馬鏈球菌獸疫亞種PGK蛋白的免疫保護試驗

付 強， 羅惠娜， 王愛富， 李桂珍， 馬春全

(佛山科學技術學院 ， 廣東佛山528231)

馬鏈球菌獸疫亞種PGK蛋白的免疫保護試驗

付 強， 羅惠娜， 王愛富， 李桂珍， 馬春全

(佛山科學技術學院 ， 廣東佛山528231)

為了闡明馬鏈球菌獸疫亞種(SEZ)PGK蛋白的免疫保護作用，使該菌引起豬、馬、牛等多種動物的鏈球菌病得到有效控制，本試驗構建PGK重組表達載體，純化重組蛋白，對其免疫效力進行系統(tǒng)評價。結果表明：PGK蛋白可以誘導高滴度的血清IgG抗體，并且可提供一定的免疫保護效力；Real-time PCR技術分析表明，PGK是一個重要的體內誘導抗原；并且可誘導高水平的Th1和Th2型免疫應答，揭示PGK在SEZ治病過程中起到重要作用，為新型疫苗的研制奠定了基礎。

SEZ ； PGK ； 抗原 ； 新型疫苗 ； 致病機制

馬鏈球菌獸疫亞種 (Streptococcusequissp.zooepidemicus, SEZ) 屬于乳桿菌目、鏈球菌科、鏈球菌屬，能引起豬、馬、奶牛等多種動物發(fā)病，在我國主要引起豬鏈球菌病[1-3]。豬鏈球菌病是危害養(yǎng)豬業(yè)的重要細菌性疾病，嚴重危害我國乃至世界養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展。

現(xiàn)有的研究對SEZ的毒力因子和保護抗原缺乏全面的了解，因此現(xiàn)階段控制SEZ感染仍然存在很多困難，近期一些SEZ菌株的基因組測序結果讓我們對該菌的發(fā)病機制有了新的見解，有利于我們進行SEZ疫苗的研發(fā)。PGK與肺炎鏈球菌的保護性抗原具有一定的同源性[4-5]，可能是SEZ新型疫苗的候選抗原，本試驗通過克隆表達PGK蛋白，探討該重組蛋白在SEZ致病過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 菌種和質粒 馬鏈球菌獸疫亞種C55138株，購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；大腸桿菌基因工程菌株DH5α、大腸桿菌BL21、表達質粒pET-32a (+)均由廣東省高校重點實驗室保存。

1.2 主要試劑 RNA抽提試劑TRIZol，購自Invitrogen公司；DNase Ⅰ,購自Promega公司；Taq酶、限制性內切酶BamH Ⅰ和SalⅠ、T4連接酶、DNA Marker、反轉錄試劑盒及熒光定量PCR相關試劑，購自寶生物工程(大連)有限公司；UNIQ-10 柱式離心式DNA凝膠回收試劑盒，購自上海生工生物工程技術服務有限公司。

1.3 SYBR Green Ⅰ實時定量PCR 培養(yǎng)至對數(shù)生長期的SEZ作為體外培養(yǎng)細菌，感染小鼠體內細菌的富集方法按照Fu等描述的方法進行[6]。使用TRIZol試劑提取體內富集細菌和體外培養(yǎng)細菌的RNA，以Dnase Ⅰ去除DNA，反轉錄試劑盒進行反轉錄。以回收的PGK和16S rRNA擴增產物作為標準品，測定其濃度并換算至拷貝數(shù)/μL。對標準品做10倍梯度稀釋，以其作為模板繪制標準曲線。PCR反應體系：上、下游引物各 0.5 μL，10×SYBR Green Real-time PCR Master Mix 12.5 μL，雙蒸水 11 μL，cDNA 樣品 0.5 μL。每個樣品做3個重復。PCR擴增條件：95 ℃預變性 30 s；95 ℃，5 s； 55 ℃，30 s，共40個循環(huán)。反應過程中的熒光信號由LightCycler 480實時熒光定量PCR儀檢測[7-8]。

1.4 PGK基因的擴增 按NCBI報道的蛋白基因序列，通過分析序列獲取抗原性較好的片段，利用Primer 5.0軟件自行設計引物, 兩端分別添加BamH 和SalI酶切位點及保護性堿基。P1：5′-TCGGATCCGTTGACTTTA-3′；P2：5′-CCTCCACCGTCGACTGAC-3′。引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。以CTAB法提取的SEZ基因組作為PCR模板，按下列順序配制反應試劑。2.5 μL的10×Buffer，2.5 μL MgCl2，2.5 μL dNTP Mixtrue，10 μmol/L引物各0.5 μL，0.1μL的TaqDNA 聚合酶，2 μL DNA模板，加雙蒸水至25 μL。擴增程序：95 ℃, 5 min； 95 ℃, 30 s；55 ℃, 30 s；72 ℃, 1 min；共30個循環(huán)，72 ℃再延伸5 min。

