阿尼芬凈合成前體棘白菌素B發(fā)酵條件優(yōu)化

牛 坤,吳 豪,毛 健,鄒樹平

(浙江工業(yè)大學(xué) 生物工程研究所,浙江 杭州 310014)

阿尼芬凈合成前體棘白菌素B發(fā)酵條件優(yōu)化

牛 坤,吳 豪,毛 健,鄒樹平

(浙江工業(yè)大學(xué) 生物工程研究所,浙江 杭州 310014)

阿尼芬凈為新一代棘白菌素類抗生素,其前體物質(zhì)棘白菌素B(ECB)發(fā)酵單位的高低將直接影響阿尼芬凈的市場(chǎng)前景.利用構(gòu)巢曲霉發(fā)酵合成ECB,采用單因素實(shí)驗(yàn)考察不同參數(shù)對(duì)ECB產(chǎn)量的影響.結(jié)果顯示:低溫培養(yǎng)有利于ECB的合成,選擇前3天37 ℃培養(yǎng),后9天25 ℃培養(yǎng),ECB產(chǎn)量可達(dá)1 237 mg/L,比25 ℃恒溫培養(yǎng)提高了69.9%;最佳的初始pH為6.5;添加0.6 g/L ZnCl2可使ECB產(chǎn)量達(dá)到1 100 mg/L,比初始發(fā)酵培養(yǎng)基提高了69.2%;前體物質(zhì)脯氨酸及鳥氨酸的添加可以顯著提高ECB產(chǎn)量,在第6天添加2 g/L脯氨酸或在第3天添加2 g/L鳥氨酸可使ECB產(chǎn)量分別提高57.4%和55.2%.

棘白菌素B;構(gòu)巢曲霉;發(fā)酵;條件優(yōu)化

棘白菌素類抗生素是20世紀(jì)70年代發(fā)現(xiàn)的一組天然產(chǎn)物,具有類似的環(huán)狀多肽核心和不同的脂肪酸側(cè)鏈,能夠非競(jìng)爭(zhēng)性地抑制真菌細(xì)胞壁β-1,3-葡聚糖合成酶的活性,從而達(dá)到抗真菌的目的[1].FDA已批準(zhǔn)上市的這類藥物包括卡泊芬凈(Caspofungin)、米卡芬凈(Micafungin)和阿尼芬凈(Anidulafungin),其中前兩者已在國(guó)內(nèi)上市,阿尼芬凈已在國(guó)內(nèi)臨床中[2-3].阿尼芬凈是由前體化合物棘白菌素B(ECB)經(jīng)猶他游動(dòng)放線菌產(chǎn)生的酰化酶作用脫去側(cè)鏈亞油?；?然后在DMF中與活性中間體4″-戊氧基-[1,1′,4′,1″]三苯基-4-甲酸-2,4,5-三氯-苯基酯反應(yīng)制得.ECB與阿尼芬凈的化學(xué)結(jié)構(gòu)式[4]分別為ECB是合成阿尼芬凈的主要前體化合物,其發(fā)酵單位的高低將直接影響阿尼芬凈的市場(chǎng)前景.根據(jù)文獻(xiàn)和專利報(bào)道,目前國(guó)內(nèi)外ECB均是利用微生物發(fā)酵制備,其中主要是以構(gòu)巢曲霉(Aspergillusnidulans)進(jìn)行發(fā)酵[5-6].Papagianni等[7]綜述了發(fā)酵過程中接種量、碳氮源種類及濃度、pH、溫度和攪拌速率等因素對(duì)構(gòu)巢曲霉生長(zhǎng)的影響,當(dāng)溫度從23 ℃提高至37 ℃后,構(gòu)巢曲霉的比生長(zhǎng)速率從1.54 h-1增加至3.24 h-1,菌體生長(zhǎng)加快,可見提高溫度有利于構(gòu)巢曲霉的生長(zhǎng).Benz等[8]通過紅外、核磁共振等方法確定了ECB的分子結(jié)構(gòu),且發(fā)現(xiàn)其水解成分中包括了亞油酸、4-羥基-L-脯氨酸、4-羰基-L-脯氨酸、L-蘇氨酸、(2S,3S,4S)-4-甲基-3-羥脯氨酸等,并且發(fā)酵培養(yǎng)基中添加碳酸鹽、磷酸鹽、硫酸鹽及硝酸鹽等組分對(duì)ECB產(chǎn)量的提高均有促進(jìn)作用.目前,關(guān)于ECB發(fā)酵的文獻(xiàn)報(bào)道較少,國(guó)內(nèi)尚無企業(yè)生產(chǎn)阿尼芬凈,導(dǎo)致其市場(chǎng)壟斷、價(jià)格高.因此,現(xiàn)階段對(duì)阿尼芬凈的高效生產(chǎn)技術(shù)進(jìn)行研發(fā),實(shí)現(xiàn)其國(guó)產(chǎn)化,將有助于打破國(guó)際制藥企業(yè)的壟斷,為患者提供價(jià)廉質(zhì)優(yōu)的抗真菌藥物,具有重要的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益.筆者采用單因素實(shí)驗(yàn),初步考察了發(fā)酵溫度、初始pH、金屬離子和前體等對(duì)ECB發(fā)酵過程的影響,以確定最優(yōu)發(fā)酵條件,為阿尼芬凈的工業(yè)化生產(chǎn)奠定堅(jiān)實(shí)的數(shù)據(jù)基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 菌 種

