太平洋桿菌對銅綠假單胞菌毒力因子的抑制作用

陳小春,嚴(yán)銀春,張甲生,朱金鑫,章華偉,王 鴻,2

(1.浙江工業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院,浙江 杭州 310014;2.浙江工業(yè)大學(xué) 長三角綠色制藥協(xié)同創(chuàng)新中心,浙江 杭州 310014)

太平洋桿菌對銅綠假單胞菌毒力因子的抑制作用

陳小春1,嚴(yán)銀春1,張甲生1,朱金鑫1,章華偉1,王 鴻1,2

(1.浙江工業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院,浙江 杭州 310014;2.浙江工業(yè)大學(xué) 長三角綠色制藥協(xié)同創(chuàng)新中心,浙江 杭州 310014)

為了研究太平洋桿菌XC22919(Oceanobacillussp. XC22919)對野生型銅綠假單胞菌PAO1(Pseudomonasaeruginosa, PAO1)群體感應(yīng)(Quorum sensing, QS)系統(tǒng)控制的相關(guān)毒素的抑制作用以及抑制效果.以PAO1為檢測菌株,在不影響其生長的濃度下,通過吸光度法檢測XC22919發(fā)酵粗提物對野生型銅綠假單胞菌毒素的抑制率.結(jié)果顯示:太平洋桿菌XC22919在不影響PAO1生長的濃度下,對其綠膿素、彈性蛋白酶、蛋白水解酶、生物體膜的最高抑制率分別為31%,30%,18%和15%.表明太平洋桿菌XC22919發(fā)酵液粗提物可以抑制PAO1相關(guān)毒素的分泌,具有很好的篩選群體感應(yīng)抑制劑的潛力,該結(jié)果有助于推動新型抗菌藥物的研究.

太平洋桿菌;群體感應(yīng)抑制劑;銅綠假單胞菌;毒素

隨著抗生素的廣泛應(yīng)用甚至濫用,微生物的耐藥譜越來越廣、耐藥強度越來越高、耐藥性形成的速度越來越快,細(xì)菌對多種抗生素具有耐藥性成為了一個不可忽視的健康問題[1],因此迫切需要發(fā)現(xiàn)新靶向作用的抗菌藥,這些新型抗菌藥物針對毒素輸送、毒力調(diào)控表達(dá)和細(xì)菌粘附等毒力因子的產(chǎn)生,而不是針對致病微生物生長的基本過程[2].群體感應(yīng)系統(tǒng)(Quorum sensing,QS)是一種依賴于細(xì)菌密度的細(xì)胞間信號傳導(dǎo)系統(tǒng),當(dāng)細(xì)菌的密度達(dá)到一定閾值的時候,會通過感知自身所產(chǎn)生的自誘導(dǎo)物(Autoinducer,AI)的濃度來調(diào)節(jié)自身多種生命活動以及種內(nèi)、種間的群體行為,如生物體膜的形成、生物發(fā)光和毒力因子的分泌等[3-4].因為銅綠假單胞菌的致病性是由群體感應(yīng)系統(tǒng)控制的,所以阻斷其群體感應(yīng)通路可以減弱毒力從而保護(hù)機(jī)體免受感染[5].這種阻斷針對的是特定的信號系統(tǒng)而不是細(xì)菌的生長過程,不會產(chǎn)生任何的耐藥行為,所以通過抑制群體感應(yīng)系統(tǒng)治療細(xì)菌感染的方法可以很合理地替代傳統(tǒng)的抗生素治療[6].