1.5 PCR產物的酶切、純化和克隆 用BamH+SalI同時酶切PCR擴增的產物及pET-32a (+)，回收PCR片段以及載體片段。將回收 PCR片斷與 pET-32a(+)連接，轉化BL21感受態(tài)細胞。

1.6 重組質粒的誘導表達及純化 將表達菌株接種于添加氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基，于37 ℃搖床培養(yǎng)。取100 μL菌液接種于含氨芐青霉素的新鮮LB液體培養(yǎng)基中，于37 ℃培養(yǎng)，至OD600值達到0.6～1.0時，添加IPTG至終濃度為0.8 mmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)3 h后收集菌體。利用填裝有Ni-NTA 樹脂(Qiagen GmbH, Germany)的蛋白純化層析柱純化重組蛋白PGK。

1.7 小鼠的免疫保護性試驗 將成功表達并純化的重組蛋白PGK與Marcol52佐劑乳化后作為疫苗，濃度為 200 μg/mL，設置佐劑對照(即用生理鹽水與等量佐劑乳化制備)和空白對照(只注射生理鹽水)。4周齡的雌性BALB/c小鼠(約18 g)每組10只，免疫方法如下：首免腹腔注射佐劑乳化的抗原0.5 mL，2周后腹腔免疫佐劑乳化的抗原 0.5 mL。二免10 d后采血測效價。剩余小鼠用于保護力試驗，分別接種相同劑量的C55138(2×105CFU)，連續(xù)觀察2周，記錄小鼠的死亡情況。

2 結果與分析

2.1 Real-time PCR檢測保護性抗原的體內誘導表達 為了探討PGK是否在體內誘導增強表達的特性，體內感染細菌的 RNA和體外培養(yǎng)細菌的RNA進行了抽提，比較PGK在感染動物后其RNA含量是否顯著增高。本試驗采用 Real-time PCR技術研究PGK體內誘導表達特性。結果見圖1，相對于體外培養(yǎng)的細菌，SEZ 感染小鼠脾臟分離細菌PGK的mRNA表達均顯著上調，表明PGK屬于體內誘導增強表達的抗原。

圖1 熒光定量PCR分析PGK體內誘導表達

2.2 重組蛋白誘導的免疫反應 使用Ni-NTA樹脂做親和層析，純化重組表達的PGK蛋白(融合His標簽)，結果見圖2。收集的目的蛋白使用超濾濃縮后，用于后續(xù)的試驗分析。將純化的重組蛋白免疫小鼠，二次免疫后第 10 天采血測試效價。結果見圖3，重組PGK蛋白可以誘導高水平的IgG抗體。本試驗使用羊抗鼠 IgG1-HRP、IgG2a-HRP 檢測小鼠

圖2 純化重組PGK蛋白的SDS-PAGE分析

M：蛋白Marker； 1：目的蛋白

血清抗體的 IgG1 和 IgG2a亞類來進一步評價抗原所誘導的免疫類型。小鼠血清中IgG1 和 IgG2a的水平可以從一定程度上反映出抗原所誘導的Th2和Th1型的免疫類型，表明PGK可誘導高水平的Th2和Th1型免疫應答。

2.3 PGK抗原的保護效力 為了評價PGK蛋白的保護效力，各組小鼠在二次免疫后第 10 天分別接種相同劑量的C55138(2×105CFU)，評價重組蛋白的免疫保護力。結果見圖 4，空白對照組小鼠的死亡率為80%，陰性對照組小鼠的死亡率為70%，而試驗組小鼠的死亡率僅為10%，表明PGK蛋白具有較高的保護效力。

圖3 重組PGK蛋白誘導的免疫反應

A:重組蛋白免疫小鼠后的抗體水平； B:重組蛋白免疫小鼠誘導的免疫類型

圖4 重組PGK蛋白的保護效力

3 討論

試驗結果表明(見圖4)，保護性抗原PGK免疫小鼠可以提供較高的保護效力。本試驗進一步對PGK的保護機制進行了分析，PGK誘導產生特異性抗體，通過ELISA方法檢測 IgG1和 IgG2a抗體，評價PGK在小鼠體內誘導的免疫類型，結果發(fā)現(xiàn)，PGK可誘導產生高滴度的IgG2a抗體，即誘導高水平的 Th1型免疫應答。宿主清除體內鏈球菌的感染主要是通過調理吞噬作用，而調理吞噬作用主要與Th1型免疫應答相關，因此PGK誘導產生Th1型免疫應答可能是其提供較高保護效力的作用機制。

