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    趨化因子CXC配體12/CXC受體4在前列腺癌細胞的表達及其對細胞增殖的作用機制

    2017-04-20 07:57:23曲修勝劉媛媛孫華威梁立春齊亞靈王偉群
    中國老年學(xué)雜志 2017年7期
    關(guān)鍵詞:外源性蛋白激酶趨化因子

    曲修勝 劉媛媛 孫華威 梁立春 李 玥 齊亞靈 王偉群

    (佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院腫瘤內(nèi)科,黑龍江 佳木斯 154002)

    趨化因子CXC配體12/CXC受體4在前列腺癌細胞的表達及其對細胞增殖的作用機制

    曲修勝 劉媛媛 孫華威 梁立春1李 玥1齊亞靈2王偉群1

    (佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院腫瘤內(nèi)科,黑龍江 佳木斯 154002)

    目的 檢測DU145、PC-3和LNCaP前列腺癌細胞中趨化因子CXC配體(L)12及其受體(R)4的表達,探討重組人CXCL12對上述細胞增殖的影響及其機制。方法 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)研究CXCL12/CXCR4在DU145、PC-3和LNCaP細胞的表達;CCK-8實驗研究重組人CXCL12對DU145、PC-3和LNCaP細胞增殖的作用;Wettern印跡實驗研究重組人CXCL12對DU145細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)和磷酶化ERK(pERK)表達的影響。結(jié)果 DU145、PC-3和LNCaP細胞均表達CXCL12和CXCR4,重組人CXCL12可明顯促進上述細胞的增殖,重組人CXCL12雖然不能改變DU145細胞ERK1/2表達,但可上調(diào)pERK1/2的表達。結(jié)論 前列腺癌細胞表達CXCL12 及其受體CXCR4,CXCL12/CXCR4可通過活化絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)/ERK信號通路促進前列腺癌細胞的增殖。

    前列腺癌;趨化因子CXC配體(L)12;CXC受體(R)4;細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)

    前列腺癌是臨床上最常見的泌尿生殖系統(tǒng)惡性腫瘤之一,其致死率位列所有男性腫瘤的第二位〔1〕。目前認為,前列腺癌的發(fā)生與多種因素有關(guān),高危因素包括年齡、吸煙、炎癥、雄激素水平、飲食和遺傳等。其中,炎癥反應(yīng)在惡性腫瘤中的作用越來越引起人們的關(guān)注,其已被認為是癌癥發(fā)生的第七大危險因素〔2〕。趨化因子屬于細胞因子超家族成員,其具有吸引、活化、調(diào)節(jié)各種類型白細胞運輸?shù)墓δ?。近年來的研究成果表明,趨化因子也可通過促進腫瘤微環(huán)境中血管的生成、腫瘤細胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移而參與腫瘤的發(fā)生與演進過程〔3〕。本研究觀察趨化因子CXC配體(L)12及其受體(R)4在前列腺癌細胞的表達并探討CXCL12對前列腺癌細胞增殖的作用及其機制。

    1 材料與方法

    1.1 實驗細胞及試劑 人類前列腺癌細胞系DU145、PC-3和 LNCaP(中科院上海細胞庫,中國),胎牛血清(NQBB,美國),青、鏈霉素和細胞計數(shù)試劑盒(CCK)8(博士德,中國),RPMI1640培養(yǎng)基(Gibco,美國),Trizol(Invitrogen,美國),TIANScript RT試劑盒(天跟,中國),外源性CXCL12(PeproTech,美國),苯甲基磺酰氟(PMSF)、放射免疫沉淀(RIPA)裂解液和二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒(碧云天,中國),兔抗細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)和兔抗磷酸化ERK(pERK)(Affinity,美國),鼠抗β-actin、辣根過氧化物酶(HRP)標記二抗(中杉金橋,中國)。

    1.2 細胞培養(yǎng) DU145、PC-3和 LNCaP細胞被接種和培養(yǎng)在含10% 胎牛血清、100 μg/ml青、鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中,待細胞密度達到90%以上時,細胞受胰蛋白酶消化,離心后收集細胞沉淀或傳代,備用。

    1.3 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)實驗 用Trizol試劑常規(guī)提取DU145、PC-3和LNCaP細胞的總RNA并測量其濃度,利用TIANScript RT試劑盒按操作規(guī)程將2 μg總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,并行PCR實驗。PCR擴增中各基因引物及PCR反應(yīng)條件見表1。