海洋多變復(fù)雜的環(huán)境導(dǎo)致了海洋微生物的多樣性[7].目前大多數(shù)的處方藥都來源于自然資源[8],其中海洋微生物代謝產(chǎn)物由于化學(xué)結(jié)構(gòu)的多樣性成為開發(fā)新型藥物的潛在來源.雖然如此,僅有少數(shù)海洋來源的天然藥物應(yīng)用于臨床治療,因此該類化合物具有非常大的開發(fā)前景[9].科學(xué)家通過對海洋生物的研究發(fā)現(xiàn)了許多具有QS系統(tǒng)活性的抑制劑,如海洋紅藻(Deliseapulchra)分泌產(chǎn)生的鹵代呋喃酮與細(xì)菌QS信號分子結(jié)構(gòu)類似,可以抑制細(xì)菌QS調(diào)控的多種功能[10].Sergey Dobretsov等[11]利用紫色桿菌QS報告菌株和大腸桿菌異源表達(dá)的Lux群體感應(yīng)系統(tǒng)菌株,從海洋微生物中篩選得到7種具有抗革蘭氏陰性菌AHL群體感應(yīng)系統(tǒng)的活性物質(zhì).本課題組前期以紫色桿菌ATCC12472為報告菌株,采用打孔法對50株分離自東太平洋海山區(qū)的細(xì)菌進(jìn)行群體感應(yīng)抑制活性的篩選,得到了3株細(xì)菌群體感應(yīng)抑制活性較好的菌株,其中活性最好的XC22919菌株被鑒定為太平洋桿菌屬細(xì)菌.研究XC22919菌株次級代謝產(chǎn)物對銅綠假單胞菌相關(guān)毒素的抑制作用,最終從海洋微生物產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物中尋找潛在的具有群體感應(yīng)抑制活性的單體化合物.

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌 株

活性實驗菌株野生型銅綠假單胞菌由浙江省杭州市浙江大學(xué)第二附屬醫(yī)院濱江院區(qū)微生物科室饋贈,-80 ℃長期保存于本實驗室;測試細(xì)菌從東太平洋海山區(qū)海泥中分離得到,-80 ℃長期保存于本實驗.

1.1.2 培養(yǎng)基

1) LB海水瓊脂培養(yǎng)基:酵母提取物5 g/L,蛋白胨10 g/L,NaCl 5 g/L,瓊脂15～20 g/L,海鹽33.3 g/L,pH 7.4.

2) LB海水液體培養(yǎng)基:酵母提取物5 g/L,蛋白胨10 g/L,NaCl 5 g/L,海鹽33.3 g/L,pH 7.4.

3) LB淡水液體培養(yǎng)基:酵母提取物5 g/L,蛋白胨10 g/L,NaCl 5 g/L,pH 7.4.

4) PB培養(yǎng)基:蛋白胨20 g/L,氯化鎂1.4 g/L,硫酸鉀10 g/L,pH自然.

1.2 方 法

1.2.1 XC22919的發(fā)酵培養(yǎng)和粗提物的制備

從LB固體培養(yǎng)基中挑取適量XC22919單菌落,接種到裝有100 mL液體培養(yǎng)基的錐形瓶中,30 ℃,180 r/min恒溫恒速振蕩培養(yǎng)1 d;然后從錐形瓶中吸取5 mL菌液接種到裝有400 mL培養(yǎng)基的錐形瓶中,同樣條件振蕩培養(yǎng)3 d.發(fā)酵液8 000 r/min離心10 min,取上清液,用等體積的乙酸乙酯萃取3次.乙酸乙酯相用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干得到粗提物,稱重,用甲醇溶成50 mg/mL的溶液待用.

1.2.2 XC22919對紫色桿菌CV026紫色素產(chǎn)量抑制和生長抑制實驗

將含有外源信號分子的過夜培養(yǎng)的CV026菌液用新鮮LB液體培養(yǎng)基以1∶100比例稀釋后,用25 mL的錐形小瓶分裝成9組,每組10 mL.其中1個空白組,1個陰性對照組,剩余7組為實驗組,每組3個平行樣.分別加入前期制備好的XC22919粗提物,使實驗組質(zhì)量濃度為0.05～0.35 mg/mL,陰性對照組加入10 μL甲醇.將其置于30 ℃,150 r/min搖床約18 h,取1 mL菌液,12 000 r/min離心10 min,棄上清,加入1 mL DMSO,漩渦振蕩使紫色菌素完全溶解,8 000 r/min離心10 min,吸取上清液檢測OD585下的吸光度[12].將過夜培養(yǎng)的CV026菌液稀釋100倍,通過測定OD600來檢測菌體密度[13].

