傳染性造血器官壞死病病毒(IHNV)分離株病原學(xué)研究及全基因組序列分析

焦 雪 , 吉尚雷 , 張培軍 , 冷東澤 , 茆安亭 , 李月紅

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院, 吉林長(zhǎng)春130118; 2.吉林省衛(wèi)生檢測(cè)檢驗(yàn)中心, 吉林長(zhǎng)春130118)

傳染性造血器官壞死病病毒(IHNV)分離株病原學(xué)研究及全基因組序列分析

焦 雪1, 吉尚雷1, 張培軍2, 冷東澤1, 茆安亭1, 李月紅1

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院, 吉林長(zhǎng)春130118; 2.吉林省衛(wèi)生檢測(cè)檢驗(yàn)中心, 吉林長(zhǎng)春130118)

為初步了解東北地區(qū)某虹鱒養(yǎng)殖場(chǎng)的一株傳染性造血器官壞死病病毒株的病原學(xué)特征，將該病毒株進(jìn)行虹鱒魚苗人工回接感染試驗(yàn)。結(jié)果顯示，一周內(nèi)人工感染試驗(yàn)魚均出現(xiàn)明顯的臨床癥狀。將病死虹鱒魚苗研磨過(guò)濾除菌后接種到胖頭魚肌肉細(xì)胞系(FHM)，出現(xiàn)了特征性病變(CPE)，用傳染性造血器官壞死病病毒(IHNV)4組水生動(dòng)物病毒的6對(duì)特異性引物對(duì)該毒株進(jìn)行race-PCR，擴(kuò)增其全長(zhǎng)。結(jié)果顯示，該病毒基因組全長(zhǎng)為11 132 nt，基因組序列中4種核苷酸G、A、T、C含量分別為24.28%、28.67%、19.46%、27.59%。將序列與多株GenBank中已發(fā)表的IHNV毒株相應(yīng)基因進(jìn)行比較。結(jié)果顯示，分離株G基因與韓國(guó)株ChYa07和PcKw11同源性較高，分別為97.8%和97.5%，其進(jìn)化樹分析結(jié)果顯示，CJ-13株與韓國(guó)株和日本株在遺傳進(jìn)化關(guān)系上較近。

傳染性造血器官壞死病病毒(IHNV) ； 流行病原學(xué) ； 全序列

傳染性造血器官壞死病(infectious haematopoietic necrosis,IHN)可引起虹鱒魚和鮭魚全身性、致病性的急性傳染病[1]。20世紀(jì)中期，美國(guó)首先發(fā)現(xiàn)了IHNV，不久，歐洲地區(qū)一些臨近的國(guó)家相繼發(fā)現(xiàn)，20世紀(jì)70年代末，IHNV由北美洲傳到太平洋西北的日本北海道附近，1985-1995年，該病進(jìn)入中國(guó)東北境內(nèi)[2]。1992年，德國(guó)科學(xué)家從虹鱒魚體內(nèi)分離出IHNV；2006年，劉葒[3]在患病虹鱒魚等病魚的魚卵中檢測(cè)出IHNV。

傳染性造血器官壞死病病毒為諾克拉彈狀病毒屬[4]，病毒粒子是單股負(fù)鏈線狀單鏈RNA，其基因組成部分由3′-5′端依次是前導(dǎo)區(qū)、結(jié)構(gòu)蛋白基因區(qū)與各基因之間的連接區(qū)以及5′端不轉(zhuǎn)錄的拖尾序列。排列方式為3′-N-P-M-G-NV-L-5′。根據(jù)地理區(qū)域可分U基因型、L基因型、M基因型3種毒株，M基因組比U和L基因組的基因多樣性更高[5]。

2014年，吉林省延邊自治州部分冷水魚場(chǎng)的虹鱒魚苗疑似被IHNV感染患病，將部分魚苗分離到的病毒毒株進(jìn)行虹鱒魚苗回歸感染試驗(yàn)，以及病毒滴度測(cè)定試驗(yàn)，確定IHNV為病魚死亡的主要病原，明確其致病性；并對(duì)病毒株進(jìn)行全基因組測(cè)序，與IHNV其他株親緣關(guān)系進(jìn)行了初步分析，確定其與其他區(qū)域病毒之間的進(jìn)化關(guān)系，并將主要蛋白序列進(jìn)行同源性分析，掌握該分離株的遺傳背景，旨在研究新分離毒株的傳播途徑，為中國(guó)東北地區(qū)傳染性造血器官壞死病的預(yù)防檢測(cè)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 病死魚取自吉林省延邊自治州青龍漁場(chǎng)的虹鱒魚苗，體長(zhǎng)1.5～3.5 cm；胖頭魚肌肉細(xì)胞系(FHM)由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑 M199培養(yǎng)基由實(shí)驗(yàn)室自行保存，特級(jí)胎牛血清，購(gòu)自Gibco公司；cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、膠回收純化試劑盒、EXTaqDNA、NotI、XhoI和EcoRI，購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；TRIZol聚合酶，購(gòu)自Invitrogen公司；質(zhì)粒DNA小量試劑盒，購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。

