楊樹次生壁纖維素合酶的表達(dá)與互作模式分析

魏凱莉，周厚君,江 成,趙巖秋，宋學(xué)勤,2*，盧孟柱,2

(1.國家林業(yè)局林木培育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所，北京 100091; 2.南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，南京林業(yè)大學(xué),南京 210037)

楊樹次生壁纖維素合酶的表達(dá)與互作模式分析

魏凱莉1，周厚君1,江 成1,趙巖秋1，宋學(xué)勤1,2*，盧孟柱1,2

(1.國家林業(yè)局林木培育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所，北京 100091; 2.南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，南京林業(yè)大學(xué),南京 210037)

[目的]纖維素的合成在木材形成過程中具有重要的作用，纖維素合酶(Cellulose Synthase，CESA)是參與纖維素合成的關(guān)鍵酶。由于3種CESA形成一個(gè)有功能的纖維素合酶復(fù)合體，而楊樹中包含CESA4、CESA7A、CESA7B、CESA8A和CESA8B5種次生壁CESA，本文從這5種CESA的表達(dá)模式與互作分析入手，探討了其在次生壁纖維素合成中的工作模式。[方法]利用RNA-seq與基因芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行基因表達(dá)分析，揭示5種次生壁CESA在根、莖、葉組織的表達(dá)模式與次生維管再生過程中的表達(dá)變化。利用啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GUS轉(zhuǎn)基因材料GUS染色分析與實(shí)時(shí)定量PCR揭示5種次生壁CESA在各個(gè)組織的表達(dá)模式與在激素處理下的響應(yīng)模式。利用熒光素酶互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)揭示CESA7A、CESA7B、CESA8A與CESA8B之間的互作模式。[結(jié)果]基因表達(dá)分析表明，楊樹5種次生壁CESA基因在楊樹成熟莖中高表達(dá)，尤其在次生維管組織發(fā)育的后期高表達(dá)，表明其主要參與木材次生壁纖維素的合成。對啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GUS轉(zhuǎn)基因材料觀察表明，CESA4、CESA7B、CESA8A和CESA8B的GUS信號在楊樹莖和葉中較強(qiáng)，但這些次生壁CESA的表達(dá)模式存在一定的差異，這種差異在葉脈中表現(xiàn)地尤為明顯。此外，在赤霉素GA3和細(xì)胞分裂素6-BA處理下，楊樹次生壁CESA的表達(dá)量顯著上調(diào)；在生長素NAA、油菜素內(nèi)酯BR和乙烯處理下，楊樹次生壁CESA的表達(dá)量下調(diào)，但不同的CESA對激素響應(yīng)的表達(dá)量變化幅度存在差異。熒光素酶互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)表明，楊樹次生壁CESA7B和CESA8B、CESA7B和CESA8A、CESA7A與CESA8B之間存在互作，說明它們之間可以形成復(fù)合體。[結(jié)論]這些數(shù)據(jù)顯示楊樹5種次生壁CESA基因在不同組織與不同激素處理下的表達(dá)變化存在一定的差異，而它們之間均能互作，提示楊樹5個(gè)次生壁CESA基因雖然具有同等的能力形成功能性的纖維素合酶復(fù)合體，但在不同組織、不同激素作用下可能有不同的組合方式，進(jìn)而會導(dǎo)致木材成分的差異。