1.2.3 XC22919對銅綠假單胞菌綠膿菌素產(chǎn)量抑制及生長抑制實驗

將過夜培養(yǎng)的銅綠假單胞菌菌液用新鮮PB液體培養(yǎng)基以1∶100比例稀釋后,用25 mL的錐形小瓶分裝成9組,其中1個空白組,1個陰性對照組,剩余7組為實驗組,每組3個平行.分別加入前期制備好的XC22919粗提物,使實驗組質(zhì)量濃度為0.05～0.30 mg/mL,陰性對照組加入10 μL甲醇.將其置于37 ℃,150 r/min搖床約24 h.取6 mL菌液,加入3 mL氯仿進(jìn)行抽提;抽提后,氯仿層顯藍(lán)色,將其轉(zhuǎn)入新的離心管中,并加入1 mL 0.2 mol/L的鹽酸混合反應(yīng),反應(yīng)后顯粉紅色;充分混合后,離心收集上層水相;于OD520測定水相吸光值[14].將過夜培養(yǎng)的銅綠假單胞菌菌液稀釋100倍,通過測定OD600來檢測菌體密度.

1.2.4 XC22919菌株對銅綠假單胞菌彈性蛋白酶的抑制作用

將過夜培養(yǎng)的銅綠假單胞菌菌液用新鮮PB液體培養(yǎng)基以1∶100比例稀釋后,分裝成9組,其中1個空白組,1個陰性對照組,剩余7組為實驗組,每組3個平行.分別加入前期制備好的XC22919粗提物,使實驗組質(zhì)量濃度為0.05～0.30 mg/mL.將其置于37 ℃,150 r/min搖床約24 h.將菌液于4 ℃,12 000 r/min條件下離心10 min,吸取上清液,并用一次性濾器(0.22 μm)過濾除菌.在1 mL EP管中加入2 mg底物彈性蛋白酶-剛果紅(Elastin-Congo Red,ECR)和900 μL反應(yīng)緩沖液,并加入100 μL細(xì)菌上清液,于37 ℃搖床振蕩反應(yīng)4 h.加入100 μL 0.12 mol/L的EDTA終止反應(yīng),并將反應(yīng)物置于冰上5 min,于4 ℃,12 000 r/min條件下離心10 min,去除不可溶的ECR;上清液在OD495處讀取吸光度[15].

1.2.5 XC22919菌株對銅綠假單胞菌蛋白水解酶的抑制作用

將過夜培養(yǎng)的銅綠假單胞菌菌液用新鮮PB液體培養(yǎng)基以1∶100比例稀釋后,分裝成9組,其中1個空白組,1個陰性對照組,剩余7組為實驗組,每組3個平行.分別加入前期制備好的XC22919粗提物,使實驗組質(zhì)量濃度為0.05～0.30 mg/mL.將其置于37 ℃恒溫?fù)u床中200 r/min培養(yǎng)12 h.將菌液離心除去菌體,上清液用0.22 μm濾膜過濾.取150 μL上清液并加入1 mL 0.3%的偶氮酪蛋白溶液.在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中反應(yīng)15 min,12 000 r/min離心5 min,結(jié)束后加入三氯乙酸(10%,0.5 mL)終止反應(yīng),離心,取上清液在OD440處讀取吸光度[16].

1.2.6 銅綠假單胞菌生物被膜的定量檢測

將前期制備好的XC22919粗提物(50 mg/mL)用甲醇分別稀釋成2,4,6,8 mg/mL.過夜培養(yǎng)的銅綠假單胞菌用新鮮LB液體培養(yǎng)基按1∶100的比例稀釋.稀釋后加190 μL至96孔板中并加入不同濃度的稀釋好的菌液10 μL.加入10 μL甲醇作陰性對照.培養(yǎng)24 h后除去上層細(xì)菌,貼壁細(xì)胞用去離子水輕輕漂洗2次.風(fēng)干后加入200 μL的0.2%結(jié)晶紫.染色15 min后再用去離子水輕輕漂洗2次,最后用200 μL 95%乙醇溶解色素.生物體膜含量用OD650處吸光度表示[17].