構(gòu)巢曲霉AspergillusnidulansZJB09223,由本實(shí)驗(yàn)保藏.

1.2 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基:PDA培養(yǎng)基.

種子培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖10,甘油10,棉籽粉25,pH 6.8～7.0,121 ℃滅菌20 min.

初始發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):花生油20,甘油10,蛋白胨10,L-脯氨酸1,甘露醇90,豆粉40,K2HPO4·3H2O 8,MgSO4·7H2O 0.5,MnSO4·H2O 0.1,FeSO4·7H2O 0.05,CaCl20.3,pH 7.0,121 ℃滅菌20 min.

1.3 主要儀器與設(shè)備

恒溫調(diào)速搖床(上海杜科自動(dòng)化設(shè)備有限公司DKY-1);高效液相色譜(日本SHIMADZU);高壓蒸汽滅菌鍋(日本SANYO,MLS-3780);電子分析天平(上海精密儀器儀表有限公司FA2004);高速冷凍離心機(jī)(美國(guó)Bechman Coulter,X-22).

1.4 培養(yǎng)方法

1.4.1 斜面培養(yǎng)

將傳好種的斜面置于25 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8～16 d,菌落表面呈現(xiàn)墨綠色后取出置于15～20 ℃室溫,繼續(xù)培養(yǎng),一般5～20 d都可接種用于種子培養(yǎng).

1.4.2 種子液培養(yǎng)

接種后的種子培養(yǎng)基在220 r/min,25 ℃條件下培養(yǎng)2 d.

1.4.3 搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)

發(fā)酵溫度、初始pH、金屬離子及前體物質(zhì)添加等實(shí)驗(yàn)均在搖瓶中進(jìn)行.按照10%接種量進(jìn)行接種,接種后在220 r/min,25 ℃條件下培養(yǎng)12 d,第6天起定時(shí)取樣測(cè)定ECB產(chǎn)量.每個(gè)條件做3個(gè)平行樣,最終結(jié)果取平均值.

1.5 分析方法

發(fā)酵液預(yù)處理:取1 mL發(fā)酵液12 000 r/min離心8 min,棄上清.所得菌體加入1 mL甲醇,25 ℃振蕩萃取30 min,12 000 r/min離心8 min,留上清液備用.殘留菌體中再加入1 mL甲醇重復(fù)萃取,25 ℃振蕩搖勻30 min,12 000 r/min離心8 min,所得上清液與前一步上清液合并,12 000 r/min離心2 min,上清液用0.45 μm水膜過濾,進(jìn)行檢測(cè).

高效液相色譜(HPLC)檢測(cè):產(chǎn)物ECB采用HPLC進(jìn)行檢測(cè),色譜柱為ODS-C18柱(大連依利特,4.6 mm×250 mm,5 μm),流動(dòng)相為V(乙腈)∶V(甲醇)∶V(水)=2∶7∶1,流速為1.0 mL/min,紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為222 nm,進(jìn)樣量20 μm,柱溫40 ℃.

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵溫度對(duì)ECB產(chǎn)量的影響

發(fā)酵溫度是影響菌體生長(zhǎng)和代謝的關(guān)鍵因素,本實(shí)驗(yàn)著重考察了溫度對(duì)產(chǎn)物ECB的影響.圖1結(jié)果表明:發(fā)酵溫度由25 ℃提高至37 ℃的過程中,ECB的質(zhì)量濃度隨溫度的升高呈現(xiàn)降低的趨勢(shì);最佳發(fā)酵溫度為25 ℃,此時(shí)ECB最高質(zhì)量濃度為728 mg/L;而當(dāng)溫度提高至37 ℃后,基本無ECB產(chǎn)生,由此可知低溫有利于ECB的合成.

