平榛花粉活力測定方法比較

袁寶東

(遼寧省北鎮(zhèn)市五峰林場，遼寧 錦州 121315)

平榛花粉活力測定方法比較

袁寶東

(遼寧省北鎮(zhèn)市五峰林場，遼寧 錦州 121315)

采用TCC染色法、I2-KI染色法和固體培養(yǎng)基萌發(fā)法等3種常見的花粉活力測定方法對新采集的平榛花粉進行活力測定，結果表明：采用TCC染色法和I2-KI染色法染色后花粉的辨識度低，影響對花粉活力的判斷；固體培養(yǎng)基萌發(fā)法辨識度高，萌發(fā)率高，適合作為平榛花粉活力測定方法。

平榛；花粉活力；萌發(fā)率；染色法

平榛(CorylusheterophyllaFisch.)是我國東北地區(qū)重要的野生資源，具有良好的經濟價值，在黑龍江、吉林和遼寧山區(qū)廣泛分布[1]。由于其果實豐富的營養(yǎng)價值，不論是鮮果還是加工產品均深受人們喜愛[2]。隨著研究的深入，平榛不僅形成了自身的栽培管理模式，還由于其抗寒性強等優(yōu)點而被用作育種親本。不管在栽培中配置授粉樹還是作為父本用于雜交育種，都需要明確種質資源的花粉萌發(fā)能力。目前關于平榛花粉活力的測定方法尚未開展系統(tǒng)研究。鑒于此，筆者參照杜鵑[3]、玉米[4]、木薯[5]、韭菜[6]等植物花粉活力測定方法對平榛花粉活力測定方法進行比較，旨在為建立快速有效的平榛花粉活力測定方法，為人工授粉育種和授粉樹配置提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2015年3月在遼寧省鐵嶺市黃金溝地區(qū)，采集待開放的雄花花序的健壯枝條。采集后送往實驗室陰涼處水培1 d后收集新鮮花粉。待花藥散出花粉粒后，收集花粉粒于5 mL試管內并用錫箔紙包裹保存在-20 ℃環(huán)境下以備實驗，使用時取出室溫放置1 h。

1.2 試劑和儀器

碘(I2)、碘化鉀(KI)、氯化三苯基四氮唑(TCC)、蔗糖、瓊脂糖等試劑及耗材，購自上海生物工程有限公司。培養(yǎng)箱為上海精密儀器儀表有限公司生產的LHS-100CH。

1.3 試驗方法

TCC染色法：在載玻片上涂勻花粉后加1滴TTC溶液并蓋上蓋玻片。將樣品放置于20 ℃培養(yǎng)箱，10 min后取出進行顯微觀察。凡染為紅色的活力強，淡紅的次之，無色者為無活力花粉或不育花粉。

I2-KI染色法：將少量花粉均勻置于載玻片后加1滴I2-KI溶液，2 min后取出顯微觀察。凡染成藍紫色的為發(fā)育好、活力強的花粉,呈黃褐色的為發(fā)育不良的花粉。

固體培養(yǎng)基萌發(fā)法：培養(yǎng)基的配制參照胡適宜的方法[7]。培養(yǎng)基設置如下：0.7%瓊脂，4個蔗糖濃度水平(5%、10%、15%和20%)，3個硼酸濃度水平(0.010 mg·mL-1、0.025 mg·mL-1和0.050 mg·mL-1)。培養(yǎng)基熔解后倒入培養(yǎng)皿內。冷卻后，用牙簽蘸取少量花粉均勻彈在培養(yǎng)基上，帶花粉的培養(yǎng)基放置于20 ℃恒溫恒濕箱中培養(yǎng)24 h。顯微鏡下測定萌發(fā)率，萌發(fā)的花粉數總數與觀察的花粉總數比值即為花粉萌發(fā)率。

以上3種方法均在4倍顯微鏡下，隨機選取5～10個花粉數大于20的視野，要求觀察花粉總數大于200。每種方法重復3次，每次檢測花粉數量200個以上。

2 結果與分析

2.1 培養(yǎng)基條件對平榛花粉萌發(fā)率的影響

試驗中，選用4水平蔗糖濃度及3水平硼酸濃度的培養(yǎng)基，分別培養(yǎng)平榛花粉并測定其萌發(fā)率，結果見圖1。從圖1可以看出，同水平硼酸濃度下，當蔗糖濃度在5%～15%區(qū)間內，花粉萌發(fā)率隨蔗糖濃度的增加而逐漸升高；當蔗糖濃度超過15%時，萌發(fā)率隨蔗糖濃度的增加而降低。15%時花粉萌發(fā)率均為最高值，萌發(fā)率分別為84.3%、73.9%和82.1%。實驗結果表明，同水平蔗糖濃度下，硼酸濃度對平榛花粉萌發(fā)作用規(guī)律不明顯。15%蔗糖濃度條件下，最佳硼酸濃度為0.01 mg·mL-1，此時花粉萌發(fā)率最高，達到84.3%。

