重要的作用。生產(chǎn)甲烷不僅消耗養(yǎng)分，同時(shí)也是溫室氣體的主要來(lái)源；纖維素分解菌提供反芻家畜主要的碳水化合物。提高纖維素分解菌的活力是本研究的重點(diǎn)之一，同時(shí)掌握對(duì)甲烷產(chǎn)氣菌的影響程度。通過(guò)瘤胃胃管抽取藏系綿羊的瘤胃液，采用體外產(chǎn)氣裝置進(jìn)行產(chǎn)氣量測(cè)定；通過(guò)瘤胃液中放置無(wú)紡織纖維袋以測(cè)定纖維素消失率；采用厭氧培養(yǎng)進(jìn)行瘤胃細(xì)菌菌落記數(shù)的方法進(jìn)行測(cè)定分析。結(jié)果表明，添加一定量的水解酪素后，體外產(chǎn)氣量增加22.35%，P=0.433，差異不顯著；對(duì)總纖維素25.8%的消失率進(jìn)行t檢驗(yàn)，試驗(yàn)組和對(duì)照組組間P=0.043，差異顯著，總纖維素消失率增加3.5%。試驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，添加水解酪素具有明顯提高纖維素分解菌的活力，負(fù)效應(yīng)是甲烷產(chǎn)氣量也適當(dāng)增加。

藏系綿羊 ； 瘤胃液 ； 體外產(chǎn)氣 ； 纖維素消化率 ； 水解酪素

牛羊瘤胃中的微生物不僅影響瘤胃發(fā)酵的效率，同時(shí)也是反芻家畜蛋白質(zhì)的來(lái)源之一。在瘤胃微生物中，82%的微生物可以利用氨作為惟一的氮源而合成蛋白，25%的微生物在沒(méi)有氨的狀態(tài)下不能生長(zhǎng)，56%的微生物既可以利用氨也可以利用氨基酸作為氮源而合成蛋白質(zhì)[1]。微生物對(duì)氨基酸的利用具有選擇性，部分氨基酸難以被細(xì)菌利用，而瘤胃微生物對(duì)某些氨基酸具有優(yōu)先選擇利用的可能性。

甲烷是最簡(jiǎn)單的有機(jī)物，牛羊噯氣排出的甲烷氣是重要的溫室氣體排放源之一。政府間氣候變化專(zhuān)門(mén)委員會(huì)(IPCC)第四次評(píng)估報(bào)告指出，甲烷已成為全球第二大溫室氣體[2]，反芻動(dòng)物瘤胃甲烷排放占自然界甲烷排放量的13%～19%[3]。