纖維素合酶CESA;次生壁;表達(dá)分析;互作;激素;楊樹

纖維素是植物細(xì)胞壁的主要多糖類組成成分[1]。根據(jù)細(xì)胞壁的組成成分和形成方式，可將植物細(xì)胞壁分為初生細(xì)胞壁和次生細(xì)胞壁[1]。初生細(xì)胞壁的主要成分是纖維素、半纖維素和果膠，通常在細(xì)胞板形成后開始沉積。木本植物木質(zhì)部細(xì)胞在初生細(xì)胞壁形成后，進(jìn)一步分化形成次生細(xì)胞壁。次生細(xì)胞壁的主要成分是纖維素、半纖維素和木質(zhì)素，構(gòu)成了木材的主要成分[2]。纖維素是由D-葡萄糖通過β-1,4糖苷鍵連接而成的多聚物，其分子結(jié)構(gòu)非常簡單，但合成機(jī)制卻極其復(fù)雜[3]。高等植物中纖維素的合成是在位于細(xì)胞膜上的纖維素合酶復(fù)合體(Cellulose Synthesis Complex，CSC)完成的，其中纖維素合酶(Cellulose Synthase/CESA)是CSC的主要組成成分，是參與纖維素合成的關(guān)鍵酶[3]。植物的CESA基因最早從棉花(Gossypiumhirsutum)纖維中被克隆得到[4]，隨后，其他植物中的CESA基因相繼被報(bào)道。擬南芥(Arabidopsisthaliana)基因組包含10個(gè)CESA基因，水稻(Oryzasativa)中含有8個(gè)CESA基因[5-6]。CESA蛋白序列高度保守，含有8個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，2個(gè)在N端，6個(gè)在C端[3]。在第2和第3跨膜域之間存在一個(gè)胞質(zhì)環(huán)區(qū)，該胞質(zhì)區(qū)里含有一些與底物結(jié)合與催化相關(guān)的殘基，這些殘基構(gòu)成了一個(gè)保守的D,D,D,Q/RXXRW(天冬氨酸，天冬氨酸，谷氨酰胺-X-X-精氨酸-色氨酸)結(jié)構(gòu)[3]。

目前的研究結(jié)果認(rèn)為，3種CESA蛋白形成一個(gè)有功能的CSC[7]。擬南芥中負(fù)責(zé)次生壁纖維素合成的CSC是由CESA4、CESA7和CESA8組成，負(fù)責(zé)初生壁纖維素合成的CSC由CESA1、CESA3和CESA6及其類似基因CESA2/CESA5/CESA9組成[5, 8-14]。雙分子熒光互補(bǔ)和酵母雙雜實(shí)驗(yàn)證實(shí)，CESA4可與自身互作，且CESA4、CESA7和CESA8之間可以相互作用[15]，而免疫共沉淀、雙分子熒光互補(bǔ)和酵母雙雜實(shí)驗(yàn)證明，初生壁CESA1、CESA3和CESA6自身以及相互之間可以相互作用[11, 16]。隨后，Pull-down實(shí)驗(yàn)證實(shí)所有次生壁纖維素合成相關(guān)CESA基因之間存在互作關(guān)系[13, 17]。

1 材料與方法

1.1 植物材料

1.2 生物信息學(xué)分析

從TAIR (http://www.arabidopsis.org/)和Phytozome (http://www.phytozome.net/poplar.php)網(wǎng)站獲取擬南芥和楊樹的CESA基因家族的序列信息。采用MEGA 5.0軟件中基于遺傳距離的鄰近結(jié)合法(Neighbor Joining，NJ)構(gòu)建進(jìn)化樹。根據(jù)擬南芥AtCESA鋅指結(jié)構(gòu)和跨膜結(jié)構(gòu)域信息(http://www.uniprot.org/)，手工繪制楊樹CESA鋅指結(jié)構(gòu)和跨膜結(jié)構(gòu)域位置圖。依據(jù)楊樹次生壁CESA基因的基因號(PtCESA4：Potri.002G257900；PtCESA7A：Potri.006G181900；PtCESA7B：Potri.018G103900；PtCESA8A：Potri.011G069600；PtCESA8B：Potri.004G059600)在已報(bào)道的楊樹幼嫩與成熟的莖、葉和根組織的RNA-seq數(shù)據(jù)[23]與剝皮再生過程再生組織表達(dá)量的基因芯片數(shù)據(jù)[24]中進(jìn)行檢索，獲得基因的表達(dá)數(shù)據(jù)。楊樹幼嫩與成熟的莖、葉和根組織的RNA-seq實(shí)驗(yàn)方法詳見Liu等的方法[23]，簡略而言，使用RNeasy Plant Mini 試劑盒和RNase-free DNase I試劑盒(Qiagen)提取楊樹幼嫩與成熟的莖、葉和根組織的總RNA，交由公司完成測序。剝皮再生過程再生組織表達(dá)量的基因芯片數(shù)據(jù)的實(shí)驗(yàn)方法詳見Tang等的方法[24]，簡略而言，取生長時(shí)間一致的毛白楊在同一時(shí)間進(jìn)行莖干的環(huán)剝，剝皮后第0、7、10、12、16、18和21 d用無菌刀片刮取樹干表面再生組織，利用Affymetrix系統(tǒng)平臺進(jìn)行基因芯片的雜交、洗染和掃描。

