麥胚蛋白對(duì)系統(tǒng)性紅斑性狼瘡的作用機(jī)制及其功能分析

黃繼紅,紀(jì)小國(guó),張業(yè)奇,趙 祎

(河南工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院,河南 鄭州 450001)

麥胚蛋白對(duì)系統(tǒng)性紅斑性狼瘡的作用機(jī)制及其功能分析

黃繼紅,紀(jì)小國(guó),張業(yè)奇,趙 祎

(河南工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院,河南 鄭州 450001)

系統(tǒng)性紅斑性狼瘡(Systemic lupus erythematosus, SLE)因人體免疫系統(tǒng)失調(diào)導(dǎo)致人體自身形成抗體來(lái)對(duì)抗自身的器官或組織,現(xiàn)有治療手段都有嚴(yán)重的不良反應(yīng).根據(jù)麥胚的蛋白質(zhì)全譜,使用GO功能注釋和KEGG代謝途徑對(duì)潛在的麥胚功能蛋白進(jìn)行分類(lèi)與分析,重點(diǎn)剖析了麥胚功能蛋白(組蛋白)對(duì)系統(tǒng)性紅斑狼瘡的作用機(jī)制,旨在為研究開(kāi)發(fā)植物源免疫活性蛋白提供思路和方法,同時(shí)也為醫(yī)學(xué)、生物學(xué)、食品工業(yè)方面提供寶貴的新資源.

麥胚蛋白;代謝通路分析;系統(tǒng)性紅斑性狼瘡

系統(tǒng)性紅斑性狼瘡(Systemic lupus erythematosus, SLE)是一種類(lèi)似風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)炎性疾病,因人體免疫系統(tǒng)失調(diào)導(dǎo)致人體自身形成抗體來(lái)對(duì)抗自身的器官或組織.皮膚上的病變類(lèi)似狼顴骨上的紅斑,而這個(gè)紅斑通常就像蝴蝶的形狀橫過(guò)患者的鼻翼兩側(cè)[1]，紅斑性狼瘡會(huì)造成關(guān)節(jié)和肌肉的腫脹，紅斑性狼瘡病因至今尚未有定論,大量研究顯示其發(fā)病與遺傳、內(nèi)分泌、感染、免疫異常和一些環(huán)境因素有關(guān)[2].輔助治療適用于所有系統(tǒng)性紅斑性狼瘡患者,包括心理及精神支持、避免日曬或紫外線(xiàn)照射、預(yù)防和治療感染或其他合并癥及依據(jù)病情選用適當(dāng)?shù)腻憻挿绞剑幬镏委煱?1) 非甾體類(lèi)抗炎藥(NSAIDS),適用于有低熱、關(guān)節(jié)癥狀、皮疹、心包炎及胸膜炎的患者,有血液系統(tǒng)病變者慎用;2) 抗瘧藥氯喹或羥基氯喹,對(duì)皮疹、低熱、關(guān)節(jié)炎、輕度胸膜炎和心包炎、輕度貧血和血白細(xì)胞計(jì)數(shù)減少及合并干燥綜合征者有效,有眼炎者慎用;3) 糖皮質(zhì)激素?fù)?jù)病情選用不同的劑量和劑型;4) 免疫抑制劑環(huán)磷酰胺(CTX)、硫唑嘌呤口服、甲氨蝶呤(MTX)靜脈注射或口服、環(huán)孢素A(CSA)口服、長(zhǎng)春新堿靜脈注射等，其他治療有大劑量免疫球蛋白沖擊、血漿置換,適用于重癥患者,常規(guī)治療不能控制或不能耐受,或有禁忌癥者[3].上述任何一種治療都有不良反應(yīng),如有消化道不適、骨髓抑制、肝臟損害及過(guò)敏反應(yīng)等.激素的不良反應(yīng)有類(lèi)庫(kù)欣征、糖尿病、高血壓、抵抗力低下并發(fā)的各種感染、應(yīng)激性潰瘍、無(wú)菌性骨壞死、骨質(zhì)疏松及兒童生長(zhǎng)發(fā)育遲緩或停滯等[4].本課題組前期通過(guò)研究麥胚蛋白的全蛋白質(zhì)組學(xué)發(fā)現(xiàn),麥胚蛋白中小分子免疫活性蛋白約90%,具有免疫力調(diào)節(jié)、抗炎、抗氧化等生理活性[5-6],可作為植物源的免疫調(diào)節(jié)劑.