牛羊在西藏的經(jīng)濟(jì)生活中占有相當(dāng)重要的位置，據(jù)2015年統(tǒng)計(jì)，西藏2015年羊存欄數(shù)為1 190萬(wàn)頭(只)，其中綿羊存欄數(shù)為749萬(wàn)只，山羊存欄數(shù)為441萬(wàn)只[3]。由此可以估算，西藏反芻家畜每天喛氣產(chǎn)生的甲烷氣約為2.2×106m3/天。瘤胃在發(fā)酵過(guò)程中生成甲烷降低了消化能到代謝能的轉(zhuǎn)化率，能量損失占飼料總能的2%～15%。減少家畜體內(nèi)甲烷的生成不僅可以提高動(dòng)物的生產(chǎn)性能，而且對(duì)控制溫室效應(yīng)有一定作用。本試驗(yàn)的目的是使用混合的瘤胃細(xì)菌并在無(wú)氣源存在的條件下進(jìn)行體外培養(yǎng)發(fā)酵試驗(yàn)，確定不同的物質(zhì)在培養(yǎng)基里刺激瘤胃細(xì)菌生長(zhǎng)和產(chǎn)氣的效果。通過(guò)試驗(yàn)，選擇最佳的飼料配比，提高西藏反芻家畜的消化率。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 2015年8月，項(xiàng)目組選擇飼養(yǎng)的4只成年藏系綿羊，粗飼草為天然牧草，每只羊每天補(bǔ)飼0.2 Kg玉米粉(內(nèi)含0.1%的CaHPO4和適量的鹽)。1.2 取樣 瘤胃液的取樣采用瘤胃胃管法，胃管直徑1 cm的硅膠半透明管，取樣前胃管外壁涂石碏油，一端直插入羊瘤胃中，一端通入緩沖瓶底部中，緩沖瓶的上部再接入溶劑過(guò)濾器(WR-2001型，上海嘉鵬科技有限公司產(chǎn)品)的抽氣端，使緩沖瓶中形成負(fù)壓。如出現(xiàn)胃管堵塞，使用反沖法沖開(kāi)堵塞部位。每次瘤胃液的取樣不少于200 mL，之后裝滿于200 mL的三解瓶，使之排完所有空氣，密封蓋口(以防瘤胃微生物與O2氣長(zhǎng)時(shí)間接觸而死亡)，速送實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行測(cè)試分析。1.3 試驗(yàn)方法 采用體外人工唾液法，為了降低試驗(yàn)誤差，每只羊瘤胃液均采用試驗(yàn)組和對(duì)照組進(jìn)行比對(duì)，試驗(yàn)前用兩層紗布過(guò)慮瘤胃液，各取濾液50 mL，再加入50 mL配制人工唾液進(jìn)行試驗(yàn)。1.3.1 人工唾液配制 A液為過(guò)濾瘤胃液(用兩層紗布即可)。微量元素B溶液：每100 mL蒸餾水中溶解CaCl2·2H2O(13.2 g)、MnCl2·4H2O(10.0 g)、CoCl2·6H2O(1.0 g)、FeCl2·6H2O(0.8 g)。緩沖液(C)的配置：NaHCO3(35 g)、NH4HCO3(4 g)。調(diào)節(jié)pH值為7.0～7.3。常量元素(D)：Na2HPO4(5.7 g)、KH2PO4(6.2 g)、MgSO4(0.6 g)。刃天青溶液(E)：0.1%(100 mg刃天青加蒸餾水至100 mL)，厭氧指示劑，煮沸時(shí)有游離氧存在時(shí)為紅色，無(wú)氧時(shí)呈無(wú)色。還原劑溶液(F)：Na2S·9H2O(672 mg)。

瘤胃微生物培養(yǎng)液配置比例：Menke培養(yǎng)液：400 mL蒸餾水+0.1 mL溶液A+200 mL緩沖液+200 ml常量元素+1.0 ml刃天青溶液+40.0 ml還原劑溶液混勻?；旌吓囵B(yǎng)液∶瘤胃液=1∶1。1.3.2 無(wú)編織纖維袋法測(cè)定纖維素的消化率 試驗(yàn)組：每50 ml瘤胃液中添加一定量青稞秸稈(裝在特制無(wú)編織纖維素袋中，用于測(cè)定纖維素消化率)，放入瘤胃液中。試驗(yàn)組瘤胃液中加0.2 g水解酪素。對(duì)照組：青稞秸稈裝入特制無(wú)編織纖維素袋中，用于測(cè)定纖維素消化率。

1.3.3 體外產(chǎn)氣及消化試驗(yàn)設(shè)置 試驗(yàn)者發(fā)明的人工體外瘤胃液產(chǎn)氣裝置(專(zhuān)利號(hào)：ZL 2015 2 0838055.X)。

1.3.4 瘤胃細(xì)菌培養(yǎng)基 采用改良分離瘤胃細(xì)菌培養(yǎng)基[5]。

1.3.5 纖維含量的測(cè)定 采用范氏(Van soest)濾袋法測(cè)定無(wú)紡織袋中各分類(lèi)纖維素的含量。

2 結(jié)果

2.1 體外不同時(shí)間、不同添加劑產(chǎn)氣量對(duì)照試驗(yàn) 試驗(yàn)過(guò)程中，準(zhǔn)確記錄時(shí)間，每隔2 h記錄一次產(chǎn)氣量，直至完整記錄24 h。24 h后從人工瘤胃液中取出無(wú)紡織纖維袋，37 ℃水溫搓洗3～4次，再用無(wú)水丙酮搓洗2～3次，用來(lái)測(cè)定青稞秸稈消失率及其他剩余NDF、ADF、ADL等纖維素的消失率。產(chǎn)氣結(jié)果見(jiàn)表1、圖1、圖2。