1.3 植株激素處理及qRT-PCR分析

分別用0.1 mol·L-1NAA，0.1 μmol·L-16-BA，10 μmol·L-1赤霉素(Gibberellin，GA3)，1 nmol·L-1油菜素內(nèi)酯(epibrassinolide，BR)和1 μmol·L-1乙烯(ethylene)，對組培培養(yǎng)4 w的84K植株進(jìn)行處理。處理方法為，選取生長狀態(tài)一致的84K組培苗，去除培養(yǎng)基，將根部置于上述濃度的激素溶液中，在處理0 h、3 h、6 h時(shí)取樣進(jìn)行次生壁CESA的表達(dá)量分析。取樣部位為組培苗的莖。所有的試劑購于Sigma-Aldrich。在qRT-PCR實(shí)驗(yàn)中，取激素處理后的84K莖段，使用RNeasy Plant Mini 試劑盒和RNase-free DNase I試劑盒(Qiagen)提取總RNA。每個(gè)樣品取2 μg RNA使用SuperScript III first-strand synthesis system(Invitrogen)合成cDNA第一鏈。定量PCR的引物使用Primer 3軟件設(shè)計(jì)，按照SYBR Premix Ex TaqTM II 試劑盒(TaKaRa)使用說明書準(zhǔn)備反應(yīng)混合液，實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)在7500 Fast Real-Time PCR System(Applied Biosystems)或Roche 480實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Roche)上進(jìn)行。PtACTIN作為內(nèi)參，一次qRT-PCR實(shí)驗(yàn)包含四次技術(shù)重復(fù)。所有實(shí)時(shí)定量實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)三次。實(shí)驗(yàn)所用qRT-PCR引物序列見表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.4 熒光素酶互補(bǔ)報(bào)告體系

熒光素酶互補(bǔ)報(bào)告體系所用載體由中科院遺傳所周奕華老師課題組惠贈(zèng)。按照文獻(xiàn)中操作步驟進(jìn)行熒光素酶互補(bǔ)報(bào)告實(shí)驗(yàn)[25]，簡言之，將克隆得到的次生壁PtCESA蛋白CDS序列通過酶切連接的方法分別構(gòu)建到包含熒光素酶蛋白N端序列的NLuc載體或C端序列的Cluc載體，構(gòu)建好的載體通過農(nóng)桿菌GV3101介導(dǎo)轉(zhuǎn)化本氏煙草葉片，培養(yǎng)3 d后，在葉片上涂布熒光素，利用IndiGO 軟件檢測熒光信號。

1.5 GUS染色分析

GUS的組織化學(xué)染色按照如下步驟進(jìn)行[23]：培養(yǎng)4 w的轉(zhuǎn)基因組培苗，在預(yù)冷的90%丙酮中固定約2 h。固定結(jié)束后，在冰上將組織材料使用GUS染色緩沖液(50 mmol·L-1sodium phosphate (pH7.0)，2 mmol·L-1potassium ferrocyanide，2 mmol·L-1potassium ferricyanide，10 mmol·L-1EDTA，0.2% Triton X-100 (v/v))洗滌3次，再轉(zhuǎn)移至GUS染色液(染色緩沖液添加20% (v/v) methanol和1 mM X-Gluc)，于37℃溫浴12 h后，使用70%乙醇脫色。對CESA4、CESA7B、CESA8A與CESA8B基因啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GUS轉(zhuǎn)基因材料，每一個(gè)轉(zhuǎn)基因材料至少選擇5個(gè)株系進(jìn)行GUS染色，每個(gè)轉(zhuǎn)基因材料的染色至少重復(fù)三次，以保證結(jié)果的可靠性。