圖1 發(fā)酵溫度對(duì)ECB產(chǎn)量的影響Fig.1 Effect of temperature on the production of ECB

實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)溫度過低不利于菌體生長(zhǎng),因此本實(shí)驗(yàn)考慮在培養(yǎng)過程中進(jìn)行溫度的調(diào)節(jié),以得到最佳的溫度控制方式.實(shí)驗(yàn)開始(第0天)在25,28，37 ℃條件下進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng),然后分別在第3天、第6天和第9天進(jìn)行溫度調(diào)節(jié),具體調(diào)節(jié)方式為:由28 ℃和37 ℃調(diào)節(jié)至25 ℃,培養(yǎng)至發(fā)酵結(jié)束;由25 ℃調(diào)節(jié)至28 ℃,培養(yǎng)至發(fā)酵結(jié)束.分別測(cè)定ECB質(zhì)量濃度,結(jié)果如表1所示.從表1可以看出:前3天采用較高溫度(28～37 ℃)培養(yǎng),后續(xù)采用低溫(25 ℃)培養(yǎng),ECB質(zhì)量濃度有較大的提高;前3天采用37 ℃培養(yǎng),之后降低溫度至25 ℃培養(yǎng),ECB發(fā)酵質(zhì)量濃度由728 mg/L提高至1 237 mg/L,比25 ℃恒溫培養(yǎng)提高了69.9%.這可能是由于ECB的發(fā)酵過程為生長(zhǎng)非偶聯(lián)型,在發(fā)酵前3天采用37 ℃培養(yǎng)可以使菌體大量快速生長(zhǎng),而3天后ECB開始合成,此時(shí)降低溫度則有利于ECB的產(chǎn)生.研究也表明構(gòu)巢曲霉比生長(zhǎng)速率會(huì)隨溫度的升高而升高,但是溫度升高后菌體出現(xiàn)失水加劇的現(xiàn)象,最終會(huì)導(dǎo)致目標(biāo)化合物的合成量降低,這與本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果一致,而實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明通過這種溫度調(diào)節(jié)方式可以使ECB的質(zhì)量濃度顯著增加[7].

表1 不同溫度調(diào)節(jié)方式及調(diào)節(jié)時(shí)間對(duì)ECB產(chǎn)量的影響

Table 1 Effect of temperature regulation on the production of ECB

溫度調(diào)節(jié)方式ECB質(zhì)量濃度/(mg·L-1)第3天調(diào)節(jié)第6天調(diào)節(jié)第9天調(diào)節(jié)28℃調(diào)至25℃1221±29644±17353±1037℃調(diào)至25℃1237±76622±14280±1525℃調(diào)至28℃664±19768±121062±68

2.2 初始pH值對(duì)ECB產(chǎn)量的影響

pH值也是影響微生物生長(zhǎng)和代謝的重要因素.由文獻(xiàn)可知:中性pH值有利于構(gòu)巢曲霉菌體生長(zhǎng)和孢子生成,而當(dāng)pH小于3時(shí)則不利于菌體生長(zhǎng),不同初始pH值對(duì)產(chǎn)物的合成也具有重要影響[7].本實(shí)驗(yàn)著重考察了初始pH值對(duì)ECB產(chǎn)量的影響.由圖2可知:在初始pH值4.5～9.5范圍內(nèi),ECB的質(zhì)量濃度呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì),最佳的初始pH值為6.5,此時(shí),ECB的發(fā)酵產(chǎn)量為1 116 mg/L;而當(dāng)pH小于6或者大于7時(shí),ECB質(zhì)量濃度會(huì)降低至500 mg/L以下.因此過酸或過堿性的環(huán)境均不適合ECB的合成.

圖2 初始pH值對(duì)ECB產(chǎn)量的影響Fig.2 Effect of initial pH on the production of ECB

2.3 金屬離子對(duì)ECB產(chǎn)量的影響

文獻(xiàn)報(bào)道,金屬離子對(duì)卡泊芬凈合成前體Pneumocandin B0的發(fā)酵具有重要影響,因此本實(shí)驗(yàn)考察了金屬離子對(duì)ECB產(chǎn)量的影響[9].圖3為最佳金屬離子濃度下ECB的發(fā)酵情況,從結(jié)果可以看出:金屬離子對(duì)ECB發(fā)酵產(chǎn)量也有重要影響,在初始發(fā)酵培養(yǎng)基中,ECB質(zhì)量濃度約為640 mg/L,Cu2+和Zn2+的添加可以使ECB的質(zhì)量濃度提高,當(dāng)添加0.6 g/L ZnCl2時(shí),ECB質(zhì)量濃度可以達(dá)到1 100 mg/L,比初始培養(yǎng)基的結(jié)果提高了69.2%,而Co2+對(duì)ECB質(zhì)量濃度的影響不大.