表1 添加水解酪素對(duì)體外瘤胃液產(chǎn)氣累積量的影響 (mL/50 mL)

圖1 添加水解酪素對(duì)體外瘤胃液?jiǎn)挝粫r(shí)內(nèi)產(chǎn)氣量的影響(mL/50 mL·2 h)

圖2 添加水解酪素對(duì)體外瘤胃液累積產(chǎn)氣量的影響(mL/50 mL·2 h)

羊的瘤胃體積約20 L左右，每天產(chǎn)氣約50 L，即2.4 L甲烷氣/天·L瘤胃液。對(duì)表1中數(shù)據(jù)采用兩組樣本均數(shù)比較的(組內(nèi)和組間)t檢驗(yàn)(SPSS 23)，對(duì)照組組內(nèi)P=0.638，差異不顯著；試驗(yàn)組組內(nèi)P=0.680，差異不顯著；試驗(yàn)組和對(duì)照組組間P=0.433，差異不顯著。瘤胃中產(chǎn)甲烷微生物與其他微生物之間存在相互依存和共生的關(guān)系，盡管試驗(yàn)組與對(duì)照組差異不顯著，但添加水解酪素后，產(chǎn)氣量明顯增加，通過(guò)瘤胃細(xì)菌培養(yǎng)基進(jìn)行48 h培養(yǎng)，可見(jiàn)菌落總數(shù)對(duì)照組為1.43 CFU±0.16×106，試驗(yàn)組為1.57CFU±0.35×106，根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果計(jì)算，產(chǎn)氣量每增加1倍，細(xì)菌總數(shù)增加0.4倍。試驗(yàn)組甲烷產(chǎn)氣量增加22.35%，說(shuō)明水解酪素對(duì)甲烷生成菌的活力具有一定的促進(jìn)作用2.2 水解酪素體外人工唾液法對(duì)纖維素消化率的影響 纖維素分解采用西藏常見(jiàn)青稞秸稈，也是西藏農(nóng)牧區(qū)常用的家畜粗飼草。盡管產(chǎn)氣量與纖維素的消化率沒(méi)有直接關(guān)系，但試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，甲烷產(chǎn)氣菌活性的增加，也對(duì)纖維素分解菌的活力具有一定的促進(jìn)作用，可提高纖維素的分解效率，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 體外瘤胃液添加水解酪素對(duì)纖維素消化率的試驗(yàn)

對(duì)試驗(yàn)組和對(duì)照組組間剩余各纖維含量通過(guò)兩組樣本均數(shù)的t檢驗(yàn)，P=0.936，差異不顯著；但對(duì)總纖維素25.8%的消失率進(jìn)行t檢驗(yàn)，試驗(yàn)組和對(duì)照組組間P=0.043，差異顯著。添加水解酪素的試驗(yàn)組對(duì)纖維素的分解率提高了3.5%，而增加的這部分纖維素以中性洗滌纖維為主，達(dá)3.5%。這一結(jié)果說(shuō)明，添加水解酪素對(duì)反芻動(dòng)物纖維素分解菌的活力和增殖具有一定的促進(jìn)作用。