2 結(jié)果與分析

2.1 楊樹次生壁CESA基因的進(jìn)化關(guān)系和蛋白結(jié)構(gòu)

楊樹5個(gè)次生壁CESA基因，包含1個(gè)CESA4基因，2個(gè)CESA7基因和2個(gè)CESA8基因，這些基因的序列與擬南芥次生壁CESA基因的序列相似性很高 (圖1A)。基因的蛋白結(jié)構(gòu)分析是研究基因功能的基礎(chǔ)。有報(bào)道表明鋅指結(jié)構(gòu)在CESA之間的互作中起重要的作用，跨膜結(jié)構(gòu)域是CESA形成三維結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)[3]。楊樹次生壁CESA的結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，楊樹和擬南芥次生壁CESA的鋅指結(jié)構(gòu)和跨膜結(jié)構(gòu)的位置高度保守 (圖1B)。楊樹5個(gè)次生壁CESA的N端均含有鋅指結(jié)構(gòu)，楊樹CESA4、CESA7A、CESA8A和CESA8B也與擬南芥的CESA4、CESA7和CESA8一樣，均含有8個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，而楊樹CESA7B的C端則缺少6個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域。

A 擬南芥和楊樹CESA基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹；B 擬南芥和楊樹CESA蛋白的結(jié)構(gòu)圖。圖中標(biāo)示了鋅指結(jié)構(gòu)和跨膜結(jié)構(gòu)域。A The phylogenetic tree of CesA genes from Arabidopsis and Populus; B Schematic representation of zinc finger and transmembrane domains AtCesAs and PtCesAs. Zinc finger domain and transmembrane domains was marked on the protein sequence.圖1 楊樹與擬南芥次生壁CESA基因的進(jìn)化關(guān)系與蛋白結(jié)構(gòu)分析Fig.1 The phylogenetic relationship and topology of CesA genes

2.2 楊樹次生壁CESA在不同組織及次生維管發(fā)育中的表達(dá)特征

基因表達(dá)分析研究有助于揭示基因的功能。為了獲得楊樹不同次生壁CESA基因的表達(dá)模式，檢測了它們在不同組織及次生維管再生過程中的基因表達(dá)情況。楊樹幼嫩與成熟的莖、葉和根組織的RNA-seq數(shù)據(jù)分析表明，楊樹次生壁CESA基因在幼嫩葉、幼嫩莖、成熟莖以及根組織中均有可觀的表達(dá)，但在成熟莖中表達(dá)量最高(圖2A)。值得注意的是，CESA8A在各個(gè)組織中的表達(dá)量均較其他幾個(gè)CESA基因低(圖2A)。隨后，通過對次生維管再生實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)中不同時(shí)期再生組織基因表達(dá)的基因芯片數(shù)據(jù)分析表明，楊樹次生壁CESA基因在剝皮12 d后的再生組織(木質(zhì)部分化階段)的表達(dá)量不斷提高，與它們參與木材形成過程中次生壁纖維素合成的功能相吻合(圖2B)。另外，在這一過程中，5個(gè)楊樹次生壁CESA基因的變化趨勢一致，變化幅度相差不大。相對而言，CESA8A在再生組織中的表達(dá)量較其他幾個(gè)CESA基因略低。

A 楊樹次生壁CESA基因在幼嫩葉(YL)、成熟葉(ML)、幼嫩莖(YS)、成熟莖(MS)和根(R)中的表達(dá)分析；B 楊樹次生壁CESA基因在剝皮后0(D00)、7(D07)、10(D10)、12(D12)、16(D16)、18(D18)和21(D21)d的再生組織中的表達(dá)分析。

A The expression of secondary wallPtCESAsin young leave (YL), mature leave (ML), young stem (YS), mature stem (MS) and root (R); B The expression of secondary wallPtCESAsin the regeneration tissue at 0 (D00), 7 (D07), 10 (D10), 12 (D12), 16 (D16), 18 (D18) and 21 days (D21) after debarking.