    表1 PCR引物及反應(yīng)條件

    1.4 細胞增殖實驗 取對數(shù)生長期DU145、PC-3和 LNCaP細胞重懸于RPMI1640完全培養(yǎng)基中(含10% 胎牛血清、100 μg/ml青、鏈霉素)。待計數(shù)板計數(shù)細胞后,將1.5×103細胞/孔分別接種于96孔板中,并于37℃含5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。待第2天細胞完全貼壁后,小心吸取培養(yǎng)基,向每孔中加入含外源性CXCL12完全培養(yǎng)基100 μl,使各孔中外源性CXCL12終濃度分別為0、10、20、40和 60 ng/ml,將孔板置于上述培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng),72 h后用CCK8試劑盒檢測細胞增殖情況。

    1.5 Western印跡實驗 將細胞培養(yǎng)在10 cm培養(yǎng)皿中,待細胞融合度達到90%以上后,收集細胞沉淀,加入含PMSF 的RIPA蛋白裂解液充分裂解細胞,待BCA蛋白定量試劑盒測量各樣本濃度后將樣本存于-80℃冰箱中備用。Western印跡流程如下:取50 μg的總蛋白于12%的十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠中電泳(電壓為110 V);將凝膠中蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上(電流為300 mA,2 h);5%的脫脂奶粉室溫封閉3 h;Tween-20磷酸鹽緩沖液(PBST)洗膜3×5 min;一抗4℃孵育過夜(β-actin、ERK和pERK濃度均為1∶1 000),PBST洗膜3×5 min; HRP標記的二抗(1∶10 000)37℃孵育45 min;PBST洗膜4×5 min;向膜上加入電化學(xué)發(fā)光(ECL)顯影液,并于全自動化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)中曝光、拍照。

    1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計軟件行q檢驗。

    2 結(jié) 果

    2.1 前列腺癌細胞表達CXCL12及其受體CXCR4 DU145、PC-3和 LNCaP均表達CXCL12及其受體CXCR4。見圖1。半定量分析表明,與PC-3(0.51±0.08)和DU145(0.29±0.06)比較,LNCaP細胞 CXCL12 mRNA表達量(1.34±0.14)明顯增高,而CXCR4的mRNA水平在DU145中最高(0.99±0.08),LNCaP次之(0.62±0.09),PC-3最低(0.47±0.06)。

    圖1 前列腺癌細胞表達CXCL12及CXCR2 mRNA

    2.2 外源性CXCL12促進前列腺癌細胞增殖 細胞培養(yǎng)72 h后,CCK8實驗結(jié)果表明,外源性CXCL12均可促進DU145、PC-3和 LNCaP的增殖,但是各細胞促進增殖的濃度有明顯差異(P<0.05),DU145的促增殖濃度為10、20和40 ng/ml,PC-3為60 ng/ml,而LNCaP為10、20、40和60 ng/ml。見表2。

    2.3 外源性CXCL12促進DU145細胞ERK磷酸化(pERK) 與0 ng/ml CXCL12(0.70±0.35、0.55±0.13)比較,10、40 ng/ml的CXCL12不能改變ERK的水平(1.01±0.15、0.94±0.14,P>0.05),但可明顯促進pERK的表達(1.55±0.14、1.56±0.18,P<0.05)。見圖2。

    組別0ng/ml10ng/ml20ng/ml40ng/ml60ng/mlDU1450.553±0.080.636±0.061)0.666±0.032)0.753±0.042)0.647±0.04PC-30.491±0.040.526±0.060.529±0.060.541±0.040.610±0.031)LNCaP0.609±0.100.768±0.031)0.848±0.051)0.864±0.041)0.837±0.031)

    與0 ng/ml比較:1)P<0.05;2)P<0.01

    1~3:0、10、40 ng/ml CXCL12圖2 外源性CXCL12上調(diào)DU145 細胞pERK水平

    3 討 論

    前列腺癌在歐美被稱為男性健康的第一大殺手,其發(fā)病率位居西方世界男性惡性腫瘤的第一位,而死亡率也已升至第二位,僅次于肺癌〔4〕。前列腺癌在北京男性泌尿生殖系腫瘤中排名第一位、所有腫瘤疾病中排名第五位〔5〕。