麥胚占整個(gè)小麥籽粒的3%,我國(guó)目前年蘊(yùn)藏量為420～480萬(wàn)噸,而利用率卻不足2%,開(kāi)發(fā)潛力巨大[7].麥胚在我國(guó)很早以前就作為藥用,如明代醫(yī)書(shū)《免疫類(lèi)方》記載的補(bǔ)虛、免除疫癘、強(qiáng)氣力功效.麥胚作為植物免疫調(diào)節(jié)劑的研究,對(duì)驗(yàn)證和挖掘我國(guó)傳統(tǒng)藥學(xué)具有重要意義.

1 材料和方法

1.1 材 料

脫脂麥胚,河南漫天雪食品有限公司;三氟乙酸(TFA),Fluka公司;冰乙醇、生理鹽水等常規(guī)試劑.

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

SHA-CA數(shù)顯水浴恒溫振蕩器,常州普天儀器制造有限公司;TDL-5-A離心機(jī),上海安亭科學(xué)儀器廠(chǎng);752N型紫外線(xiàn)可見(jiàn)光光度計(jì),上海精密科學(xué)儀器有限公司;雷磁pH計(jì)PHS-3E,上海精密科學(xué)儀器有限公司;HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋,河南智誠(chéng)科技發(fā)展有限公司;5810R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī),德國(guó)Eppendorf公司;Neofuge 15R型高速冷凍離心機(jī),上海力申科學(xué)儀器有限公司;實(shí)驗(yàn)型膜分離設(shè)備(雙工位平板膜),賽普(無(wú)錫)膜科技發(fā)展有限公司;LTQ Velos雙壓線(xiàn)性離子阱質(zhì)譜儀,Thermo Finnigan, San Jose, CA;Thermo scientific EASY column(100 μm×2 cm, 5 μm-C18)/Thermo scientific EASY column(75 μm×100 mm, 3 μm-C18),Agilent Technologies, Wilmington, DE.

1.3 試驗(yàn)方法

關(guān)于麥胚球蛋白的篩選以及與系統(tǒng)性紅斑性狼瘡的相關(guān)性研究,目前國(guó)內(nèi)外均未檢索到相關(guān)報(bào)道.本文根據(jù)麥胚球蛋白的蛋白質(zhì)全質(zhì)譜定性與定量分析,通過(guò)肽(Peptide)、蛋白質(zhì)(Protein)、KEGG代謝途徑(Metabolic pathway)、GO(Gene ontology)等數(shù)據(jù)庫(kù),以構(gòu)建麥胚功能蛋白與系統(tǒng)性紅斑性狼瘡的代謝關(guān)系、分析其作用機(jī)制.

1.3.1 麥胚球蛋白提取

1) 麥胚用純凈水配制成10%的懸濁液,經(jīng)自然發(fā)酵24 h后,離心取上清液經(jīng)電泳初步判斷分子量范圍,為純化做準(zhǔn)備;2) 粗提液(上清液)參照刁大鵬等[8-9]粗提麥胚球蛋白工藝.取500 μL麥胚球蛋白粗提液加1 mL 90%的冰乙醇,-20 ℃沉淀2 h,8 000 r/min離心5 min,棄上清，得到沉淀加入1 mL 17%冰乙醇,-20 ℃沉淀2 h,8 000 r/min離心5 min,棄上清.取二次沉淀,加入1 mL 25%冰乙醇,-20 ℃沉淀2 h,8 000 r/min離心5 min,棄上清,得到的沉淀用適量的0.9%的鹽水進(jìn)行復(fù)溶,調(diào)配成不同濃度的蛋白質(zhì)溶液,0.22 μm微膜過(guò)濾除菌,4 ℃?zhèn)溆?