圖2 楊樹次生壁CESA基因在不同組織和次生維管再生過程中的表達(dá)模式

Fig.2 The expression of secondary wallPtCESAsin different tissues and in the regeneration of secondary vascular system

2.3 基于啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)GUS表達(dá)的轉(zhuǎn)基因楊樹中次生壁CESA的表達(dá)模式

為了檢測楊樹次生壁CESA基因的組織表達(dá)特異性，創(chuàng)制了次生壁CESA基因啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)GUS表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株。通過GUS染色分析發(fā)現(xiàn)，在PPtCESA4::GUS、PPtCESA7A::GUS、PPtCESA8A::GUS和PPtCESA7B::GUS轉(zhuǎn)基因植株的莖和葉中，均檢測到較強(qiáng)的GUS信號(圖3)。在莖段中，頂端節(jié)間的GUS信號明顯較基部節(jié)間的強(qiáng)。PPtCESA4::GUS、PPtCESA7A::GUS、PPtCESA8A::GUS和PPtCESA7B::GUS轉(zhuǎn)基因植株之間，在葉中的GUS信號存在一定的差異。PPtCESA8A::GUS和PPtCESA7B::GUS轉(zhuǎn)基因植株在整個(gè)葉片中均觀測到了GUS信號(圖3B和3C)，而PPtCESA4::GUS和PPtCESA7A::GUS轉(zhuǎn)基因植株在葉脈中則基本上未檢測到GUS信號(圖3A和3D)。

2.4 楊樹次生壁CESA對激素處理的響應(yīng)

許多研究表明，激素可誘導(dǎo)CESA基因的表達(dá)[25-26]。利用赤霉素GA3、萘乙酸NAA、油菜素內(nèi)酯BR、細(xì)胞分裂素6-BA和乙烯處理84K楊幼苗，檢測了莖中次生壁CESA對激素的響應(yīng)模式。結(jié)果顯示，GA3和6-BA使楊樹次生壁CESA的表達(dá)量上調(diào)，其中GA3的作用更顯著(圖4A和4D)。NAA、BR和乙烯處理下，楊樹次生壁CESA的表達(dá)量下調(diào)，其中BR的作用相對顯著(圖4)。就5個(gè)楊樹次生壁CESA基因的表達(dá)量變化對激素的響應(yīng)而言，PtCESA4的表達(dá)量變化最顯著，PtCESA7A較PtCESA7B的表達(dá)量變化顯著，PtCESA8B較PtCESA8A的表達(dá)量變化顯著。

2.5 楊樹次生壁CESA間的互作

遺傳學(xué)研究證實(shí)正常行使功能的CSC中含有3種CESA蛋白[27]。擬南芥中負(fù)責(zé)次生壁纖維素合成的CSC是由CESA4、CESA7和CESA8組成。在楊樹中有5個(gè)次生壁CESA，其中1個(gè)CESA4、2個(gè)CESA7和2個(gè)CESA8。為了確定楊樹中的2個(gè)CESA7和2個(gè)CESA8在與CESA4形成復(fù)合體的過程中究竟是幾率均等還是有所偏好，對它們之間的互作情況進(jìn)行了檢測。如圖5所示，在熒光素酶互補(bǔ)報(bào)告體系中，相對于對照，PtCESA7B和PtCESA8B，PtCESA8A和PtCESA7B，PtCESA8B和PtCESA7A的組合表現(xiàn)出強(qiáng)的熒光信號，表明上述次生壁CESA可以互作形成二聚體，因此，PtCESA7A和PtCESA7B、PtCESA8A和PtCESA8B可能具有相同的能力形成有功能的CSC。