1.3 病毒分離 取2 cm大小的虹鱒魚苗剪碎并磨成粉末，加入3 mL M199培養(yǎng)基于1.5 mL離心管中離心15 min(7 000 r/min 4 ℃)，吸取上清并用濾膜過(guò)濾，然后進(jìn)行1∶10、1∶50、1∶100稀釋，抽取50 μL上清加入FHM單層細(xì)胞中，置于15 ℃培養(yǎng)1周。1.4 病毒滴度測(cè)定 病毒懸液按照10-1-10-10做10倍稀釋，接種于長(zhǎng)滿FHM單層96孔板中。每個(gè)稀釋度進(jìn)行8孔重復(fù)，15 ℃吸附1 h候加入新鮮的M199培養(yǎng)基15 ℃下培養(yǎng)。陽(yáng)性對(duì)照為未稀釋的細(xì)胞毒，陰性對(duì)照為正常細(xì)胞，7 d內(nèi)觀察CPE，TCID50效價(jià)計(jì)算采用Karber法，即LgTCID50=L-D(S-0.5)，L為最高稀釋度的對(duì)數(shù)，D為稀釋度對(duì)數(shù)之差，S為陽(yáng)性孔比率總和。

1.5 IHNV全基因組擴(kuò)增 根據(jù)GenBank中登錄的IHNV全基因組序列WRAC株(NC_001652.1)設(shè)計(jì)了6對(duì)相互重疊片段的引物，采用50 μL的PCR反應(yīng)體系：cDNA產(chǎn)物3 μL，10×Taq酶Buffer 5 μL，dNTP Mixture(10 mmol/L each)2 μL，Mg2+(50mmol/L)2 μL，上下游引物(40 μmol/L)各2 μL，0.5 μLTaqDNA polymerase(invitrogen)，補(bǔ)ddH2O至50 μL。PCR 反應(yīng)條件為：首先94 ℃預(yù)變性5 min，再94 ℃變性4 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸8 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行結(jié)果判定。3′末端測(cè)序采用RACE法，通過(guò)引物Oligo(dT)將mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以該cDNA為模板，以IHNV特異性引物3′RACE GSP和Oligo(dT)為引物進(jìn)行PCR，擴(kuò)增3′末端區(qū)的基因組。5′末端的基因組序列按照RACE試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增，引物序列見(jiàn)表1。

表1 擴(kuò)增IHNV全序列的引物

1.6 序列及同源性分析 目的片段連接載體后轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒酶切驗(yàn)證，將酶切正確的菌液進(jìn)行測(cè)序，每個(gè)測(cè)序的陽(yáng)性質(zhì)粒都設(shè)3個(gè)平行組，以保證測(cè)序結(jié)果的正確性。將獲得的DNA序列結(jié)果利用DNAStar軟件進(jìn)行同源性比對(duì)，利用 MEGA5.2 分析遺傳進(jìn)化關(guān)系構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。所參考的毒株以及登錄號(hào)為：220-90株(GQ413939.1)，carson-89株(AY442508.1)，HO-7株(AY442512.1)，HV7601株(AB231658.1)，LWS-87株(AY442515.1)，RB-76株(AY442516.1)，SRCV株(AY442517.1)，WRAC株(AY442518.1。1.7 動(dòng)物回歸試驗(yàn) 選取體重約為50 g的健康虹鱒魚70尾，平均分成2組飼養(yǎng)3周。將病毒液(TCID50效價(jià)為10-5.47/0.1 mL)通過(guò)腹腔注射途徑接種到無(wú)任何病癥的健康魚體內(nèi)，每尾0.3 mL，一共25尾，水溫保持在8 ℃～12 ℃；未接種的健康魚為對(duì)照組，連續(xù)觀察30 d。

2 結(jié)果

2.1 病毒分離 按照1∶10、1∶50、1∶100的比例稀釋的病料組織勻漿上清依次接種到FHM細(xì)胞后的第2天、第4天和第7天細(xì)胞收縮變圓，出現(xiàn)明顯的空斑，最后大部分細(xì)胞崩解、脫落。而未接毒的對(duì)照組細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好(圖1)。

圖1 正常的FHM細(xì)胞和接種后出現(xiàn)EPC的FHM細(xì)胞(100×)