    炎癥反應(yīng)是機體在進化演進過程中形成的具有抵抗及清除病原微生物、異物及壞死組織的一種保護機制。該過程有助于生物體清除異己,從而保證個體的生存,但炎癥的長期存在,即慢性炎癥,也會導(dǎo)致包括腫瘤在內(nèi)的多種疾病發(fā)生〔6〕。全球約25%的腫瘤是由炎癥發(fā)展而來的〔7〕。

    趨化因子屬于細胞因子超家族成員,根據(jù)鄰近氨基端結(jié)構(gòu)性半胱氨酸的排列,其可被分為CXC、CX3C、CC和C四個亞家族。其中CXC亞家族又可依據(jù)第一個保守半胱氨酸前是否存有谷氨酸-亮氨酸-精氨酸(ELR)結(jié)構(gòu),進一步分為ELR+CXC和ELR-CXC兩類。盡管趨化因子在炎癥和免疫反應(yīng)中可以活化、吸引及調(diào)節(jié)粒細胞的遷移,但越來越多的證據(jù)顯示,趨化因子也參與了腫瘤的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移及血管生成〔8〕。

    作為ELR+CXC類趨化因子中的一員,CXCL12是CXCR4的唯一配體。有研究已經(jīng)證實,CXCL12/CXCR4參與了多種腫瘤的發(fā)生與演進過程。在包括卵巢癌、小細胞肺癌和腦膠質(zhì)瘤的許多腫瘤中,CXCL12均可促進表達CXCR4腫瘤細胞的增殖與存活〔9~11〕。另外,CXCL12也參與腫瘤細胞的特異性器官轉(zhuǎn)移,Müller等〔12〕研究表明,CXCR4高表達于乳腺癌細胞和乳腺癌組織,而乳腺癌常轉(zhuǎn)移的靶組織則高表達其配體CXCL12,CXCR4可介導(dǎo)乳腺癌細胞肌動蛋白的聚合和偽足形成,并借助受體與配體的特異性結(jié)合,以實現(xiàn)其向靶組織的趨化及轉(zhuǎn)移,這就是所謂的“歸巢學(xué)說”,而阻斷CXCL12/CXCR4的相互作用,則可抑制癌細胞的歸巢和遷移。本研究提示,CXCL12的表達可能與雄激素信號有關(guān)。細胞增殖實驗表明外源性給予CXCL12均可促進上述細胞的增殖,而當(dāng)CXCL12濃度增加到一定數(shù)值后,其促DU145和LNCaP的增殖效應(yīng)有所下降。Begley等〔13〕的研究證實同為ELR+CXC類趨化因子的CXCL5對前列腺癌細胞的增殖也具有雙向調(diào)節(jié)作用,即一定濃度的CXCL5可促進癌細胞增殖,而超過一定濃度反而會出現(xiàn)抑制效應(yīng);推斷這種現(xiàn)象可能與高濃度的配體導(dǎo)致受體下調(diào)有關(guān)。

    絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)/ERK通路在腫瘤中的作用已被廣泛證實,其不僅參與了腫瘤細胞的增殖與血管發(fā)生,還在腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用〔14~16〕。本研究結(jié)果表明,外源性CXCL12雖然不能改變ERK1/2表達,但可上調(diào)pERK1/2的表達。由此可見活化MAPK/ERK信號通路可促進前列腺癌細胞的增殖。

    1 Morales CP,Holt SE,Ouellette M,etal.Absence of cancer-associated changes in human fibroblasts immortalized with telomerase〔J〕.Nat Genet,1999;21(1):115-8.

    2 Laskowski P,Klim B,Ostrowski K,etal.Local inflammatory response in colorectal cancer〔J〕.Pol J Pathol,2016;67(2):163-71.

    3 Caronni N,Savino B,Recordati C,etal.Cancer and chemokines〔J〕.Methods Mol Biol,2016;1393:87-96.

    4 Weingartner K,Ben-Sasson SA,Stewart R,etal.Endothelial cell proliferation activity in benign prostatic hyperplasia and prostate cancer:an in vitro model for assessment〔J〕.J Urol,1998;159(2):465-70.

    5 葉定偉,朱 耀.中國前列腺癌的流行病學(xué)概述和啟示〔J〕.中華外科雜志,2015;53(4):249-52.

    6 Lin WW,Karin M.A cytokine-mediated link between innate immunity,inflammation,and cancer〔J〕.J Clin Invest,2007;117(5):1175-83.

    7 Hussain SP,Harris CC.Inflammation and cancer:an ancient link with novel potentials〔J〕.Int J Cancer,2007;121(11):2373-80.