A PPtCESA4::GUS轉(zhuǎn)基因楊樹；B PPagCESA7B::GUS轉(zhuǎn)基因楊樹；C PPagCESA8A::GUS轉(zhuǎn)基因楊樹；D PPagCESA7A::GUS轉(zhuǎn)基因楊樹。標(biāo)尺=1 cm。A PPagCESA4::GUS-expressing poplar plants; B PPagCESA7B::GUS-expressing poplar plants; C PPagCESA8A::GUS-expressing poplar plants; D PPagCESA7A::GUS-expressing poplar plants. Bar = 1 cm.圖3 楊樹次生壁CESA基因啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)GUS表達(dá)轉(zhuǎn)基因楊樹的GUS染色分析Fig.3 GUS staining assay of Populus secondary wall PtCESAgenepromoters

A 赤霉素GA3；B 生長素NAA；C 油菜素內(nèi)酯BR；D 細(xì)胞分裂素6-BA；E 乙烯利。A The expression of PtCESA4, 8A and 8B under GA3 treatment; B The expression of PtCESA4, 7B, 8A and 8B under NAA treatment; C The expression of PtCESA4, 7B, 8A and 8B under BR treatment; D The expression of PtCESA4, 7B, 8A and 8B under 6BA treatment; E The expression of PtCESA4, 7B, 8A and 8B under ethylene treatment.圖4 不同激素處理3 h、6 h后楊樹次生壁CESA基因的表達(dá)變化Fig.4 The response of secondary wall CESA genes to 3 h and 6 h hormone treatment

A 本氏煙草葉表面農(nóng)桿菌注射位置以及所轉(zhuǎn)化的組合示意圖。NLuc：熒光素酶N端，CLuc：熒光素酶C端；CESA X 與CESA Y 代表轉(zhuǎn)化組合中的兩個(gè)CESA; B CESA組合轉(zhuǎn)化后的熒光素酶熒光檢測。Luc：熒光素酶熒光信號；BF：明場；Merge：熒光信號與明場圖像的疊加。A. The general scheme showed the constructs and their infiltrated location used in the split-luciferase complementation assay. NLUC: the split N terminal of luciferase; CLUC: the split C terminal of luciferase; CESA X and CESA Y: two different secondary wall PtCESAs. B. The fluorescence signal detected after the transformation of different secondary wall PtCESA combination. Luc: the fluorescence signal; BF: bright field; Merge: the merged image of Luc and BF.圖5 熒光素酶互補(bǔ)試驗(yàn)分析楊樹次生壁CESA成員間的互作Fig.5 The split-luciferase complementation assay showed the imteraction between secondary wall PtCESAs.

3 討論

纖維素合成需要纖維素合酶不同成員形成復(fù)合體，正常行使功能的CSC需要3種CESA蛋白[28]。本論文研究了楊樹中5個(gè)次生壁纖維素合成相關(guān)的CESA基因的表達(dá)模式與互作模式，為揭示木本植物木材形成過程中5個(gè)次生壁CESA的作用提供了線索。研究結(jié)果表明，楊樹5個(gè)次生壁CESA基因在楊樹成熟莖中高表達(dá)，尤其在次生維管組織發(fā)育的后期高表達(dá)；CESA4、CESA7B、CESA8A和CESA8B的GUS信號在楊樹莖和葉中較強(qiáng)，但這些次生壁CESA的表達(dá)模式存在一定的差異；楊樹次生壁CESA的表達(dá)量被赤霉素和細(xì)胞分裂素上調(diào)，被生長素、油菜素內(nèi)酯和乙烯下調(diào)；楊樹次生壁CESA7B和CESA8B、CESA7B和CESA8A、CESA7A與CESA8B之間存在互作。這些數(shù)據(jù)提示楊樹5個(gè)次生壁CESA基因雖然都能夠參與形成CSC，但在不同組織、不同激素作用下可能有不同的組合方式。