2 結(jié) 果

2.1 XC22919對紫色桿菌CV026紫色菌素產(chǎn)量影響及生長抑制

通過XC22919菌株的粗提物對紫色桿菌CV026紫色素含量和生長抑制實驗同步的方法進(jìn)行有效濃度的摸索.可以從實驗結(jié)果得到,隨著粗提物質(zhì)量濃度上升,紫色明顯變淡甚至消失,可以從表觀上判斷XC22919菌株粗提物對紫色素具有抑制作用.從圖1(a)可以看出:粗提物質(zhì)量濃度為0～0.15 mg/mL時,紫色桿菌CV026的生長不受到抑制,當(dāng)粗提物質(zhì)量濃度達(dá)到0.2 mg/mL時,紫色桿菌菌體生長明顯受到抑制.通過吸光度檢測,從圖1(b)可以得出:太平洋桿菌XC22919在不抑制菌體生長的濃度范圍內(nèi),最大抑制率達(dá)到45.23%.因此,XC22919的質(zhì)量濃度為0～0.15 mg/mL時,對紫色桿菌CV026具有群體感應(yīng)抑制活性.

(a) XC22919對紫色桿菌CV026紫色菌素的影響

(b) XC22919對紫色桿菌CV026生長的影響

2.2 XC22919對銅綠假單胞菌綠膿菌素產(chǎn)量影響及生長抑制

雖然紫色桿菌和銅綠假單胞菌同屬革蘭氏陰性菌,都具有LuxI-LuxR群體感應(yīng)系統(tǒng),在篩選群體感應(yīng)抑制劑時,兩者的抑制方式可能相同.但是,銅綠假單胞菌至少存在三套群體感應(yīng)通路,并且不同的毒素由不同的通路控制.因此通過表型明顯的紫色桿菌篩選模型篩選出的菌株未必能夠抑制銅綠假單胞菌群體感應(yīng)系統(tǒng).所以,若后期將進(jìn)行更加深入的研究,有必要對XC22919粗提物進(jìn)行銅綠假單胞菌群體感應(yīng)系統(tǒng)抑制的驗證.通過XC22919對銅綠假單胞菌綠膿素含量和菌體生長抑制實驗同步進(jìn)行有效濃度的摸索.從圖2(a)可以看出:隨著XC22919粗提物質(zhì)量濃度的上升,綠膿素含量逐漸下降;從圖2(b)可以看出:當(dāng)XC22919粗提物的質(zhì)量濃度達(dá)到0.35 mg/mL時,菌體的生長受到明顯抑制.因此,可以得出XC22919對銅綠假單胞菌的有效質(zhì)量濃度為0.3 mg/mL,最大抑制率為31%.即XC22919粗提物質(zhì)量濃度為0～0.3 mg/mL時,對野生型銅綠假單胞菌具有群體感應(yīng)抑制活性,并且具有較好的濃度依賴性.在接下里的所有活性實驗中,都會在有效質(zhì)量濃度(不抑制銅綠假單胞菌生長)范圍內(nèi)進(jìn)行,否則就不是群體感應(yīng)抑制.

(a) XC22919對銅綠假單胞菌綠膿菌素的影響

(b) XC22919對銅綠假單胞菌生長的影響

Fig.2 Quorum sensing inhibition inPseudomonasaeruginosaby XC22919

2.3 XC22919菌株對銅綠假單胞菌彈性蛋白酶的抑制作用

彈性蛋白酶是一種可以破壞生物組織和抑制免疫系統(tǒng)的鋅金屬蛋白酶,是銅綠假單胞菌中的一個重要群體感應(yīng)表型.從圖3可以看出:XC22919粗提物在不抑制銅綠假單胞菌生長的濃度下,對彈性蛋白酶有明顯的抑制效果.隨著粗提物質(zhì)量濃度的上升,彈性蛋白酶活性逐漸降低,當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到0.3 mg/mL時,最大抑制率為30%.

2.4 XC22919菌株對銅綠假單胞菌蛋白水解酶的抑制作用

同樣,蛋白水解酶也是銅綠假單胞菌產(chǎn)生的重要毒素之一,其產(chǎn)生也受銅綠假單胞菌群體感應(yīng)系統(tǒng)控制.從圖3可以看出:XC22919粗提物在不抑制銅綠假單胞菌生長的濃度范圍內(nèi),對蛋白水解酶活性有抑制效果.當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到0.3 mg/mL時,最大抑制率為18%,并且具有較好的濃度依賴性.

