小反芻獸疫病毒在自然感染羊體內(nèi)的病毒分布

何世成 ， 郭 威 ， 王昌建 ， 舒曉亮 ， 宋躍君 ， 王衛(wèi)國 ， 魯杏華 ， 唐小明 ， 林 源 ， 邱立新 ， 劉文澤

(1.湖南省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心， 湖南長沙410014； 2.湖南省懷化市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心， 湖南懷化418000； 3.湖南省常德市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心， 湖南常德415000)

小反芻獸疫病毒在自然感染羊體內(nèi)的病毒分布

何世成1， 郭 威1， 王昌建1， 舒曉亮2， 宋躍君1， 王衛(wèi)國1， 魯杏華1， 唐小明1， 林 源1， 邱立新1， 劉文澤3

(1.湖南省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心， 湖南長沙410014； 2.湖南省懷化市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心， 湖南懷化418000； 3.湖南省常德市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心， 湖南常德415000)

為了解小反芻獸疫病毒在自然感染羊體內(nèi)的分布情況，平行采集臨床發(fā)病羊的脾臟、肺臟、心臟、肝臟、腎臟、大腸、淋巴結(jié)以及眼拭子、鼻拭子、肛門拭子、血清等樣品，應(yīng)用熒光RT-PCR方法對各樣品進(jìn)行平行檢測，比較各樣品檢測Ct值，評估病毒分布和各樣品中的病毒含量，結(jié)果顯示，所有樣品小反芻獸疫病毒核酸均為陽性，其中大腸、肺臟、脾臟和淋巴結(jié)的檢測Ct值較小，表明小反芻獸疫病毒在自然感染羊體內(nèi)呈全身分布，但在大腸、肺、脾和淋巴結(jié)等組織中的含量較高。

小反芻獸疫病毒 ； 熒光RT-PCR ； 病毒分布

小反芻獸疫(PPR)是由副黏病毒科(Paramyxoviridae)麻疹病毒屬(Morbolivirus)的小反芻獸疫病毒(PPRV)引起的一種嚴(yán)重的烈性、高度接觸性傳染病，主要感染小反芻獸，特別是山羊和綿羊高度易感，野生動(dòng)物也偶然發(fā)生。該病是OIE規(guī)定必須上報(bào)的傳染病之一，是我國的一類動(dòng)物疫病。1942年該病首次報(bào)道發(fā)現(xiàn)于非洲西部的象牙海岸，2007年該病首次傳入我國西藏，但被及時(shí)控制，疫情未得到擴(kuò)散，2013年疫情再次傳入，2014年在21個(gè)省發(fā)生小反芻獸疫疫情共260起，給我國養(yǎng)羊業(yè)造成了巨大的損失[1-3]。為了解自然感染羊后PPRV在體內(nèi)的分布情況，應(yīng)用熒光RT-PCR方法，平行檢測發(fā)病羊各部位樣品，評估病毒組織分布及含量，以期為致病機(jī)理研究和臨床診斷提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 發(fā)病病料的采集與處理 病料采自湖南省內(nèi)經(jīng)國家外來動(dòng)物疫病研究中心確診的小反芻獸疫疫情場，撲殺并無菌采集疫情場內(nèi)4頭發(fā)病癥狀明顯羊的心、肝、脾、肺、腎、淋巴結(jié)、大腸、眼拭子(PBS)、鼻拭子(PBS)、肛門拭子(PBS)以及血液。在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)對血液樣品進(jìn)行離心，取血清備用；組織剪取0.5 g左右，加入適量PBS進(jìn)行碾磨，離心取上清備用。

1.2 主要試劑與儀器 小反芻獸疫熒光RT-PCR檢測試劑盒為北京世紀(jì)元亨動(dòng)物防疫技術(shù)有限公司產(chǎn)品；磁珠法核酸提取試劑盒為蘇州天隆生物科技有限公司產(chǎn)品；ABI 7500fast熒光定量PCR儀，Retsch MM400組織碾磨儀，西安天隆全自動(dòng)核酸提取儀。1.3 核酸的提取及實(shí)時(shí)熒光RT-PCR反應(yīng) 分別提取4頭發(fā)病羊的心、肝、脾、肺、腎、淋巴結(jié)、大腸、眼拭子、鼻拭子、肛門拭子和血清等樣品的核酸，并分別進(jìn)行熒光RT-PCR擴(kuò)增，操作按試劑盒說明書進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品檢測結(jié)果 4頭發(fā)病羊的心、肝、脾、肺、腎、淋巴結(jié)、大腸、眼拭子、鼻拭子、肛門拭子和血清等樣品均出現(xiàn)明顯的擴(kuò)增曲線，Ct值均在34以下，為PPRV核酸陽性。