參與次生壁纖維素合成的CSC需要由3種次生壁纖維素合成的CESA蛋白組成[15]。在擬南芥中，AtCESA4、AtCESA7與AtCESA8組成有功能的CSC，參與次生壁纖維素合成[13]。在水稻中，與AtCESA8、AtCESA4與AtCESA7同源的OsCESA4、OsCESA7與OsCESA9組成有功能的CSC，參與次生壁纖維素合成[29]。而在楊樹中，有5個(gè)參與次生壁纖維素合成的CESA，其中包括了1個(gè)CESA4、2個(gè)CESA7和2個(gè)CESA8，它們有多達(dá)4種組合方式形成CSC，以參與次生壁纖維素的合成。RAN-seq與基因芯片的分析表明，楊樹次生壁CESA基因在楊樹成熟莖以及次生維管發(fā)育的后期即木質(zhì)部形成時(shí)期表達(dá)量較高，提示它們在木材形成過程發(fā)揮重要作用。在這5個(gè)基因中，PtCESA8A的表達(dá)量略低，推測它被招募進(jìn)入木材形成過程的CSC的機(jī)會略低。揭示楊樹多個(gè)次生壁CESA以及多種次生壁纖維素合成CSC的存在，可為理解纖維素合成的質(zhì)與量控制提供基礎(chǔ)，進(jìn)而為木材材性的多樣性改良提供了潛在可能性。

基因結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，楊樹5個(gè)次生壁CESA基因N端都具有鋅指結(jié)構(gòu)，為它們的互作提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)[15]。隨后的熒光素酶互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了這一點(diǎn)。CESA通常含有8個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，2個(gè)位于N端，6個(gè)位于C端[3]。然而，PtCESA7B的C端缺少6個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，不同于其它CESA，這種特殊的結(jié)構(gòu)會否影響纖維素的合成目前尚不清楚。

楊樹次生壁CESA啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)GUS轉(zhuǎn)基因楊樹的GUS染色分析表明，這些基因的組織表達(dá)模式存在一定的差異。例如，PtCESA8A和PtCESA7B轉(zhuǎn)基因株系整個(gè)葉片中均檢測到了GUS信號，而PtCESA4和PtCESA7A轉(zhuǎn)基因株系葉脈中則基本上未檢測到GUS信號，此結(jié)果與Naoki等的研究結(jié)果一致[21]。這種差異提示在葉脈的發(fā)育中包含PtCESA7A的CSC作用應(yīng)該大于包含PtCESA7B的CSC。另外，Naoki等的研究結(jié)果顯示，PtCESA8B在木質(zhì)部中高表達(dá)，而PtCESA8A則在根冠高表達(dá)；PtCESA7B在葉、葉柄、根冠和幼莖中表達(dá)量比PtCESA7A高，而PtCESA7A和PtCESA7B的表達(dá)量在成熟莖木質(zhì)部中無明顯差異[21]。這種組織表達(dá)的差異暗示，可能由不同的CESA組合形成不同的CSC，以參與不同組織器官的發(fā)育。

楊樹次生壁CESA基因?qū)Σ煌に靥幚淼谋磉_(dá)和響應(yīng)存在較大差異。赤霉素GA3和細(xì)胞分裂素6-BA上調(diào)楊樹次生壁CESA的表達(dá)，而NAA，BR和乙烯下調(diào)楊樹次生壁CESA的表達(dá)。其中，PtCESA4基因的表達(dá)量變化最顯著，PtCESA7A較PtCESA7B基因的表達(dá)量變化顯著，PtCESA8B又較PtCESA8A基因的表達(dá)量變化顯著。這一結(jié)果提示，由PtCESA4、PtCESA7A和PtCESA8B組成的CSC，在激素處理的響應(yīng)中可能貢獻(xiàn)更大。