2.2 病毒滴定測(cè)定結(jié)果 病毒懸液按照10-1-10-10連續(xù)10倍稀釋后接種在單層的FHM細(xì)胞中，采用Karber法計(jì)算出第二代細(xì)胞培養(yǎng)物的TCID50效價(jià)為10-5.47/0.1 mL。2.3 IHNV全基因組擴(kuò)增 通過(guò)對(duì)RT-PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化，利用設(shè)計(jì)的6對(duì)特異性引物，擴(kuò)增出了覆蓋IHNV CJ-13株全基因組6個(gè)片段。擴(kuò)增后的產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)均為單一條帶，且各擴(kuò)增片段大小與預(yù)期值一致(圖2)。

圖2 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

M：250 bp DNA Ladder；1～6分別為IHNV引物1、2、3、4、5、6

2.4 IHNV全基因序列測(cè)定 將RT-PCR擴(kuò)增的各個(gè)基因片段分別連接于pGEM-T Easy 載體，各基因片段分別篩選3個(gè)平行陽(yáng)性重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)得的各段基因序列用DNAStar 軟件進(jìn)行拼接校正后獲得IHNV全基因序列。該病毒基因組全長(zhǎng)為 11 132 nt，基因組序列中4種核苷酸G、A、T、C含量分別為24.28%、28.67%、19.46%、27.59%。對(duì)IHNV CJ-13株的基因結(jié)構(gòu)特點(diǎn)進(jìn)行了分析和預(yù)測(cè)了蛋白表達(dá)量(表2)。與其他彈狀病毒一樣，分離株包含6個(gè)基因編碼的蛋白序列，排列方式為3′—N—P—M—G—NV—L—5′。首先是由不能被翻譯的前導(dǎo)區(qū)，然后依次是核衣殼蛋白(N登錄號(hào)：KR269772)、與聚合酶相關(guān)的磷酸蛋白(P登錄號(hào)：KR269773)、基質(zhì)蛋白(M登錄號(hào)：KR363256)、糖蛋白(G登錄號(hào)：KR537869)、獨(dú)特的非病毒結(jié)構(gòu)蛋白(NV登錄號(hào)：KR814487)及病毒聚合酶蛋白(L登錄號(hào)：KR814488)，最后是5′端的尾隨序列。各基因之間的連接區(qū)將結(jié)構(gòu)蛋白基因分離。

2.5 IHNV核蛋白G基因序列分析 與VHSV兩種病毒的N基因極為相似，所以針對(duì)N基因設(shè)計(jì)引物進(jìn)行RT-PCR難以區(qū)分兩種病毒，一般區(qū)分 IHNV 都以G基因進(jìn)行區(qū)分，因?yàn)镮HNV病毒G基因序列變異系數(shù)較小[6-7]，將分離株G基因與多株IHNV參考株進(jìn)行核苷酸同源性比較并做系統(tǒng)發(fā)育樹分析，可見(jiàn)分離株G基因與韓國(guó)株ChYa07和PcKw11同源性較高，分別為97.8%和97.5%，其推導(dǎo)的氨基酸序列同源性為97.5%和98.2%。與其他參考株核苷酸同源性為94.8%～96.7%，推導(dǎo)出的氨基酸同源性為94.5%～95.8%。從G基因的進(jìn)化樹上看，分離株G基因與韓國(guó)分離的2株相對(duì)較近，表明亞洲分離株與美國(guó)分離株、歐洲分離株進(jìn)化關(guān)系較遠(yuǎn)，明顯不在同一個(gè)進(jìn)化分支上。

3 討論

目前，傳染性造血器官壞死病病毒細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)依然是水生動(dòng)物病毒診斷的重要手段，本研究將處理過(guò)的疑似病料接種到敏感細(xì)胞系FHM中，通過(guò)觀察典型的CPE和電鏡檢測(cè)病毒形態(tài)初步確定為IHNV，采用race-PCR方法，成功擴(kuò)增出IHNV全基因組序列。

表2 IHNV CJ-13株的基因結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及蛋白表達(dá)

通過(guò)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，其結(jié)果顯示，IHNV基因包含6個(gè)ORF，分別為核衣殼蛋白(N)、磷蛋白(P)、基質(zhì)蛋白(M)、糖蛋白(G)、獨(dú)特的非病毒結(jié)構(gòu)蛋白(NV)及病毒聚合酶蛋白(L)。G蛋白是傳染性造血器官壞死病病毒編碼抗原決定簇的主要蛋白,能刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，同時(shí)也是個(gè)很好的檢測(cè)抗原。G蛋白的N端具有一段疏水性的信號(hào)肽,在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中被切除后成為成熟的G蛋白，所有彈狀病毒G蛋白都屬于單一的I型跨膜糖蛋白，由約500個(gè)氨基酸組成。不同屬的彈狀蛋白其G蛋白的氨基酸同源性很低，但在結(jié)構(gòu)組成上較為保守，都含有一個(gè)疏水的信號(hào)肽、兩個(gè)糖基化位點(diǎn)、兩個(gè)乙酞化位點(diǎn)和一個(gè)疏水的細(xì)胞質(zhì)尾。本研究中分離株的G蛋白基因序列總長(zhǎng)1 527 bp，包含G蛋白的全長(zhǎng)基因，編碼508個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)表達(dá)蛋白量為56 kDa。