    8 Strieter RM.Chemokines:not just leukocyte chemoattractants in the promotion of cancer〔J〕.Nat Immunol,2001;2(4):285-6.

    9 Scotton CJ,Wilson JL,Scott K,etal.Multiple actions of the chemokine.CXCL12 on epithelial tumor cells in human ovarian cancer〔J〕.Cancer Res,2002;62(20):5930-8.

    10 Phillips RJ,Burdick MD,Lutz M,etal.The stromal derived factor-1/CXCL12-CXC chemokine receptor 4 biological axis in non-small cell lung cancer metastases〔J〕.Am J Respir Crit Care Med,2003;167(12):1676-86.

    11 Barbero S,Bonavia R,Bajetto A,etal.Stromal cell-derived factor 1alpha stimulates human glioblastoma cell growth through the activation of both extracellular signal-regulated kinases 1/2 and Akt〔J〕.Cancer Res,2003;63(8):1969-74.

    12 Müller A,Homey B,Soto H,etal.Involvement of chemokine receptors in breast cancer metastasis〔J〕.Nature,2001;410(6824):50-6.

    13 Begley LA,Kasina S,Mehra R.CXCL5 promotes prostate cancer progression〔J〕.Neoplasia,2008;10(3):244-54.

    14 Chin CC,Li JM,Lee KF,etal.Selective β2-AR blockage suppresses colorectal cancer growth through regulation of EGFR-Akt/ERK1/2 signaling,G1-phase arrest,and apoptosis〔J〕.J Cell Physiol,2016;231(2):459-72.

    15 Hou X,Zhang Y,Qiao H.CCL18 promotes the invasion and migration of gastric cancer cells via ERK1/2/NF-κB signaling pathway〔J〕.Tumour Biol,2016;37(1):641-51.

    16 Teng JA,Wu SG,Chen JX,etal.The activation of ERK1/2 and JNK MAPK signaling by insulin/IGF-1 is responsible for the development of colon cancer with type 2 diabetes mellitus〔J〕.PLoS One,2016;11(2):e0149822.

    〔2015-12-17修回〕

    (編輯 苑云杰)

    The expression of CXCL12/CXCR4 axis in prostate cancer cells and its action mechanism on cells proliferation

    QU Xiu-Sheng,LIU Yuan-Yuan,SUN Hua-Wei,etal.

    Medical Oncology,the First Affiliated Hospital,Jiamusi University,Jiamusi 154002,Heilongjiang,China

    Objective To test the expression of chemotactic factor CXCL12 and its receptor CXCR4 in DU145,PC-3 and LNCaP prostate cancer cell,and explore the effect and mechanism of human recombinant CXCL12 on the proliferation of cells mentioned above.Methods RT-PCR experiments were utilized to study the expression of CXCL12/CXCR4 in DU145,PC-3 and LNCaP cells;CCK-8 experiments were used to investigate the proliferative effects of human recombinant CXCL12 on DU145,PC-3 and LNCaP cells;Western blot experiments were performed to explore the effect of human recombinant CXCL12 on the expression of ERK and pERK.Results CXCL12 and CXCR4 were expressed in DU145,PC-3 and LNCaP cells.Human recombinant CXCL12 obviously promoted proliferative response on the three cell lines,which didn’t change the expression of ERK1/2 in DU145 cells,whereas up-regulated pERK1/2 expressionConclusions Prostate cancer cells express CXCL12 and its receptor CXCR4,CXCL12/CXCR4 axis contributes prostate cancer cells proliferation by activating MAPK/ERK signaling pathway.

    Prostate cancer;CXCL12;CXCR4;ERK

    國家自然科學(xué)基金面上資助項目(No.81272854);黑龍江省自然科學(xué)基金資助項目(No.D201129);佳木斯大學(xué)研究生科技創(chuàng)新項目(No.YM2016_006)

    1 佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 2 海南醫(yī)學(xué)院

    王偉群(1974-),男,醫(yī)學(xué)博士,副教授,碩士生導(dǎo)師,主要從事腫瘤病理生理學(xué)研究。 齊亞靈(1967-),女,醫(yī)學(xué)博士,教授,博士生導(dǎo)師,主要從事腫瘤發(fā)病機制研究。

    曲修勝(1979-),男,主治醫(yī)師,主要從事腫瘤放化療研究。

    R737.25

    A

    1005-9202(2017)07-1568-03;

    10.3969/j.issn.1005-9202.2017.07.003

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