熒光素酶互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PtCESA7A、PtCESA7B、PtCESA8A和PtCESA8B之間可以相互作用。擬南芥次生壁CESA成員之間可以兩兩互作，形成二聚體，這種互作是其形成CSC的基礎(chǔ)[15]。因此，PtCESA7A與PtCESA7B、PtCESA8A與PtCESA8B具有同等的幾率形成有功能的CSC。然而，PtCESA7A與PtCESA7B、PtCESA8A與PtCESA8B在組織表達(dá)、激素響應(yīng)上存在一定的差異，這些差異可能使得在不同組織、不同激素作用下，次生壁CSC招募不同的CESA成員參與次生壁纖維素的合成。CSC的多樣性可以多方面影響細(xì)胞壁中的纖維素含量，從而導(dǎo)致木材材性差異。

4 結(jié)論

楊樹5種次生壁CESA基因具有同等的能力形成功能性的纖維素合酶復(fù)合體，但在不同組織、不同激素作用下可能有不同的組合方式。

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(責(zé)任編輯：張 研)

Interaction and Expression of Secondary WallCESAsinPopulus

WEIKai-li1,ZHOUHou-jun1,JIANGCheng1,ZHAOYan-qiu1,SONGXue-qin1,2,LUMeng-zhu1,2

(1.Key Laboratory of Tree Breeding and Cultivation of State Forestry Administration, Research Institute of Forestry, Chinese Academy of Forestry, Beijing 100091, China; 2.Co-Innovation Center for Sustainable Forestry in Southern China, Nanjing Forestry University, Nanjing 210037, China)

[Objective]Cellulose synthesis is important for the wood formation of woody plant.CESAsplay important roles in the cellulose synthesis.Since that three kind of CESAs constitute a functional cellulose synthesis complex and five secondary wall CESAs existed in the poplar genome, we examined the expression pattern and interaction of theseCESAsinPopulustoreveal the work model of them in secondary wall cellulose synthesis.[Method]RNA-seq and microarray data analysis were used to examine the expression profile of the five secondary wallCESAsin root, stem and leaf, and in the regeneration of secondary vascular bundle, respectively. Promotor driving GUS expression assay and qRT-PCR were carried out to reveal the tissue expression pattern and hormone response of the five secondary wallCESAs. Firefly luciferase complementation assay was used to check the interaction between CESA7A, CESA7B, CESA8A and CESA8B.[Result]Expression analysis showed that all the five secondary wallCESAsexhibited high expression in the mature stem and preferred to express in the later stage of stem development, suggesting that they involved in the secondary wall synthesis during wood formation. Promotor driving GUS expression assay ofCESA4,CESA7B,CESA8AandCESA8Bdemonstrated high expression of these secondary wallCESAsin stem and leaf, and some differences, however, were existed in the detail expression pattern, especially in leaf veins. In addition, the expression of secondary wallCESAswere upregulated during GA3and 6-BA treatment, while down-regulated during NAA, BR and ethylene treatment. The expression variation of theseCESAsin response to different hormones were different. Firefly luciferase complementation assayshowed that CESA7A and CESA7B could interact with CESA8A and CESA8B, indicating that they parallelly determine the final secondary wall cellulose synthesis complex.[Conclusion]The five secondary wallCESAsshowed different expression from one another in different tissue and under different hormone treatment. However, these CESAs could interact with each other.Thesedata suggest that poplar secondary wall CESAs could form the cellulose synthesis complex in equal possibility, but the complex might be varied in different tissues and in response to different hormones, which might have an effect on the wood chemical composition.

CESA; Secondary cell wall; Expression analysis; Interaction; Hormone;Populus

2016-04-28 基金項(xiàng)目： 國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃(“973”計(jì)劃)形成層干細(xì)胞維持、分化以及次生木質(zhì)部發(fā)育的調(diào)控機(jī)制(2012CB114503)。 作者簡介： 魏凱莉，碩士在讀。主要研究方向：林木遺傳育種。E-mail : wkl19911228@163.com * 通訊作者：宋學(xué)勤，博士。主要研究方向：林木遺傳育種。E-mail : xqsong@caf.ac.cn

10.13275/j.cnki.lykxyj.2017.02.009

S792.11

A

1001-1498(2017)02-0245-09