2.5 銅綠假單胞菌生物被膜的定量檢測

生物體膜是銅綠假單胞菌群體感應(yīng)的重要表型之一.通過對生物體膜的抑制實驗結(jié)合生長抑制實驗可以判斷XC22919提取物是否對銅綠假單胞菌具有群體感應(yīng)抑制作用.在不抑制銅綠假單胞菌生長的濃度下,通過XC22919對銅綠假單胞菌生物被膜生長的影響,得出XC22919對銅綠假單胞菌生物被膜有明顯的抑制效果,最大抑制率為15%,并且具有較好的濃度依賴性.具體結(jié)果見圖3.

圖3 XC22919對銅綠假單胞菌相關(guān)毒素抑制結(jié)果 Fig.3 Effect of virulence inhibition in Pseudomonas aeruginosa by XC22919

3 結(jié) 論

本實驗在前期研究的基礎(chǔ)上,研究太平洋桿菌XC22919對銅綠假單胞菌相關(guān)毒素的抑制作用.銅綠假單胞菌的發(fā)病機(jī)制是向外界分泌大量的有毒化合物和細(xì)胞外降解酶,這些細(xì)胞外的致病因素包括彈性蛋白酶、堿性蛋白酶、外毒素A、鼠李糖脂、綠膿菌素、生物體膜等[18].實驗數(shù)據(jù)顯示:XC22919對銅綠假單胞菌綠膿素、彈性蛋白酶、蛋白水解酶、生物體膜的最高抑制率分別為31.4%,30%,18%,15%.XC22919顯示了較好的毒素抑制活性,是很有潛力的開發(fā)群體感應(yīng)抑制劑的活性菌株.因此,在后續(xù)實驗中,我們將會對XC22919進(jìn)行規(guī)?；l(fā)酵,將發(fā)酵液進(jìn)行濃縮,然后將化合物進(jìn)行提取分離純化,以期得到抑制群體感應(yīng)的有效化合物,為群體感應(yīng)抑制劑的進(jìn)一步研究和開發(fā)提供基礎(chǔ).

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(責(zé)任編輯：朱小惠)

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The inhibition of virulence factors production inPseudomonasaeruginosabyOceanobacillussp.

CHEN Xiaochun1, YAN Yinchun1, ZHANG Jiasheng1, ZHU Jinxin1, ZHANG Huawei1, WANG Hong1,2

(1. College of Pharmaceutical Science, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310014, China; 2. Collaborative Innovation Center of Yangtze River Delta Region Green Pharmaceuticals, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310014, China)

In order to investigate the virulence factors inhibition ofOceanobacillussp. XC22919 in wild strainPseudomonasaeruginosa(PAO1) which were regulated by quorum sensing system and the inhibitory effect, PAO1 was used to test the virulence factors inhibition activity of crude extract ofOceanmbacillussp. XC22919 without affecting the growth of PAO1. The results showed that the highest inhibition rate of pyocyanin, elastase, azocasein, biofilm formation in PAO1 was 31%, 30%, 18% and 15%, respectively. The result indicated that the crude extract ofOceanobacillussp.XC22919 could inhibit the virulence factors of PAO1 and suggested that XC22919 has good potential in screening quorum sensing inhibitors. The results were helpful for the study of new antibiotics.

Oceanobacillussp.;quorum sensing inhibitor;Pseudomonasaeruginosa;virulence

2017-03-02

國家自然科學(xué)基金資助項目(21337005);浙江省自然科學(xué)基金資助項目(LY16H300008);浙江省自然科學(xué)基金資助項目(LY16H300007)

陳小春(1991—),女,浙江臨安人,碩士研究生,研究方向為海洋微生物發(fā)酵及其次級代謝產(chǎn)物,E-mail:1325198995@qq.com.通信作者:王鴻教授,E-mail:hongw@zjut.edu.cn.

Q936

A

1674-2214(2017)01-0025-05