1.3.2 基于質(zhì)譜技術(shù)麥胚球蛋白組學(xué)分析

質(zhì)譜流程參照Monaghan[10]和Hentze[11]等的文獻(xiàn),進(jìn)樣方式為納米噴霧,毛細(xì)管溫度為200 ℃,檢測(cè)方式為正離子,多肽和多肽的碎片的質(zhì)量電荷比,每次全掃描后采集10個(gè)碎片圖譜(MS2 scan).

1.3.3 分析軟件

質(zhì)譜測(cè)試原始文件(raw file)用Mascot 2.2軟件檢索Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù),功能使用GO注釋,代謝途徑分析使用KEGG數(shù)據(jù)庫(kù).

2 結(jié)果與分析

2.1 麥胚球蛋白蛋白組學(xué)分析

麥胚球蛋白經(jīng)胰蛋白酶水解后的多肽混合物通過(guò)LC-MS/MS分析,得到麥胚球蛋白樣品酶解液的總離子流色譜圖(Basepeak圖).圖1是將每個(gè)時(shí)間點(diǎn)質(zhì)譜圖中信號(hào)最強(qiáng)肽段的強(qiáng)度連續(xù)描繪得到的圖譜，橫坐標(biāo)為肽段保留時(shí)間,縱坐標(biāo)為質(zhì)譜信號(hào)強(qiáng)度,數(shù)字標(biāo)記分別為信號(hào)峰強(qiáng)度最高肽段的保留時(shí)間和質(zhì)荷比.LC-MS/MS分析,是將酶解后的肽段先經(jīng)過(guò)色譜柱進(jìn)行分離,洗脫的肽段再進(jìn)入質(zhì)譜檢測(cè)器中進(jìn)行一級(jí)二級(jí)質(zhì)譜分析，該方法適用于復(fù)雜樣品的分析,可以增加低豐度蛋白質(zhì)被鑒定出的幾率.Basepeak圖主要反應(yīng)樣品的色譜分離度、肽段信號(hào)強(qiáng)度(可以結(jié)合上樣體積判斷樣品酶解情況)、樣品蛋白質(zhì)構(gòu)成復(fù)雜程度等.如果從色譜圖上看到在不同時(shí)間洗脫的峰較多,而且相對(duì)豐度較高,則說(shuō)明樣品肽段種類(lèi)較多,復(fù)雜程度較高,即試驗(yàn)用的麥胚球蛋白樣品肽段種類(lèi)豐富,復(fù)雜程度高.通過(guò)肽段逆推所得的蛋白質(zhì)按可信度從低到高依次排列,保守性或同源性較高的蛋白質(zhì)歸為同一蛋白質(zhì)組,得到584個(gè)蛋白質(zhì)組,包括1 575個(gè)蛋白.經(jīng)與數(shù)據(jù)庫(kù)查詢(xún)比對(duì)可知,麥胚球蛋白主要由麥胚球蛋白家族、熱休克蛋白(HSPs)、組蛋白、冷調(diào)節(jié)蛋白、非特異性脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白、α-淀粉酶抑制劑、類(lèi)燕麥蛋白、麥醇蛋白、木聚糖酶抑制蛋白、晚期胚胎富集蛋白、類(lèi)甜蛋白、防御素、蛋白酶類(lèi)及一些未表征蛋白等組成.

圖1 麥胚蛋白酶解液的總離子流色譜圖Fig.1 Total ion chromatogram of wheat germ protein hydrolyzate

圖2 麥胚蛋白的GO功能注釋Fig.2 GO functional annotation of wheat germ protein

2.2 功能GO和代謝途徑KEGG分析

2.2.1 功能GO分析

從圖2的GO功能注釋看出,麥胚蛋白主要參與生命活動(dòng)中重要的三部分.蛋白質(zhì)的生物合成過(guò)程,即翻譯,就是將核酸中由4種核苷酸序列編碼的遺傳信息,通過(guò)遺傳密碼破譯的方式解讀為蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)中20種氨基酸的排列順序,如:mRNA與遺傳密碼,tRNA在蛋白質(zhì)合成過(guò)程中起著運(yùn)輸氨基酸的作用，蛋白質(zhì)必須經(jīng)過(guò)不同的翻譯后復(fù)雜加工過(guò)程才轉(zhuǎn)變?yōu)樘烊粯?gòu)象的功能蛋白，麥胚蛋白參與分子功能與細(xì)胞形成有關(guān),如催化功能、結(jié)構(gòu)功能、運(yùn)輸功能、貯存功能、運(yùn)動(dòng)功能、防御功能、調(diào)節(jié)功能、信息傳遞功、遺傳調(diào)控功能等.麥胚蛋白中各種功能蛋白的比例如圖3所示.