圖3 金屬離子對(duì)ECB產(chǎn)量的影響Fig.3 Effect of metal ion on the production of ECB

2.4 前體濃度及添加時(shí)間對(duì)ECB產(chǎn)量的影響

2.4.1 脯氨酸對(duì)ECB產(chǎn)量的影響

相關(guān)文獻(xiàn)中報(bào)道脯氨酸對(duì)真菌類微生物的生長(zhǎng)與代謝有著重要的作用[10-11].實(shí)驗(yàn)考查了不同脯氨酸質(zhì)量濃度及添加時(shí)間對(duì)ECB發(fā)酵結(jié)果的影響.以初始發(fā)酵培養(yǎng)基為對(duì)照,在不同時(shí)間向發(fā)酵液中添加脯氨酸,使其最終質(zhì)量濃度分別為2,5，8 g/L,結(jié)果如表2所示.

表2 脯氨酸濃度和添加時(shí)間對(duì)ECB產(chǎn)量的影響

Table 2 Effect of concentration and addition time of proline on the production of ECB

添加時(shí)間ECB質(zhì)量濃度/(mg·L-1)對(duì)照2g/L脯氨酸5g/L脯氨酸8g/L脯氨酸第0天540±18776±4679±24607±7第3天540±18687±27653±37573±19第6天540±18886±18796±27694±49第9天540±18840±37797±12708±7

由表2可知:第0天添加1 g/L脯氨酸的對(duì)照組,ECB質(zhì)量濃度為540 mg/L左右,而在不同添加時(shí)間下,2 g/L的脯氨酸添加量均表現(xiàn)出較好的效果;在第0天添加2 g/L脯氨酸,ECB質(zhì)量濃度最終達(dá)到780 mg/L左右,并且隨著脯氨酸質(zhì)量濃度的上升而下降;在第3天添加2 g/L脯氨酸,ECB質(zhì)量濃度最終達(dá)到700 mg/L左右;第6天添加2 g/L脯氨酸,ECB質(zhì)量濃度達(dá)到886 mg/L左右;第9天添加2 g/L脯氨酸,ECB質(zhì)量濃度則為840 mg/L左右.由上述結(jié)果可知：在第6天添加2 g/L的脯氨酸效果最佳,ECB質(zhì)量濃度比初始培養(yǎng)基提高57.4%.

2.4.2 蘇氨酸對(duì)ECB產(chǎn)量的影響

除脯氨酸之外,本實(shí)驗(yàn)還考查了不同蘇氨酸質(zhì)量濃度及添加時(shí)間對(duì)ECB發(fā)酵結(jié)果的影響.以初始發(fā)酵培養(yǎng)基為對(duì)照,在不同時(shí)間向發(fā)酵液中添加蘇氨酸,使其最終質(zhì)量濃度分別為2,5,8 g/L,結(jié)果如表3所示.由表3可知:蘇氨酸對(duì)ECB產(chǎn)量的影響較小,而且蘇氨酸質(zhì)量濃度過高(8 g/L)會(huì)抑制ECB的合成,不同時(shí)間添加蘇氨酸均使ECB的質(zhì)量濃度降低,因此選擇蘇氨酸的最終添加質(zhì)量濃度2 g/L;由添加時(shí)間看出,選擇在第0天(發(fā)酵初始)添加蘇氨酸,可使ECB質(zhì)量濃度由524 mg/L提高至639 mg/L左右,產(chǎn)量提高了21.9%.

表3 蘇氨酸濃度和添加時(shí)間對(duì)ECB產(chǎn)量的影響

Table 3 Effect of concentration and addition time of threonine on the production of ECB

添加時(shí)間ECB質(zhì)量濃度/(mg·L-1)對(duì)照2g/L蘇氨酸5g/L蘇氨酸8g/L蘇氨酸第0天524±4639±17563±24533±7第3天524±4629±27603±37485±19第6天524±4575±11565±13460±13第9天524±4540±37668±12515±7