病原菌侵入宿主后，立刻需要面對宿主體內的“惡劣”環(huán)境。為了應對這些環(huán)境，病原菌往往會迅速上調表達某些毒力相關因子[9]。因此，病原侵染宿主后，迅速上調表達可能是某些毒力因子的“特性”之一。本試驗使用Real-time PCR技術探討了新保護性抗原PGK在體內誘導表達的特性，發(fā)現(xiàn)其體內增強表達，暗示該蛋白在SEZ感染宿主過程中可能發(fā)揮重要作用[10]，有待通過構建PGK基因缺失突變菌株及回復突變菌株進一步闡明其作用機制。

[1] Gruszynski K, Young A, Levine S J,etal. Streptococcus equi subsp. zooepidemicus infections associated with guinea pigs[J]. Emerg Infect Dis, 2015, 21(1): 156-158.

[2] Gaede W, Reckling K F, Schliephake A,etal. Detection of Chlamydophila caviae and Streptococcus equi subsp. zooepidemicus in horses with signs of rhinitis and conjunctivitis[J]. Vet Microbiol, 2010, 142: 440-444.

[3] Priestnall S, Erles K. Streptococcus zooepidemicus: an emerging canine pathogen[J]. Vet J, 2011, 188(2): 142-148.

[4] Wei Z, Fu Q, Liu X,etal. Identification of Streptococcus equi ssp. zooepidemicus surface associated proteins by enzymatic shaving[J]. Vet Microbiol, 2012, 159: 519-525.

[5] Blom A M, Beegmann S, Fulde M,etal. Streptococcus pneumoniae phosphoglycerate kinase is a novel complement inhibitor affecting the membrane attack complex formation[J]. J Biol Chem, 2014, 289(47): 32499-32511.

[6] Fu Q, Wei Z, Chen Y,etal. Identification of a surface protective antigen, CSP of Streptococcus equi ssp. zooepidemicus[J]. Vaccine, 2013, 31(10): 1400-1405.

[7] Fu Q, Wei Z, Liu X,etal. Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, an immunogenic Streptococcus equi ssp. zooepidemicus adhesion protein and protective antigen[J]. J Microbiol Biotechn, 2013, 24(4): 579-585.

[8] Livak K J, Schmittgen T D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method[J]. Methods, 2001, 25(4): 402-408.

[9] Hyams C, Camberlein E, Cohen J M,etal. The Streptococcus pneumoniae capsule inhibits complement activity and neutrophil phagocytosis by multiple mechanisms[J]. Infect Immun, 2010, 78(2): 704-715.

[10] Waller A S. Protecting against Streptococcus zooepidemicus opportunism: the challenge of vaccine design[J]. Vet J, 2010, 184:128-129.

Identification and characterization of a protective antigen, PGK ofStreptococcusequissp.zooepidemicus

FU Qiang , LUO Hui-na , WANG Ai-fu , LI Gui-zhen , MA Chun-quan

(Foshan University, foshan 528231, China)

Streptococcusequissp.zooepidemicus(Streptococcuszooepidemicus, SEZ) is an important pathogen associated with opportunistic infections of pigs in China. The absence of suitable vaccine or virulence marker impeds the step of control SEZ infection. Phosphoglycerate kinase (PGK) has been identified as an immunogenic protein in the previous study but its protective efficacy is not clear. In the present study, the purified recombinant PGK could elicit a significant humoral antibody response and could confer significant protection against challenge with lethal dose of SEZ in mouse model. In addition, the PGK was an in vivo-induced antigen confirmed by the real-time PCR and could induce significant Th1-/Th2-immune responses. Our findings suggest that PGK plays an important role in the pathogenesis of SEZ and could be a target for the development of an effective vaccine against SEZ infection.

SEZ ; PGK ; antigen ; vaccine candidate ; pathogenesis Corresponding author：MA Chun-quan

2016-05-09

國家自然科學基金(31502047)；廣東省自然科學基金項目(2014A030310020)；廣東高校優(yōu)秀青年創(chuàng)新人才培養(yǎng)計劃項目(2014KQNCX179)

付強(1983-)，男，講師，博士，研究方向為臨床獸醫(yī)學與分子免疫學，E-mail：frankjohn.fu@hotmail.com

馬春全，E-mail：machunquan@263.net

S858.28

A

0529-6005(2017)03-0026-03