3 討論

本試驗(yàn)通過(guò)體外瘤胃液添加水解酪素，可提高纖維素分解菌及產(chǎn)甲烷菌的增殖和活力，較顯著地提高纖維素的分解。

3.1 體外人工唾液產(chǎn)氣量的分析 目前，已對(duì)21個(gè)屬的70種產(chǎn)甲烷菌已經(jīng)從厭氧環(huán)境中分離鑒定，但是到目前為止，只有7種瘤胃產(chǎn)甲烷菌被分離純化[6-7]。在反當(dāng)動(dòng)物瘤胃內(nèi)，產(chǎn)甲烷菌主要依靠氫營(yíng)養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌通過(guò)氧化H2，還原C02生成CH4。瘤胃中82%的甲烷由H2和CO2的還原反應(yīng)生成[8]。瘤胃產(chǎn)甲烷菌游離在瘤胃內(nèi)或與瘤胃原蟲(chóng)形成共生體[9]，同時(shí)產(chǎn)甲烷菌還與真菌形成共生體[10]。研究表明，產(chǎn)甲烷菌的數(shù)量和活性也受日糧的影響，飼喂高精料日糧的羊和牛的瘤胃液中分別含有產(chǎn)甲烷菌107/g～108個(gè)/g和108/g～109個(gè)/g，放牧的羊和牛的瘤胃液中含有產(chǎn)甲烷菌109/g～1010個(gè)/g[11]，同時(shí)放牧動(dòng)物的產(chǎn)甲烷菌多樣性高于圏養(yǎng)的反芻動(dòng)物。抑制甲烷產(chǎn)氣菌，提高纖維素分解菌的活力是畜牧業(yè)研究的理想，但瘤胃菌群之間的相互依存關(guān)系特別復(fù)雜，到目前為止還沒(méi)有取得好的應(yīng)用成果。

酪蛋白水解后(水解酪素)，富含21種氨基酸，氨基酸種類(lèi)齊全。一般情況下，飼草中部分氨基酸含量缺乏和不足是正常現(xiàn)象。通過(guò)添加適量的混合氨基酸，可激活或增強(qiáng)瘤胃內(nèi)各類(lèi)微生物的活性及增殖能力。在試驗(yàn)中，幾種氨基酸組合，不能有效地刺激瘤胃細(xì)菌的生長(zhǎng)，只有添加混合氨基酸才能明顯地促進(jìn)瘤胃細(xì)菌的生長(zhǎng)，甲烷產(chǎn)氣量明顯增加，增加量為22.35%。

3.2 體外人工唾液纖維素消失率的分析 添加水解酪素有利于提高瘤胃中纖維素利用菌的活性。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，可提高纖維素3.5119%的分解力，體外瘤胃液中菌落總數(shù)也相應(yīng)增加了0.4倍。試驗(yàn)說(shuō)明瘤胃內(nèi)纖維素分解菌主要以分解半纖維素和部分纖維素為主，試驗(yàn)組NDF消失率提高了3.5%。

反芻家畜瘤胃中的微環(huán)境是一長(zhǎng)期進(jìn)化，各微生物之間相互協(xié)同利用，又相互制約的動(dòng)態(tài)環(huán)境。研究結(jié)果說(shuō)明，添加水解酪素有利于瘤胃微生物的增殖，提高飼草纖維素的分解效率。

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Research on Cellulose-decomposing andMethanogenesisin Vitro within Rumen Fluid of Tibetan Sheep by AddedHydrolyzedCasein

TIAN Fa-yi, BA Ping

(Biology and Technique center of Tibet Agriculture and Animal Husbandry College , Nyingchi 860000 ， China)

Two kinds of microorganisms play an important in cellulose-decomposing and on rumen fermentation andmethanogenesisfor animals and environment.The reaction process of methane gas is not only nutrients consuming but also the primary source of greenhouse gases.The main carbohydrate of rumens is provided by cellulose decomposition bacteria.One key point of this paper is to study the activity of cellulose decomposition bacteria.The methane gas productioninvitrowas measured by the gas device in rumens fluid extracted from Tibetan sheep through a rumen tube.The disappearance rate of cellulose was analyzed by no textile fiber bags within rumen fluid,the bacterial colony within rumen fluid was counted by anaerobic culture.The results showed that the methane gas production had increased 22.35% with addition of a certain amount of hydrolyzed casein,Differences were no significant before and after the added hydrolyzed casein (p=0.433),and the total disappearance rate of cellulose was 25.8% a significant 3.5% increase(p=0.043).The results prove that addition of hydrolyzed casein enhances the vitality of cellulose-decomposing.However,the methane gas production is also increased.

Tibet sheep ; Rumen fluid ;Methanogenesisin Vitro ; Disappearance rate of cellulose ;Hydrolyzedcasein

2016-05-04

國(guó)家自然科學(xué)基金(31360557)

田發(fā)益(1967-)，男，教授，碩士，主要研究西藏動(dòng)物生產(chǎn)和植物活性成分等工作，E-mail:xztfy@163.com

S816.79

A

0529-6005(2017)03-0047-03