2.4.3 鳥氨酸對(duì)ECB產(chǎn)量的影響

本實(shí)驗(yàn)還考查了不同鳥氨酸質(zhì)量濃度及添加時(shí)間對(duì)ECB發(fā)酵結(jié)果的影響.以初始添加2 g/L脯氨酸的發(fā)酵培養(yǎng)基為對(duì)照,在不同時(shí)間向發(fā)酵液中添加鳥氨酸,使其最終質(zhì)量濃度分別為2,5，8 g/L,結(jié)果如表4所示.表4表明:在第3天添加2 g/L鳥氨酸時(shí),ECB質(zhì)量濃度會(huì)有大幅度提高,最終質(zhì)量濃度達(dá)到1 204 mg/L左右,比對(duì)照組提高了55.2%;在發(fā)酵第6天添加鳥氨酸時(shí),ECB質(zhì)量濃度會(huì)隨鳥氨酸質(zhì)量濃度的增加而增加,添加8 g/L鳥氨酸可以使ECB質(zhì)量濃度提高至1 173 mg/L左右,而在第9天添加鳥氨酸則對(duì)ECB的質(zhì)量濃度影響不大.因此,分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果本實(shí)驗(yàn)選擇在發(fā)酵第3天添加2 g/L鳥氨酸.

表4 鳥氨酸濃度和添加時(shí)間對(duì)ECB產(chǎn)量的影響

Table 4 Effect of concentration and addition time of ornithine on the production of ECB

添加時(shí)間ECB質(zhì)量濃度/(mg·L-1)對(duì)照2g/L蘇氨酸5g/L蘇氨酸8g/L蘇氨酸第0天776±41019±60632±19285±12第3天776±41204±68740±42365±25第6天776±4910±121002±151173±44第9天776±4895±43885±44912±27

3 結(jié) 論

采用單因素實(shí)驗(yàn)對(duì)抗真菌藥物阿尼芬凈的前體物質(zhì)ECB的發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化,得到結(jié)果如下:高溫有利于菌體生長(zhǎng),低溫培養(yǎng)有利于ECB的合成,選擇在前3天37 ℃培養(yǎng),后9天25 ℃培養(yǎng),可以使ECB的最終質(zhì)量濃度達(dá)到1 237 mg/L,比25 ℃恒溫培養(yǎng)提高了69.9%;最佳初始pH為6.5,pH小于6或大于7均不利于ECB的合成;金屬離子Cu2+和Zn2+有利于ECB的合成,而Co2+對(duì)ECB合成的促進(jìn)作用不大,添加0.6 g/L ZnCl2可以使ECB的質(zhì)量濃度提高69.2%;最佳前體物質(zhì)為脯氨酸與鳥氨酸,選擇在發(fā)酵第6天和第3天添加2 g/L脯氨酸和鳥氨酸,ECB發(fā)酵產(chǎn)量分別達(dá)到850，1 204 mg/L.在上述最優(yōu)發(fā)酵條件,ECB發(fā)酵單位可以達(dá)到1 200 mg/L以上.通過對(duì)ECB發(fā)酵過程中基本培養(yǎng)條件的優(yōu)化,提高了ECB的發(fā)酵產(chǎn)量,為阿尼芬凈的工業(yè)化提供了一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ),當(dāng)然筆者所涉及的只是初步工作,今后還有許多工作需要進(jìn)行,例如發(fā)酵罐實(shí)驗(yàn)的優(yōu)化與放大,而本實(shí)驗(yàn)也為今后工作的展開提供參考.

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(責(zé)任編輯：朱小惠)

Optimization of fermentation conditions for Echinocandin B

NIU Kun, WU Hao, MAO Jian, ZOU Shuping

(Institute of Bioengineering, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310014, China)

Anidulafungin is a new echinocandin antifungal agent, and its market prospect is greatly impacted by the fermentation yield of its precursor Echinocandin B (ECB). ECB was produced byAspergillusnidulans, and the effect of fermentation conditions on ECB production was investigated by single factor experiment in this paper. The results indicated that lower temperature was in favor of ECB production, and whenA.nidulanswas cultured at 37 °C for the first three days and 25 °C for the following nine days, yield of ECB reached 1 237 mg/L, which was 69.9% higher than that cultured at 25 °C. The optimal initial pH was 6.5. And the yield of ECB reached 1 100 mg/L by adding 0.6 g/L ZnCl2, which was 69.2% higher than control. The yield of ECB was enhanced remarkably by addition of proline and ornithine, and it could be improved by 57.4% and 55.2% through the addition of 2 g/L proline at the 6thdays or 2 g/L ornithine at the 3rddays.

Echinocandin B;Aspergillusnidulans; fermentation; optimization of culture conditions

2016-03-29

國(guó)家科技重大專項(xiàng)項(xiàng)目(2012YQ15008713)

牛 坤(1982—),女,山東新泰人,副教授,博士,研究方向?yàn)槲⑸锇l(fā)酵代謝調(diào)控,E-mail:niukun@zjut.edu.cn.

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1674-2214(2017)01-0011-05