圖3 麥胚蛋白中各種功能蛋白的比例 Fig.3 The proportion of functional proteins in wheat germ protein

2.2.2 代謝途徑KEGG分析

從NCBI等數(shù)據(jù)庫(kù)中得到經(jīng)過(guò)GO分析有功能的麥胚蛋白的基因組信息,填入KEGG數(shù)據(jù)庫(kù),并且將同一條通路上有相似功能的蛋白質(zhì)歸為一組,然后打上KO(或K)標(biāo)簽.參與系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)代謝途徑的麥胚蛋白質(zhì)在UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)登錄號(hào)為:A0A096UN69 A0A096USW9 W5A444 W5A532 W5EA78 W5F9T2 W5E0R4 W5G400 W5DKT2 W5GES9 W5GJ30 W5GUY7 W5H5H3 W5CBE7 W5EBF3 W5EQ20 W5GDX3 A0A096UJV8 W5EHG8 A0A080YUW8 W5A8H1 W5GER8 W5HYR3 A0A096UKH0 W5GE54 Q43312 A0A0C4BIL8 A0A0C4BKM5 W5BWN6 W5E570 W5BXG6,在KEGG網(wǎng)站主頁(yè)的檢索框輸入代謝通路或蛋白,會(huì)檢索出KEGG中的相關(guān)信息,并自動(dòng)顯示此麥胚蛋白參與的反應(yīng)、相關(guān)產(chǎn)物還有參與的通路信息圖,麥胚組蛋白家族H2A,H2B,H3,H4等參與的代謝通路如圖4所示.從圖4的麥胚蛋白參與SLE代謝途徑看出：JAK-STAT信號(hào)通路一條由細(xì)胞因子刺激的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,參與細(xì)胞的增殖、分化、凋亡以及免疫調(diào)節(jié)等許多重要的生物學(xué)過(guò)程，染色質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)是核小體,麥胚中的核小體由組蛋白家族的H2A,H2B,H3,H4構(gòu)成組蛋白八聚體纏繞于ds-DNA上,通過(guò)N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA中樞神經(jīng)系統(tǒng)的興奮性神經(jīng))遞質(zhì),B細(xì)胞受體信號(hào)通路,解除B細(xì)胞免疫耐受,抑制PC12細(xì)胞DNA合成從而影響細(xì)胞的增殖活性，自身抗體與麥胚中的補(bǔ)體片段(C1q,C4H和C2)相反應(yīng),使粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞具有很好的趨化作用,因而在細(xì)胞毒反應(yīng)時(shí)能很好地殺死細(xì)菌或吞噬炎癥組織.

圖4 麥胚蛋白參與系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)代謝途徑Fig.4 Wheat embryo protein participates in systemic lupus erythematosus (SLE) metabolic pathway

3 結(jié) 論

根據(jù)麥胚的蛋白質(zhì)全譜檢出結(jié)果,通過(guò)肽(Peptide)、蛋白質(zhì)(Protein)、KEGG代謝途徑(Metabolic pathway)、GO(Gene ontology)等數(shù)據(jù)庫(kù)分析,得到麥胚功能蛋白參與生物過(guò)程(合成或代謝),分子功能、細(xì)胞功能的分類(lèi),與系統(tǒng)性紅斑性狼瘡的代謝關(guān)系,重點(diǎn)剖析了水溶性麥胚功能蛋白對(duì)系統(tǒng)性紅斑狼瘡的作用機(jī)制,但是對(duì)系統(tǒng)性紅斑性狼瘡的治療機(jī)理有待進(jìn)一步系統(tǒng)深入的驗(yàn)證性研究.麥胚蛋白可以作為植物源的免疫調(diào)節(jié)劑,通過(guò)進(jìn)一步了解植物蛋白種類(lèi)的多樣性和功能的獨(dú)特性,探知植物蛋白在參與多種生命活動(dòng)的調(diào)控中發(fā)揮的重要作用,為研究開(kāi)發(fā)植物源免疫活性蛋白提供思路和方法.同時(shí)也為醫(yī)學(xué)、生物學(xué)、食品工業(yè)方面提供寶貴的新資源,為人類(lèi)健康及生態(tài)保護(hù)做出貢獻(xiàn).