我們發(fā)現(xiàn)，在細(xì)胞接種病料時(shí)，剛被處死的活魚和保存于液氮數(shù)日的病魚組織均可以使得敏感細(xì)胞FHM出現(xiàn)特征性病變。所以溫度是影響IHNV感染發(fā)病的重要因素之一[8-9]，水溫在8 ℃～10 ℃時(shí)發(fā)病率最高，水溫超過(guò)15 ℃時(shí)可使發(fā)病停止。飼養(yǎng)魚苗時(shí)，我們給部分正常魚苗更換冷水后在3～8 h內(nèi)80%魚苗出現(xiàn)了臨床癥狀，12小時(shí)內(nèi)死亡率達(dá)到了100%。另外，魚的大小是另一個(gè)重要的影響因素，2月齡以下的魚苗死亡率可達(dá)100%，7月齡以上的一般僅有10%左右的死亡率[10]。

研究人員等[11]對(duì)日本、法國(guó)、意大利及美國(guó)等地區(qū)的323個(gè)IHNV 株G基因序進(jìn)行分析，結(jié)果表明，核苷酸的最大變異系數(shù)是8.6%，系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果表明，北美株形成個(gè)基因型(U、M 和L)，分布于3個(gè)不同的地理區(qū)域，M基因型中最大的核苷酸變異為7.6%，是U和L基因型最大變異系數(shù)的2倍多，法國(guó)和意大利株屬于M基因型，日本株屬于U基因型。在本研究中，核苷酸同源性比對(duì)顯示，CJ-13株G基因與韓國(guó)株和日本株同源性最高。從結(jié)構(gòu)基因系統(tǒng)發(fā)育樹可以看出CJ-13株與韓國(guó)和日本分離株的IHNV為同一進(jìn)化分支。因此預(yù)測(cè)CJ-13株屬于U基因型，可能由韓國(guó)株或者日本株變異而來(lái)。

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Etiology and whole genome sequence analysis of Infectious hematopoietic necrosis disease virus(IHNV)isolates from epidemic

JIAO Xue1, JI Shang-lei1, ZHANG Pei-jun2, LENG Dong-ze1, MAO An-ting1, LI Yue-hong1

(1.Jilin Agriculture University, College of animal science and technology, Changchun 130118，China 2.Jilin provincial health inspection and Testing Center, Changchun 130118，China)

In order to have a preliminary understanding the pathogenic characteristics of a rainbow trout aquaculture field strain of infectious hematopoietic organ necrosis virus in northeast area,the strains of rainbow trout fry artificial back after experimental infection.The resμlts showed that there were obvious clinical symptoms in the experiment of artificial infection in one week.The mortality of rainbow trout fry polishing filtration sterilization after inocμlation to pantouyu muscle cell line(FHM),the characteristic cytopathic effect(CPE),with six pairs of specific primers of infectious hematopoietic organ necrosis virus(IHNV)4 groups of aquatic animal viruses to the strains of race-PCR,amplifying the fμll-length.The resμlts showed that the total length of the viral genome was 11132 NT,and the contents of 4 nucleotides G,A,C and T were 24.28%,28.67%,19.46%,27.59%,,,respectively.Comparison of the corresponding genes of IHNV strains published in GenBank with mμltiple strains.The resμlts showed that the G gene of the isolates was higher than that of ChYa07 and PcKw11 in South Korea,97.8% and 97.5%,respectively.The resμlts showed that the CJ-13 strain was relatively close to the South Korean and the Japanese strains.

Infectious Hematopoietic Necrosis Virus; Epidemic etiology; complete sequence Corresponding author：LI Yue-hong

2016-06-15

國(guó)家自然科學(xué)基金(30972191)；吉林省留學(xué)人員創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)項(xiàng)目(201523)；長(zhǎng)春市農(nóng)業(yè)先進(jìn)實(shí)用技術(shù)的示范推廣項(xiàng)目(20130215)；農(nóng)業(yè)部948項(xiàng)目(2014Z34)

焦雪(1992- )，女，研究生，主要從事動(dòng)物疾病及免疫研究，E-mail:455261939@qq.com

李月紅，E-mail:liyhong@sina.com

S855.3

A

0529-6005(2017)03-0039-04