2.2 各樣品PPRV核酸檢測Ct值 不同發(fā)病羊、不同樣品PPRV檢測均為陽性，但Ct值不盡相同(表1)，表明PPRV感染羊后雖然呈全身分布，但病毒含量并不一致，4頭發(fā)病動(dòng)物不同樣品最高Ct值和最低Ct值相差在19.95～24.91之間，平均差異為22.12，病毒含量相差近420萬倍(222)；有2頭發(fā)病動(dòng)物最低Ct值的組織是肺，1頭為大腸，1頭是眼拭子；平均值結(jié)果顯示，肺、大腸、脾、眼拭子、鼻拭子等樣品中的含量較高，心、肝、腎、淋巴結(jié)、肛拭子等樣品次之，血清含量最低。

表1 樣品檢測結(jié)果Ct值明細(xì)

3 討論

3.1 小反芻獸疫為傳入我國的外來動(dòng)物疫病，在國內(nèi)流行初期的樣品類型選擇上比較混亂，本研究結(jié)果顯示，發(fā)病動(dòng)物的大部分組織和拭子樣品均可檢測出病毒，但相比較而言，肺、大腸、脾、淋巴結(jié)等組織以及眼拭子、鼻拭子等樣品病毒含量較高，考慮到樣品保存儲(chǔ)運(yùn)以及病毒穩(wěn)定性等因素，臨床采集肺、脾、淋巴結(jié)等組織樣品可基本滿足實(shí)驗(yàn)室診斷檢測需要。

3.2 檢測結(jié)果顯示，有3頭發(fā)病羊組織的最低Ct值在10以下，另1頭組織中的最低檢測Ct值為15以上，表明本試驗(yàn)中的4頭自然感染羊可能處于不同的發(fā)病階段，且不同發(fā)病階段動(dòng)物體內(nèi)各組織病毒含量差距較大；另外，同一動(dòng)物，不同樣品的病毒含量也有差異，4頭發(fā)病羊各樣品的最高Ct值和最低Ct值的差異平均達(dá)22.12，根據(jù)熒光PCR技術(shù)原理[4]，病毒含量的相對差值達(dá)420萬倍(222)，表明PPRV自然感染羊以后具有較明顯的組織嗜性，含量高的組織可能為PPRV繁殖部位，含量低的組織可能是受病毒血癥的影響，而眼、鼻、肛門等部位的拭子樣品Ct值與組織中的最低Ct值接近，反映的是PPRV在體內(nèi)繁殖后通過眼鼻分泌物和糞便排泄物的方式向外大量排出病毒，與PPRV致病機(jī)理基本一致[5-6]。

3.3 對病毒體內(nèi)分布的研究方法有免疫組化法、PCR方法、熒光PCR方法等[7-10]，由于熒光PCR方法可數(shù)字化比較目標(biāo)基因的含量，且敏感性高，操作方便，越來越多的被用于病毒體內(nèi)分布的評估分析[11]。為確保得出較準(zhǔn)確的相對定量結(jié)果，本研究在樣品處理時(shí)對剪取的組織進(jìn)行了稱重，樣品的處理、核酸提取、熒光RT-PCR擴(kuò)增都同步進(jìn)行，確保過程一致，最大限度減少操作誤差，所得試驗(yàn)數(shù)據(jù)比較準(zhǔn)確的反映了相對量值，對準(zhǔn)確評估PPRV在自然感染羊體內(nèi)分布的相對狀況有積極意義。

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Distribution of Peste des Petits Ruminants virus in naturally infected goats

HE Shi-cheng1, GUO Wei1, WANG Chang-jian1, SHU Xiao-liang2, SONG Yue-jun , WANG Wei-guo1, LU Xing-hua1, TANG Xiao-ming1, LIN Yuan1, QIU Li-xin1, LIU Wen-ze3

(1.Animal disease prevention and control center of Hunan， Changsha 410014,China； 2.Animal disease prevention and control center of Huaihua,Huaihua 418000,China； 3.Animal disease prevention and control center of Changde， Changde 415000,China)

In order to survey the distribution of peste des petits ruminants(PPR)virus in goats after naturall infection,real-time quantitative PCR was used to detect the samples collected from spleen,lung,heart,liver,kidney,large intestine,lymph nodes,ocular swab,nasal swab,anal swab and serum in infected goats.The results showed that all the samples were positive and the cycle threshold value is low in large intestine,lung,spleen and lymph nodes,indicating that PPR virus invades all major organs and has the strongest tropism to large intestine,lung,spleen and lymph nodes.

Peste des Petits Ruminants virus ； fluorescent quantitative RT-PCR ； virus distribution

2016-04-29

何世成(1978- )，男，高級獸醫(yī)師，碩士，從事動(dòng)物疫病防控工作，E-mail：784971815@qq.com

S852.651

A

0529-6005(2017)03-0021-02