[1] 成永珍.DNA免疫吸附柱治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡的護(hù)理[J].護(hù)士進(jìn)修雜志,2011,(21):1973-1974.

[2] 胡金波,谷恒存,丁志山,等.解毒祛瘀滋陰方治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡小鼠的代謝組學(xué)研究[J].中華中醫(yī)藥雜志,2014(1):60-65.

[3] 張曉婕,張爽,安惠.系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者合并巨大肩袖損傷的觀察與護(hù)理[J].護(hù)理學(xué),2016,5(2):7-12.

[4] 陳佩玲,謝倫芳.系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者床邊DNA免疫吸附治療的護(hù)理[J].護(hù)士進(jìn)修雜志,2013(3):242-244.

[5] OGAWA A, TABUCHI J, DOI Y, et al. Biofunction-assisted DNA detection through RNase H-enhanced 3′ processing of a premature tRNA probe in a wheat germ extract[J].Bioorganic & medicinal chemistry letters,2016,26(15):3658-3661.

[6] KUMRUNGSEE T, AKIYAMA S, GUO J, et al. Identification of peptides in wheat germ hydrolysate that demonstrate calmodulin-dependent protein kinase II inhibitory activity[J].Food chemistry,2016,213:329-335.

[7] 張婷,劉婉,張艷貞,等.小麥胚芽生物活性物質(zhì)及其功能特性研究進(jìn)展[J].食品科學(xué),2011,32(3):281-285.

[8] 刁大鵬,黃繼紅,李錦,等.小麥胚芽球蛋白提取工藝及分子質(zhì)量測(cè)定[J].河南工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2013,34(1):52-55.[9] 刁大鵬,黃繼紅,李錦,等.小麥胚芽清蛋白提取工藝及分子量測(cè)定[J].食品工業(yè)科技,2013,34(3):247-249.

[10] MONAGHAN P J, KEEVIL B G, STEWART P M, et al. Case for the wider adoption of mass spectrometry-based adrenal steroid testing, and beyond[J].Journal of clinical endocrinology & metabolism,2014,99(12):4434-4437.

[11] HENTZE N, MAYER M P. Analyzing protein dynamics using hydrogen exchange mass spectrometry[J].Journal of visualized experiments,2013(81):50839-50839.

(責(zé)任編輯：朱小惠)

Mechanism of wheat germ protein on systemic lupus erythematosus and its functional analysis

HUANG Jihong, JI Xiaoguo, ZHANG Yeqi, ZHAO Yi

(School of Biological Engineering, Henan University of Technology, Zhengzhou 450001, China)

Systemic lupus erythematosus (SLE) is caused by the disorder of immune system of human body forming antibodies against human own organs or tissues, and the current treatments have serious adverse reactions. According to the full spectrum of wheat germ protein, the potential functional protein of wheat germ was classified and analyzed by GO function annotation and KEGG metabolic pathway. The mechanism of wheat germ functional protein (histone) on systemic lupus erythematosus was emphatically analyzed. This provides valuable ideas and methods for the research and development of plant-derived immunologically active proteins, and also provides valuable new resources for medicine, biology and food industries.

wheat germ protein; metabolic pathway analysis; systemic lupus erythematosus

2017-01-01

河南省國(guó)際科技合作與交流項(xiàng)目(152102410032);鄭州市國(guó)際科技合作與交流項(xiàng)目(141PGJHZ546);河南工業(yè)大學(xué)谷物資源轉(zhuǎn)化與利用省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放課題(001254)

黃繼紅(1965—),女,河南鄲城人,教授級(jí)高級(jí)工程師,博士,研究方向?yàn)榘l(fā)酵工程,E-mail:huangjih1216@126.com.

R392.1

A

1674-2214(2017)01-0020-05