圖1 不同蔗糖、硼酸濃度對平榛花粉萌發(fā)率的影響

2.2 不同方法測定平榛花粉生活力的比較

采用TTC染色法，花粉均呈淡紅色，顏色的深淺差異不顯著，對花粉?；盍顩r辨識困難。采用I2-KI染色法，花粉呈藍色，顏色的深淺差異同樣不顯著，辨識度差。此外，從表1可知，采用染色法的測定結果均低于固體培養(yǎng)基萌發(fā)法。固體培養(yǎng)基萌發(fā)法與以上2種染色方法相比，花粉萌發(fā)率測定值最高，且不必通過花粉的顏色辨識花粉活力情況，判斷方法客觀、準確。因此，固體培養(yǎng)基萌發(fā)法比TCC法和I2-KI法更適用于平榛花粉活力的測定。

表1 不同方法對平榛花粉生活力的測定比較

3 結論與討論

比較3種測定平榛花粉生活力方法發(fā)現，固體培養(yǎng)基萌發(fā)法比TCC染色法和I2-KI染色法更易掌握，結果準確性更高，更適合作為平榛花粉活力的標準測定方法。2種染色法測定花粉的生活力雖然具有步驟簡單的優(yōu)點，但測定結果低于固體培養(yǎng)基的測定方法，這可能與花粉壁厚度有關，增加了測定的誤差。

在比較蔗糖和硼酸濃度對平榛花粉生活力的影響時發(fā)現：一定范圍內，隨蔗糖濃度的提高花粉萌發(fā)率也增加，超過此范圍就則相反。這是因為蔗糖不僅為花粉管的萌發(fā)提供能量，同時還參與細胞內外的滲透壓平衡。當蔗糖濃度在未打破滲透壓平衡時，隨著濃度的增加花粉營養(yǎng)供給越充分，花粉萌發(fā)率越高；當蔗糖濃度達到并超過一定值后會打破這種平衡，使細胞脫水而抑制花粉萌發(fā)。硼元素對于花粉也很重要，這是因為硼的缺乏會導致花粉粒中脫氫酶活性降低而使呼吸作用受到抑制，最終影響花粉萌發(fā)。本研究未發(fā)現硼酸濃度對平榛花粉萌發(fā)的作用規(guī)律性，這可能因為一定蔗糖濃度條件下花粉對硼元素的需求存在差異。

[1] 梁維堅,董德芬.大果榛子育種與栽培[M].北京:中國林業(yè)出版社,2002

[2] 姜殿勤,王素玲,張儉衛(wèi).野生平棒綜合開發(fā)利用初探[J].特種經濟動植物,2005(10):19-20

[3] 張超儀,耿興敏.六種杜鵑花屬植物花粉活力測定方法的比較研究[J].植物科學學報,2012,30(1):92-99

[4] 王燕哲,崔彥宏,張麗華,等,玉米花粉活力測定方法的比較研究[J].玉米科學,2010,18(3):173-176

[5] 俞奔馳,李軍,盤歡,等.木薯花粉活力測定及驗證試驗[J].廣東農業(yè)科學,2012,(13):25-27

[6] 汪妮,張志軒,董自梅.韭菜花粉生活力測定方法的篩選研究[J].長江蔬菜,2009,(2):53-54

[7] 胡適宜.花粉生活力的測定[J].植物學通報,1993,70(2):60-62

Comparison of Determination Methods of Pollen Viability ofCorylusheterophylla

Yuan Baodong

(Wufeng Forest Farm,Beizhen City,Liaoning Province,Jinzhou 121315,China)

The activity of fresh pollen was measured by adopting TCC staining,I2-KI staining & solid medium germination method.Result shows that the identifiability is low after adopting TCC staining,I2-KI staining,which affect the judgement of pollen vigor;adopting solid medium method can obtain high identifiability,which can be determination method for pollen vigor ofCorylusheterophylla.

Corylusheterophylla; pollen vitality; germination rate; staining method

1005-5215(2017)03-0024-02

2017-01-03

袁寶東(1968-),男，遼寧錦州人，大學，工程師，現從事林業(yè)資源保護工作.

Q944.42

A

10.13601/j.issn.1005-5215.2017.03.009